Altamente sensibile e rapido fluorescenza Detection con un portatile FRET Analyzer

Riepilogo

Questo protocollo descrive la quantificazione rapida e altamente sensibile di Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) i dati dei sensori utilizzando un analizzatore portatile FRET su misura. Il dispositivo è stato utilizzato per rilevare maltosio in un intervallo di temperatura critica che massimizza sensibilità di rilevamento, consentendo valutazione pratica ed efficiente del contenuto di zucchero.

Abstract

Recenti miglioramenti nella Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) sensori hanno consentito il loro uso per rilevare varie piccole molecole tra ioni e aminoacidi. Tuttavia, l'intensità innata debole segnale di sensori FRET è una sfida importante che impedisce loro applicazione in vari campi e rende l'uso di costosi, di fascia alta Fluorimetro necessario. In precedenza, abbiamo costruito un analizzatore FRET ad alte prestazioni conveniente che possono specificatamente misurare il rapporto di due bande di lunghezza d'onda di emissione (530 e 480 nm) per ottenere un'elevata sensibilità di rilevamento. Più recentemente, si è scoperto che i sensori FRET con periplasmatiche batterica proteine ​​leganti rilevano ligandi con la massima sensibilità nel range di temperatura critica di 50 - 55 ° C. Questo rapporto descrive un protocollo per la valutazione zucchero contenuto nei campioni di bevande disponibili in commercio utilizzando il nostro analizzatore FRET portatile con un sensore FRET specifica temperatura. I nostri risultati hanno dimostrato che la scaldaprocesso del sensore FRET aumenta significativamente il segnale di rapporto FRET, per consentire la misura più accurata del contenuto di zucchero. L'analizzatore e sensore FRET su misura sono state applicate con successo per quantificare il contenuto di zucchero in tre tipi di bevande commerciali. Prevediamo che un'ulteriore riduzione dimensioni e prestazioni valorizzazione delle apparecchiature faciliterà l'utilizzo di analizzatori portatili in ambienti in cui le apparecchiature high-end non è disponibile.

Introduzione

Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) è stato ampiamente utilizzato come un sensore biometrico per rilevare piccole molecole quali zuccheri, ioni calcio e aminoacidi ^1-4. biosensori FRET contengono proteine ​​fluorescenti, proteine ​​fluorescenti ciano (CFP), e le proteine ​​fluorescenti gialli (YFPs), che si fondono ad entrambe le estremità delle proteine ​​periplasmatiche-binding (PBP). Zuccheri legano ai PBP situati al centro del sensore FRET, provocando cambiamenti strutturali al sensore che successivamente alterare l'orientamento distanza e la transizione dipolo delle due proteine ​​fluorescenti alle estremità del PBP. Questa modifica permette analisi quantitativa del contenuto di zucchero misurando il rapporto tra le lunghezze d'onda di emissione di EYFP (530 nm) e ECFP (480 nm). A causa della elevata sensibilità, specificità, capacità di monitoraggio in tempo reale, e il tempo di risposta di biosensori FRET, questi sensori sono ampiamente utilizzati in applicazioni ambientali, industriali e medicali ^5. Inoltre, RaziomMisurazione etrica usando biosensori FRET ha importanti vantaggi pratici, in quanto può essere utilizzato per misurare componenti in campioni biologici complessi dove la concentrazione sensore non può essere facilmente controllata e fluorescenza di fondo è sempre presente.

