Altamente sensible y rápido de detección de fluorescencia con un analizador portátil de FRET

Resumen

Este protocolo describe la cuantificación rápida y altamente sensible de Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) datos de sensor utilizando un analizador de FRET portátil a medida. El dispositivo se utilizó para detectar la maltosa dentro de un rango de temperatura crítico que maximiza la sensibilidad de detección, lo que permite la evaluación práctica y eficiente de contenido de azúcar.

Resumen

Las recientes mejoras en la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) sensores han permitido su uso para detectar varias moléculas pequeñas, incluyendo iones y aminoácidos. Sin embargo, la intensidad de señal débil innata de sensores FRET es un reto importante que impide su aplicación en diversos campos y hace que el uso de los caros, de alta gama fluorómetros necesario. Anteriormente, hemos construido un analizador de FRET de alto rendimiento rentable que puede medir específicamente la relación de dos bandas de longitud de onda de emisión (530 y 480 nm) para lograr una alta sensibilidad de detección. Más recientemente, se descubrió que los sensores FRET con las proteínas de unión periplásmicas bacterianas detectar ligandos con una sensibilidad máxima en el rango de temperatura crítica de 50 - 55 ° C. Este informe describe un protocolo para evaluar el contenido de azúcar en muestras de bebidas disponibles en el mercado utilizando nuestro analizador de FRET portátil con un sensor FRET-temperatura específica. Nuestros resultados mostraron que el precalentamiento adicionalproceso del sensor FRET aumenta significativamente la señal de relación de FRET, para permitir la medición más precisa de contenido de azúcar. El analizador y el sensor FRET medida se han aplicado con éxito para cuantificar el contenido de azúcar en tres tipos de bebidas comerciales. Anticipamos que mejora aún más la reducción del tamaño y el rendimiento de los equipos va a facilitar el uso de analizadores portátiles en entornos en los equipos de gama alta no está disponible.

Introducción

Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) se ha utilizado ampliamente como un sensor biométrico para detectar moléculas pequeñas tales como azúcares, iones de calcio, y los aminoácidos ^1-4. biosensores FRET contienen proteínas fluorescentes, proteínas fluorescentes cian (CFP), y proteínas fluorescentes amarillas (YFPs), que están condensados ​​a ambos extremos de proteínas de unión periplásmicas (PBP). Los azúcares se unen a las PBP ubicadas en el medio del sensor FRET, causando cambios estructurales en el sensor que posteriormente altera la orientación y distancia de transición de dipolo de las dos proteínas fluorescentes en cada extremo de la PBP. Este cambio permite el análisis cuantitativo de contenido de azúcar mediante la medición de la relación de las longitudes de onda de emisión de EYFP (530 nm) y ECFP (480 nm). Debido a la alta sensibilidad, la especificidad, la capacidad de monitorización en tiempo real, y rápido tiempo de respuesta de los biosensores FRET, estos sensores son ampliamente utilizados en aplicaciones medioambientales, industriales, médicas y ^5. Por otra parte, ratiommedición etric utilizando biosensores FRET tiene importantes beneficios prácticos, ya que puede ser usado para medir componentes en muestras biológicas complejas en las que la concentración de sensor no se puede controlar fácilmente y la fluorescencia de fondo está siempre presente.

A pesar de estas ventajas de los sensores basados ​​en FRET para la visualización cuantitativa, los pequeños cambios estructurales con dominio incompleto de movimiento de transferencia de las proteínas fluorescentes producen una intensidad de señal inherentemente débil. Esta señal débil limita la aplicación de sensores basados en FRET para el análisis in vitro o in vivo en ^6. En consecuencia, la mayoría FRET biosensores requieren el uso de equipos costosos y altamente sensible. Anteriormente, hemos desarrollado un analizador de FRET barato y portátil con capacidades similares a las de los analizadores de fluorescencia existentes ^7. En este dispositivo, de bajo costo, de 405 nm banda ultravioleta diodo emisor de luz (LED) se utilizó como fuente de luz para provocar la excitación de THseñal de fluorescencia e, en sustitución de una lámpara o láser caro. El sistema de detección del analizador se centra de manera eficiente la señal de fluorescencia de disipación en dos fotodetectores con un fotodiodo de silicio. En un estudio más reciente, se demostró que la optimización de la detección de la temperatura a 50 - 55 ° C podría ampliar significativamente la señal de FRET radiométrica ^8. Esta mejora de la señal-temperatura específica, junto con el analizador de FRET a medida, permite el uso de sensores FRET en aplicaciones de diagnóstico más generales con la rápida y alta sensibilidad.

En este protocolo, hemos demostrado la aplicabilidad general del analizador de FRET en condiciones óptimas de temperatura FRET mediante la cuantificación del contenido de azúcar de las bebidas disponibles en el mercado. Este protocolo proporciona los detalles de la operación del dispositivo FRET, así como una breve descripción de sensor y preparación de la muestra. Anticipamos que este informe promueva la aplicación potencial de la portátilanalizador en entornos de laboratorio a pequeña escala y proporcionar una base para el desarrollo de un dispositivo de diagnóstico de bajo costo en el lugar con biosensores basados ​​en FRET.

