Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

Resumo

Este protocolo descreve a quantificação rápida e altamente sensível dos dados do sensor Förster transferência de energia de ressonância (FRET), usando um analisador de FRET portáteis feitos sob medida. O dispositivo foi utilizado para detectar a maltose dentro de uma gama de temperatura crítica que maximiza a sensibilidade de detecção, permitindo a avaliação prática e eficiente do teor de açúcar.

Resumo

As recentes melhorias no Förster transferência de energia de ressonância (FRET) sensores permitiram a sua utilização para detectar várias moléculas pequenas, incluindo íons e aminoácidos. No entanto, a fraca intensidade do sinal dos sensores de FRET inato é um grande desafio que impede a sua aplicação em vários campos e torna o uso de caro, de ponta fluorómetros necessário. Anteriormente, nós construímos, um analisador de FRET relação custo-benefício de alto desempenho que podem especificamente medir a razão de duas bandas de comprimento de onda de emissão (530 e 480 nm) para alcançar alta sensibilidade de detecção. Mais recentemente, descobriu-se que os sensores traste com proteínas de ligação periplasmática bacteriana detectar ligandos com a máxima sensibilidade na gama da temperatura crítica de 50 - 55 ° C. Este relatório descreve um protocolo para avaliar teor de açúcar em amostras de bebidas disponíveis comercialmente usando o nosso analisador FRET portátil com um sensor de FRET específicas de temperatura. Os nossos resultados mostraram que o pré-aquecimento adicionaldo processo do sensor de FRET aumenta significativamente a relação sinal de FRET, para permitir uma medição mais precisa do teor de açúcar. O analisador e o sensor de FRET feito por encomenda foram aplicadas com sucesso para quantificar o teor de açúcar, em três tipos de bebidas comerciais. Prevemos que reforçar ainda mais a redução de tamanho e desempenho do equipamento vai facilitar o uso de analisadores portáteis em ambientes onde o equipamento high-end não está disponível.

Introdução

Förster transferência de energia de ressonância (FRET) tem sido amplamente utilizado como um sensor biométrico para detectar pequenas moléculas tais como os açúcares, os iões de cálcio, e os aminoácidos ^1-4. biossensores FRET contêm proteínas fluorescentes, proteínas fluorescentes ciano (CFP) e proteínas fluorescentes amarelas (YFPs), que estão fundidos a ambas as extremidades de proteínas de ligação a periplásmicas (PBPs). Açúcares se ligar a PBP situadas no meio do sensor de FRET, causando alterações estruturais do sensor que, posteriormente, alterar a orientação e a distância transição dipolo das duas proteínas fluorescentes em cada extremidade da PLP. Esta alteração permite uma análise quantitativa do teor de açúcar através da medição da razão entre os comprimentos de onda de emissão de EYFP (530 nm) e ECFP (480 nm). Devido à alta sensibilidade, especificidade, capacidade de monitoramento em tempo real e tempo de resposta rápido de biossensores preocupe, esses sensores são amplamente utilizados em aplicações ambientais, industriais e médicos ^5. Além disso, Raciommedição etric utilizando biossensores FRET tem benefícios práticos importantes, uma vez que pode ser utilizada para medir componentes em amostras biológicas complexas, em que a concentração do sensor não pode ser facilmente controlada e a fluorescência de fundo está sempre presente.

Apesar destas vantagens dos sensores baseados em FRET para visualização quantitativa, pequenas mudanças estruturais com domínio incompleta movimento de transferência para as proteínas fluorescentes produzem inerentemente fraca intensidade do sinal. Este sinal fraco limita a aplicação de sensores baseados em FRET para in vitro ou in vivo na análise ^6. Consequentemente, a maioria FRET biossensores exigir a utilização de equipamento dispendioso e altamente sensível. Anteriormente, foi desenvolvido um analisador de FRET barato e portátil, com capacidades semelhantes às dos analisadores de fluorescência ⁷ existentes. Neste dispositivo, de baixo custo 405 nm ultravioleta banda-díodo emissor de luz (LED), foi usada como fonte de luz para excitação de causar thsinal de fluorescência e, a substituição de uma lâmpada ou laser caro. O sistema de detecção do analisador concentra-se eficientemente a dissipação de sinal de fluorescência em dois fotodetectores com um fotodiodo de silício. Num estudo mais recente, que mostrou que a optimização da temperatura de detecção, a 50 - 55 ° C poderia aumentar significativamente o sinal FRET raciométrica ^8. Este aumento do sinal específico da temperatura, juntamente com o analisador de FRET feito por medida, permite o uso de sensores de FRET em aplicações de diagnóstico mais gerais com sensibilidade elevada e rápida.

Neste protocolo, demonstramos a aplicabilidade geral do analisador FRET em condições ideais de temperatura FRET por meio da quantificação do teor de açúcar das bebidas disponíveis comercialmente. Este protocolo fornece os detalhes do funcionamento do dispositivo de FRET, bem como uma breve descrição do sensor e a preparação da amostra. Prevemos que este relatório irá promover a aplicação potencial do portátilanalisador em ambientes de laboratório de pequena escala e fornecer uma base para o desenvolvimento de um dispositivo de baixo custo no local de diagnóstico com biosensores baseados em FRET.