Nonostante questi vantaggi dei sensori FRET-based per la visualizzazione quantitativa, piccoli cambiamenti strutturali con dominio incompleto movimento trasferimento alle proteine ​​fluorescenti producono intensità del segnale intrinsecamente debole. Questo segnale debole limita l'applicazione di sensori FRET-based per in vitro o in vivo analisi ^6. Di conseguenza, la maggior parte FRET biosensori richiedono l'uso di apparecchiature costose e altamente sensibile. In precedenza, abbiamo sviluppato un analizzatore FRET poco costoso e portatile con caratteristiche simili a quelle degli analizzatori fluorescenza esistenti ^7. In questo dispositivo, economico 405 nm banda ultravioletta diodi emettitori di luce (LED) è stato utilizzato come sorgente di luce per provocare l'eccitazione del thsegnale di fluorescenza e, sostituendo una lampada costosa o laser. Il sistema di rilevamento dell'analizzatore concentra efficacemente il segnale di fluorescenza dissipazione su due fotorivelatori con un fotodiodo al silicio. In uno studio più recente, abbiamo dimostrato che l'ottimizzazione della temperatura di rilevamento a 50 - 55 ° C potrebbe amplificare in modo significativo il segnale raziometrico FRET ^8. Questo miglioramento segnale specifico temperatura, insieme con l'analizzatore FRET misura, consente l'utilizzo di sensori FRET in applicazioni diagnostiche più generali con sensibilità rapida ed elevata.

In questo protocollo, abbiamo dimostrato l'applicabilità generale dell'analizzatore FRET in condizioni ottimali di temperatura FRET quantificando il contenuto di zucchero delle bevande disponibili in commercio. Questo protocollo fornisce i dettagli del funzionamento del dispositivo FRET, nonché una breve descrizione del sensore e preparazione del campione. Prevediamo che questa relazione promuoverà la potenziale applicazione del portatileAnalizzatore in ambienti di laboratorio su piccola scala e fornire una base per un ulteriore sviluppo di un dispositivo economico in loco diagnostica con biosensori FRET-based.

Protocollo

1. Preparazione del biosensore

1. Costruire il plasmide pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 seguendo il protocollo precedentemente stabilito ^2.
2. Seminare 5 ml di Luria Broth (LB) con una singola colonia di un ceppo di Escherichia coli DE3 e incubare a 37 ° C per 16 ore con agitazione.
3. Trasferire 1 ml della / culture O N in un pallone da 500 ml contenente 100 ml LB ed incubare a 37 ° C in un incubatore agitando fino alla densità ottica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ raggiunge 0,5 (circa 3 ore).
4. Raccogliere le cellule in una provetta conica da 50 ml per centrifugazione a 1000 g per 20 minuti a 4 ° C.
5. Risospendere il pellet rapidamente in ogni provetta con acqua 50 ml ghiacciata distillata (DW) e centrifugare a 1000 g per 20 minuti a 4 ° C.