Protocolo

1. Preparación de biosensor

1. Construir el plásmido pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6, siguiendo el protocolo establecido ^{previamente-2.}
2. Inocular 5 ml de caldo de Luria (LB) con una única colonia de una cepa de Escherichia coli DE3 y se incuba a 37 ° C durante 16 horas con agitación.
3. Transferencia de 1 ml de la cultura O / N en un matraz de 500 ml que contiene 100 ml de LB y se incuba a 37 ° C en una incubadora con agitación hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ alcanza 0,5 (aproximadamente 3 horas).
4. Recoger las células en un tubo cónico de 50 ml mediante centrifugación a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C.
5. Resuspender el precipitado rápidamente en cada tubo con agua 50 ml de hielo-fría destilada (DW) y se centrifuga a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C.
6. Resuspender el precipitado en 50 l de DW enfriado en hielo con 10% (v / v) de glicerol girando suavemente hasta que la solución (células electrocompetentes) alcanza una DO ₆₀₀ de 100.
7. Colocar la mezcla de células electrocompetentes (50 l de las células a una DO ₆₀₀ de 100) y 10 ng del plásmido pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 en una cubeta de electroporación enfriada con hielo en un dispositivo de electroporación y electroporar la mezcla (18 kV / cm, 25 mF).
8. Rápidamente añadir medio SOC 1 ml a la cubeta y volver a suspender las células suavemente, seguido de la recuperación a 37 ° C durante 1 hora con agitación suave en un tubo de 15 ml de fondo redondo.
9. Difundir las células en una placa de LB que contiene 100 mg / ml de ampicilina y se incuba a 37 ° C durante 12 horas.
10. Aislar una sola colonia utilizando un bucle e inocular la colonia en 10 ml de LB que contiene 100 mg de ampicilina / ml a 37 ° C en un agitador durante 12 hr.
11. Añadir 5 ml del cultivo de siembra a 500 ml de LB que contienen 100 mg / ml de ampicilina y se incuba el cultivo en una incubadora de agitación 37 ° C.
12. Añadir 0,5 mM isopropílico β-D-tiogalactósido (IPTG) cuando la OD ₆₀₀ alcances0,5 y se incuba el cultivo en un incubador con agitación 37 ° C durante 24 horas.
13. Centrifugar las células a 4500 × g durante 20 min (4 ° C) y eliminar cuidadosamente el sobrenadante.
14. Resuspender el precipitado en tampón 5 ml de unión (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, PMSF 1 mM, EDTA 0,5 mM, y DTT 1 mM).
15. Sonicar las células en hielo con seis ráfagas de 10 segundos a 200-300 W, después de cada ráfaga con 10 segundos de enfriamiento.
16. Se centrifuga el lisado a 10.000 × g durante 30 min a 4 ° C para sedimentar los restos celulares. Transferir el sobrenadante (proteínas solubles) en un nuevo tubo de recogida.
17. Para lograr la purificación por afinidad de las proteínas de sensores FRET, la carga 4 ml del lisado celular aclarado sobre una columna de afinidad Ni-NTA (volumen 5 ml) y llevar a cabo un ensayo de cromatografía usando cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) ^18.
18. Lavar la columna una vez con cinco volúmenes de columna de tampón de lavado I (tampón fosfato 50 mM, cloruro de sodio 300 mM, imidazol 10 mM, pH 7,0).
19. Repetir la etapa de lavado con cinco volúmenes de columna de tampón de lavado II (tampón fosfato 50 mM, cloruro de sodio 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,0).
20. Eluir la proteína sensor con cinco volúmenes de columna de tampón de elución (tampón fosfato 50 mM, cloruro de sodio 300 mM, imidazol 500 mM, pH 7,0).
21. Para concentrar y desalar la muestra eluida, llenar concentrador (tamaño de la membrana de 10.000 MW) con hasta 20 ml de la muestra y se centrifuga durante 10 min a 3.000 x g. Vuelva a llenar concentrador con solución salina tamponada con fosfato 0,8% (PBS). Repita este paso dos veces, primero llenar el concentrador con 20 ml de muestra, y luego volver a llenar con PBS.
22. Recuperar el sensor de proteína concentrada y salada de-y almacenarla a -80 ° C.

2. Medición del contenido de azúcar utilizando el Analizador de FRET

NOTA: Los detalles de la construcción analizador de FRET se describe en nuestros trabajos anteriores ^7.