Protocolo

1. Preparação de Biosensor

1. Construir o plasmídeo pET21a (+) - PCP-MBP-YFP-His6, seguindo o protocolo estabelecido ^{anteriormente-2.}
2. Inocular 5 ml de caldo Luria (LB) com uma única colónia de uma estirpe de Escherichia coli DE3 e incubar a 37 ° C durante 16 horas com agitação.
3. Transferir 1 ml da cultura D / N para um balão de 500 ml contendo 100 ml de LB e incubar a 37 ° C num incubador com agitação, até a densidade óptica a 600 nm (DO ₆₀₀₎ atingir de 0,5 (cerca de 3 h).
4. Colher as células num tubo cónico de 50 ml por centrifugação a 1000 × g durante 20 min a 4 ° C.
5. Ressuspender o sedimento rapidamente em cada tubo com 50 ml de água gelada destilada (DW) e centrifugar a 1000 × g durante 20 min a 4 ° C.
6. Ressuspender o sedimento em 50 ul de DW gelada com 10% (v / v) de glicerol por agitação suave até que a solução (células electrocompetentes) atinge uma _DO600 de 100.
7. Coloque a mistura de células electrocompetentes (50 ul de células a um OD ₆₀₀ de 100) e 10 ng do plasmídeo pET21a (+) - PCP-MBP-YFP-His6 num electroporação cuvete arrefecida com gelo em um dispositivo de electroporação e electroporar a mistura (18 kV / cm, 25 uF).
8. Rapidamente adicionar 1 ml de meio SOC para a cuvete e ressuspender as células suavemente, seguindo-se a recuperação a 37 ° C durante 1 h com agitação suave, em um tubo de 15 ml de fundo redondo.
9. Espalhe as células em uma placa de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina e incubar a 37 ° C durante 12 h.
10. Isolar uma única colónia utilizando uma ansa e inocular a colónia em 10 ml de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina a 37 ° C num agitador durante 12 h.
11. Adicionam-se 5 ml da cultura de sementeira para 500 ml de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina e incubar a cultura num incubador com agitação a 37 ° C.
12. Adicionar 0,5 mM de isopropil-d β-tiogalactósido (IPTG), quando a _DO600 atinge0,5 e incuba-se a cultura numa incubadora com agitação a 37 ° C durante 24 h.
13. Centrifugar as células a 4500 × g durante 20 minutos (4 ° C) e suavemente remover o sobrenadante.
14. Ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão de ligação (Tris-HCl a 20, pH 8,0, PMSF 1 mM, EDTA 0,5 mM e DTT 1 mM).
15. Sonicate as células no gelo com seis rajadas de 10 seg a 200-300 W, seguindo cada rajada com 10 segundos de resfriamento.
16. Centrifuga-se o lisado a 10.000 × g durante 30 min a 4 ° C para sedimentar os detritos celulares. Transferir o sobrenadante (proteína solúvel) em um novo tubo de recolha.
17. Para conseguir a purificação por afinidade das proteínas do sensor de FRET, carga de 4 ml do lisado celular foi afastada numa coluna de afinidade de Ni-NTA (volume de 5 ml) e realizar um ensaio de cromatograf ia usando cromatograf ia líquida rápida de proteína (FPLC) ^18.
18. Lava-se a coluna uma vez com cinco volumes de coluna de tampão de lavagem I (tampão fosfato 50 mM, cloreto de sódio 300 mM, imidazol 10 mM, pH 7,0).
19. Repetir o passo de lavagem com cinco volumes de coluna de tampão de lavagem II (tampão fosfato 50 mM, cloreto de sódio 300 mM, imidazole 20 mM, pH 7,0).
20. Eluir a proteína sensor com cinco volumes de coluna de tampão de eluição (tampão fosfato 50 mM, cloreto de sódio 300 mM, imidazol 500 mM, pH 7,0).
21. Para concentrar e dessalinizar a amostra eluída, encher concentrador (tamanho da membrana de 10.000 MW) com um máximo de 20 ml de amostra e centrifuga-se durante 10 min a 3000 x g. Recarga concentrador com solução salina a 0,8% tamponada com fosfato (PBS). Repetir este passo duas vezes, em primeiro lugar enchendo o concentrador com 20 ml de amostra, e, em seguida, reenchimento com PBS.
22. Recuperar a proteína sensor de concentrado e salgado-de e armazená-lo a -80 ° C.

2. Medição de conteúdo de açúcar usando o Analisador de FRET

NOTA: Os detalhes da construção FRET analisador foram descritos no nosso trabalho anterior ^7.