6. Risospendere il pellet in 50 ml di DW ghiacciata con 10% (v / v) glicerolo agitando delicatamente fino a quando la soluzione (cellule electrocompetent) raggiunge un OD ₆₀₀ di 100.
7. Posizionare la miscela di cellule electrocompetent (50 ml di cellule ad una OD ₆₀₀ 100) e 10 ng del plasmide pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 in elettroporazione cuvetta ghiacciata in un dispositivo elettroporazione e l'elettroporazione la miscela (18 kV / cm, 25 uF).
8. Aggiungere rapidamente medio SOC 1 ml alla cuvetta e risospendere le cellule delicatamente, seguita da un recupero a 37 ° C per 1 ora agitando delicatamente in un tubo da 15 ml a fondo rotondo.
9. Distribuire le cellule su una piastra di LB contenente 100 ug / ml di ampicillina e incubare a 37 ° C per 12 ore.
10. Isolare una singola colonia utilizzando un ciclo e inoculare la colonia in 10 ml di LB contenente 100 ug / ml di ampicillina a 37 ° C in un agitatore per 12 ore.
11. Aggiungere 5 ml della cultura seme a 500 ml di LB contenenti 100 mg / ml di ampicillina e incubare la cultura in un incubatore agitazione a 37 ° C.
12. Aggiungere 0,5 mm isopropilico β-D-tiogalattoside (IPTG) quando la raggiunge OD ₆₀₀0,5 e incubare la cultura in un incubatore agitazione a 37 ° C per 24 ore.
13. Centrifugare le cellule a 4.500 × g per 20 minuti (4 ° C) e rimuovere delicatamente il surnatante.
14. Risospendere il pellet in 5 ml di tampone di legame (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM PMSF, 0,5 mM EDTA, e 1 mM DTT).
15. Sonicare le cellule su ghiaccio con sei raffiche di 10 sec a 200-300 W, dopo ogni raffica con 10 secondi di raffreddamento.
16. Centrifugare il lisato a 10.000 × g per 30 min a 4 ° C per sedimentare i detriti cellulari. Trasferire il surnatante (proteina solubile) in un nuovo tubo di raccolta.
17. Per raggiungere affinità purificazione delle proteine sensore FRET, carico di 4 ml di lisato cellulare eliminato su una colonna di affinità Ni-NTA (volume 5 ml) ed eseguire un test cromatografia utilizzando proteine veloce cromatografia liquida (FPLC) ^18.
18. Lavare la colonna una volta con cinque volumi di colonna di tampone di lavaggio I (50 mM tampone fosfato, 300 mM cloruro di sodio, 10 mM imidazolo, pH 7,0).
19. Ripetere la fase di lavaggio con cinque volumi di colonna di tampone di lavaggio II (50 mM tampone fosfato, 300 mM cloruro di sodio, 20 mM imidazolo, pH 7,0).
20. Eluire la proteina sensore con cinque volumi colonna di tampone di eluizione (50 mM tampone fosfato, 300 mM cloruro di sodio, 500 mM imidazolo, pH 7,0).
21. Di concentrare e desalificare il campione eluito, riempire concentratore (dimensione membrana di 10.000 MW), con un massimo di 20 ml di campione e centrifugare per 10 minuti a 3000 × g. Riempire concentratore con soluzione salina 0,8% tampone fosfato (PBS). Ripetere questa operazione due volte, prima di riempire il concentratore con 20 ml di campione, e quindi il riempimento con PBS.
22. Recuperare la proteina sensore concentrato e de-salato e conservarlo a -80 ° C.