1. Preparar una solución de detección de 0,8% de PBS que contenía 0,2M de las proteínas de los sensores.
2. Encienda el analizador de FRET. Presione el botón "UP" durante 2 segundos para calibrar la temperatura óptima. Ajuste la temperatura a 53 ° C usando los botones "UP" y "DOWN" y presione el botón "SET".
3. Para la calibración, pulse y mantenga pulsado el botón "DOWN", "arriba" y simultáneamente durante 2 seg. Confirmar que el panel de pantallas LED "CALIB" y presione el botón "SET".
4. Coloque un 12,5 × 12,5 × 45 que contiene solamente tampón PBS en un soporte de la cubeta del analizador y presione el botón "SET" mm (longitud x anchura x altura) recipiente de paralelepípedo rectangular (cubeta).
5. Vuelva a colocar la cubeta con una solución que contiene sólo la detección (ver 2.1) y sin azúcar (maltosa / sacarosa) y pulse el botón "SET" para calibrar la línea de base.
6. Vuelva a colocar la cubeta con una solución que contiene el azúcar de detección con 10 mM y pulse la tecla "SET"botón.
7. Para determinar el contenido de azúcar de una muestra de la bebida, se puso 1 ml de la muestra de bebida en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 16.000 xg durante 1 min.
   NOTA: la medición de fluorescencia basada en sensores FRET tiene la ventaja de no requerir un tratamiento previo especial de la muestra debido a que sólo 1% (v / v) de la muestra se incluye en el volumen total. Sin embargo, se recomienda eliminar cualquier material que pueda afectar a la medición de fluorescencia (por ejemplo, células, partículas insolubles, lípidos, grasas o cualquier material con autofluorescencia). Además, si un ácido fuerte, base fuerte, agente de limpieza (detergente), o un agente emulsionante (emulsionante) está presente en una alta concentración y puede afectar a las propiedades del sensor biológico FRET, se debe eliminar el uso de un disolvente orgánico o una neutralizador. Por ejemplo, cuando la grasa láctea y emulsionantes se eliminan de aperitivos congeladas, las muestras se centrifugaron en un tubo de microcentrífuga a 16.000 xg durante 30 min, y el líquido between el sedimento del fondo y la capa superior de grasa láctea se extrae. A continuación se añade una cantidad igual de hexano, seguido de centrifugación a 15.000 × g durante 30 min para eliminar los lípidos.
8. Eliminar el sobrenadante con una jeringuilla de 1 ml y filtrar a través de un filtro de jeringa (tamaño de poro 0,2 micras).
9. Colocar 0,1 ml de muestra filtrada bebida en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 0,9 ml de PBS y agitar suavemente.
   NOTA: Es fundamental para diluir la muestra de bebidas correctamente. En este caso, la dilución 1.000 veces se llevó a cabo de manera que la concentración de azúcar caería dentro del rango dinámico del dispositivo. Recomendamos la estimación de la concentración de azúcar de destino de antemano, haciendo referencia al contenido de azúcar en la etiqueta de la bebida.
10. Añadir 5 l de la muestra de bebida diluido (1%, v / v) a una cubeta que contiene 0,495 ml de la solución de detección.
11. Colocar la cubeta en un soporte de la cubeta del analizador de FRET y precalentar la solución de la muestra a 53 ° C.
12. Presione el botón "SET" para medir el contenido de azúcar.
    Nota Es posible evaluar la medición de FRET usando un lector de placas multietiqueta o un espectrofotómetro de fluorescencia equipado con un dispositivo Peltier para control de temperatura mediante la lectura de la relación a 488/535 nm ^7,8. Para la detección de sacarosa, siga los pasos de 1.1 a 2.12 un sensor CSY-LH ^2.

Resultados

Para llevar a cabo el análisis cuantitativo de contenido de azúcar utilizando el analizador de FRET, es necesario construir una curva ajustada la estimación de la concentración de azúcar blanco a partir de la relación de FRET observada. Sea r definir la relación de la intensidad de emisión de CFP en 480 nm y la intensidad de emisión de YFP genera en 530 nm (Ec. 1).

Discusión

Este protocolo permite la cuantificación rápida y eficiente del contenido de azúcar en las muestras de bebidas, utilizando un analizador de FRET a medida ⁷ a una temperatura óptima para sensores FRET. El analizador se ha diseñado con un LED ultravioleta de bajo costo banda de 405 nm recientemente desarrollado como fuente de luz y dos fotodetectores con un fotodiodo de silicio. Este dispositivo es más rentable que otros fluorómetros comparables. El dispositivo mostró alta sensibilidad de detección, es...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB	BD	#244620
isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma	I6758
Ampicillin	Sigma	A9518
Tri-HCl	Bioneer	C-9006-1
PMSF	Sigma	78830
EDTA	Bioneer	C-9007
DTT	Sigma	D0632
NaCl	Junsei	19015-0350
phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4
SOC			2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose
Resource Q	Amersham Biosciences	17-1177-01	6 × 30 mm anion-exchange chromatography column
HisTrap HP1	Amersham Biosciences	29-0510-21
Quartz cuvette	Sigma	Z802875
AKÄKTAFPLC	Amersham Biosciences	18-1900-26	a fast protein liquid chromatography (FPLC)
Cary Eclipse	VarianInc		a fluorescence spectrophotometer
VICTOR	PerkinElmer	2030-0050	a multilabel plate reader
E. coli JM109 (DE3)	Promega		Electrocompetent cells
A (Beverage)	Korea Yakult Co. (Korea)	Birak	Fermented drinks
B (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Epro	Soft drink
C (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Getoray	Sports drink