1. Prepara-se uma solução de detecção de 0,8% de PBS contendo 0,2uM das proteínas do sensor.
2. Ligue o analisador de FRET. Pressione o botão "UP" durante 2 segundos para calibrar a temperatura ideal. Ajuste a temperatura para 53 ° C usando as "Up" e botões "DOWN" e pressione o botão "SET".
3. Para a calibração, pressione e segure o "UP" e os botões "DOWN" simultaneamente por 2 segundos. Confirmar que o painel LED exibe "CALIB" e pressione o botão "SET".
4. Coloque um 12,5 × 12,5 × 45 mm (comprimento x largura x altura) navio paralelepípedo rectangular (tina) contendo apenas tampão PBS em um suporte de cuvete do analisador e pressione o botão "SET".
5. Substitua a tina com um contendo apenas a solução de detecção (ver 2.1), sem açúcar (maltose / sucrose) e pressione o botão "SET" para calibrar a linha de base.
6. Substitua a tina com um contendo a solução de detecção com açúcar 10 mM e pressione o botão "SET"botão.
7. Para determinar o conteúdo de açúcar de uma amostra de bebida, colocar uma amostra de bebida ml num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugar a 16000 x g durante 1 min.
   NOTA: A medição de fluorescência baseado em sensor de FRET tem a vantagem de não exigir pré-tratamento especial da amostra, porque apenas 1% (v / v) da amostra está incluído no volume total. No entanto, recomendamos a remoção de qualquer material que possa afetar a medição de fluorescência (por exemplo, células, partículas insolúveis, lipídios, gordura, ou qualquer material com autofluorescência). Além disso, se um ácido forte, base forte, agente de limpeza (detergente), ou um agente emulsionante (emulsionante) está presente a uma concentração mais elevada e pode afectar as propriedades do sensor biológico FRET, ela deve ser removida usando um solvente orgânico ou numa neutralizador. Por exemplo, quando a gordura do leite e os emulsionantes são eliminados lanches congeladas, as amostras são centrifugadas num tubo de microcentrifuga a 16000 × g durante 30 min, e o líquido entrn o sedimento de fundo e a camada superior de gordura do leite é extraído. Uma quantidade igual de hexano, em seguida, é adicionado, seguido por centrifugação a 15.000 x g durante 30 min para eliminar os lípidos.
8. Remover o sobrenadante com uma seringa de 1-ml e filtrar através de um filtro de seringa (tamanho de poro de 0,2 um).
9. Colocar 0,1 mL da amostra filtrada bebida num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 0,9 ml de PBS e agitar com vortex suavemente.
   NOTA: É crítico para diluir a amostra de bebida adequada. Neste caso, a diluição de 1000 vezes foi executada de modo a que a concentração de açúcar cairia dentro da gama dinâmica do dispositivo. Recomendamos estimar a concentração de açúcar meta antecipadamente, referindo-se o teor de açúcar no rótulo da bebida.
10. Adicionam-se 5 ul da amostra de bebida diluída (1%, v / v) a uma cuvete contendo 0,495 ml da solução de detecção.
11. Coloque a cuvete num suporte da cuveta de o analisador de FRET e pré-aquecer a solução de amostra a 53 ° C.
12. Pressione o botão "SET" para medir o teor de açúcar.
    Nota É possível avaliar a medição de FRET utilizando um leitor de placas multilabel ou um espectrofotómetro de fluorescência equipado com um dispositivo de Peltier para controle de temperatura através da leitura da relação de 488/535 nm ^{de 7,8.} Para a detecção de sacarose, siga os passos 1,1-2,12 com um sensor de CSY-LH ^2.

Resultados

Para realizar a análise quantitativa do conteúdo de açúcar usando o analisador de FRET, que é necessário para construir uma curva ajustada a estimativa da concentração de açúcares alvo a partir da razão observada FRET. Seja r definir a razão entre a intensidade de emissão de PCP a 480 nm e a intensidade de emissão de YFP gerado a 530 nm (Eq. 1).

Discussão

Este protocolo permite a quantificação rápida e eficiente do teor de açúcar em amostras de bebidas, utilizando um feito por medida de FRET analisador de ⁷ a uma temperatura óptima para sensores de FRET. O analisador foi projetado com um recém-desenvolvido, barato banda de 405 nm de ultravioleta do LED como fonte de luz e dois fotodetectores com um fotodiodo de silício. Este dispositivo é mais rentável do que outras fluorímetros comparáveis. O dispositivo mostrou alta sensibilidade de detecção, e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB	BD	#244620
isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma	I6758
Ampicillin	Sigma	A9518
Tri-HCl	Bioneer	C-9006-1
PMSF	Sigma	78830
EDTA	Bioneer	C-9007
DTT	Sigma	D0632
NaCl	Junsei	19015-0350
phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4
SOC			2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose
Resource Q	Amersham Biosciences	17-1177-01	6 × 30 mm anion-exchange chromatography column
HisTrap HP1	Amersham Biosciences	29-0510-21
Quartz cuvette	Sigma	Z802875
AKÄKTAFPLC	Amersham Biosciences	18-1900-26	a fast protein liquid chromatography (FPLC)
Cary Eclipse	VarianInc		a fluorescence spectrophotometer
VICTOR	PerkinElmer	2030-0050	a multilabel plate reader
E. coli JM109 (DE3)	Promega		Electrocompetent cells
A (Beverage)	Korea Yakult Co. (Korea)	Birak	Fermented drinks
B (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Epro	Soft drink
C (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Getoray	Sports drink