2. misurazione del glucosio contenuti utilizzando il FRET Analyzer

NOTA: I dettagli della costruzione analizzatore FRET sono stati descritto nel nostro precedente lavoro ^7.

1. Preparare una soluzione di rilevazione dello 0,8% PBS contenente 0,2pM delle proteine ​​sensore.
2. Accendere l'analizzatore FRET. Premere il tasto "UP" per 2 secondi per calibrare la temperatura ottimale. Impostare la temperatura a 53 ° C utilizzando i tasti "UP" e "DOWN" e premere il pulsante "SET".
3. Per la calibrazione, premere e tenere premuto i tasti "DOWN" "UP" e contemporaneamente per 2 sec. Verificare che il display a schermo LED "CALIB" e premere il tasto "SET".
4. Posizionare un 12,5 × 12,5 × 45 mm (lunghezza x larghezza x altezza) recipiente parallelepipedo rettangolare (provetta) contenenti solo PBS tampone in un portacuvette dell'analizzatore e premere il tasto "SET".
5. Sostituire la provetta con una contenente solo la soluzione di rilevamento (vedere 2.1) senza zucchero (maltosio / saccarosio) e premere il pulsante "SET" per calibrare la linea di base.
6. Sostituire la provetta con uno contenente la soluzione di rilevamento con 10 mM zucchero e premere il tasto "SET"pulsante.
7. Per determinare il contenuto di zucchero di un campione bevanda, mettere 1 campione ml bevanda in una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 16.000 g per 1 min.
   NOTA: misura basato sulla fluorescenza sensore FRET ha il vantaggio di non richiedere speciali pretrattamento del campione perché solo 1% (v / v) del campione è incluso nel volume totale. Tuttavia, si consiglia di rimuovere qualsiasi materiale che possa influenzare la misurazione della fluorescenza (ad esempio, le cellule, particelle insolubili, lipidi, grasso, o qualsiasi materiale con autofluorescenza). Inoltre, se un acido forte, base forte, detergente (detergente), o un agente emulsionante (emulsionante) è presente ad una concentrazione elevata e può influenzare le proprietà del sensore biologico FRET, dovrebbe essere rimosso utilizzando un solvente organico o un neutralizzatore. Ad esempio, quando il grasso latticini e emulsionanti vengono eliminati dal snack surgelati, i campioni vengono centrifugati in una provetta per microcentrifuga a 16.000 g per 30 min, e il liquido between il sedimento di fondo e lo strato superiore di materia grassa viene estratto. Una quantità uguale di esano viene quindi aggiunto, seguito da centrifugazione a 15.000 xg per 30 minuti per eliminare i lipidi.
8. Rimuovere il surnatante con una siringa da 1 ml e filtrata attraverso un filtro a siringa (dimensione dei pori 0,2 micron).
9. Mettere 0,1 ml filtrati campione bevanda in una provetta da 1,5 ml contenente 0,9 ml di PBS e agitare delicatamente.
   NOTA: E 'fondamentale per diluire il campione bevanda correttamente. In questo caso, la diluizione di 1000 volte è stata eseguita in modo che la concentrazione di zucchero rientrerebbe nella gamma dinamica del dispositivo. Si consiglia di stimare la concentrazione di zucchero bersaglio in anticipo facendo riferimento al tenore di zucchero nell'etichetta della bevanda.
10. Aggiungere 5 microlitri del campione bevande diluito (1%, v / v) ad una cuvetta contenente 0,495 ml della soluzione di rilevamento.
11. Posizionare la cuvetta in un supporto cuvetta dell'analizzatore FRET e preriscaldare la soluzione campione a 53 ° C.
12. Premere il tasto "SET" per misurare il contenuto di zucchero.
    Nota È possibile valutare la misura FRET utilizzando un lettore di piastre MULTILABEL o uno spettrofotometro a fluorescenza dotato di un dispositivo di Peltier per il controllo della temperatura leggendo il rapporto a 488/535 nm ^7,8. Per il rilevamento di saccarosio, seguire i passaggi da 1,1-2,12 con un sensore CSY-LH ^2.

Risultati

Per eseguire l'analisi quantitativa del contenuto di zucchero usando l'analizzatore FRET, è necessario costruire una curva adattata stimare la concentrazione di zucchero destinazione dal rapporto FRET osservato. Sia r definisce il rapporto tra l'intensità di emissione di PCP a 480 nm e l'intensità di emissione di YFP generato a 530 nm (Eq. 1).

Discussione

Questo protocollo permette quantificazione rapida ed efficiente del tenore di zucchero nei campioni bevande, utilizzando un analizzatore di FRET misura ⁷ ad una temperatura ottimale per sensori FRET. L'analizzatore è stato progettato con un recentemente sviluppato, poco costoso banda 405-nm ultravioletta-LED come fonte di luce e due fotorivelatori con un fotodiodo al silicio. Questo dispositivo è più conveniente rispetto ad altri Fluorimetro comparabili. Il dispositivo ha mostrato alta sensibilità di ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB	BD	#244620
isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma	I6758
Ampicillin	Sigma	A9518
Tri-HCl	Bioneer	C-9006-1
PMSF	Sigma	78830
EDTA	Bioneer	C-9007
DTT	Sigma	D0632
NaCl	Junsei	19015-0350
phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4
SOC			2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose
Resource Q	Amersham Biosciences	17-1177-01	6 × 30 mm anion-exchange chromatography column
HisTrap HP1	Amersham Biosciences	29-0510-21
Quartz cuvette	Sigma	Z802875
AKÄKTAFPLC	Amersham Biosciences	18-1900-26	a fast protein liquid chromatography (FPLC)
Cary Eclipse	VarianInc		a fluorescence spectrophotometer
VICTOR	PerkinElmer	2030-0050	a multilabel plate reader
E. coli JM109 (DE3)	Promega		Electrocompetent cells
A (Beverage)	Korea Yakult Co. (Korea)	Birak	Fermented drinks
B (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Epro	Soft drink
C (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Getoray	Sports drink