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要約

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

要約

真菌、細菌やウイルスを含む分類学上の王国全体で複数菌相互作用の研究は、以前microbiomeのウイルスのメンバーは、これらのウイルスに感染した宿主細胞とそれに続く微生物相互作用をどのように影響するかに関して検討されていません。細菌および真菌とのウイルスの共居住は、主に口腔及び生殖管の粘膜表面上に存在します。粘膜細胞、持続性の慢性または持続性ウイルス潜伏感染症、特にものは、発現された受容体の数とタイプでウイルス改変を通じてmicrobiomeのメンバーに重大な影響を与える可能性があります。宿主細胞膜のアーキテクチャの変更は、バイオフィルム形成の最初のステップを開始するための正常細菌叢と日和見病原体のその後のメンバーの変更された能力、 すなわち 、密着性をもたらすであろう。この研究は、biofilの開始時にHSVの効果の定量化および目視検査のための方法を説明しS.のm個の形成（付着） aureusおよびC.アルビカンス 。

概要

人間microbiomeは、体内の地理的領域を共有する複数の分類学上の王国からの多様な生物が含まれます。細胞表面への付着はmicrobiomeの植民地化プロセスの一部であるバイオフィルム形成に不可欠な最初のステップです。 microbiomeに含まれては、慢性かつ持続的な感染症を引き起こすウイルスであることができます。これらのウイルスによる慢性細胞感染は推定受容体の可用性における変化を引き起こす可能性があります。また1,2、細胞内病原体による細胞エントリも順番に細菌や真菌などの他のmicrobiomeメンバーの添付ファイルを、変更することができるホスト膜流動性/疎水性に影響を与える可能性があります。ヒト宿主の同じ地域に共局在これらの複数の病原体との間で発生する可能性があります相互作用を理解するために、我々は、粘膜表面に存在する分類学上の王国のスペクトルを表し、病原体の相互作用を研究することができなければなりません。

tは">ヘルペスウイルスはmicrobiome 3,4の永久的なメンバーとしてのヒトの100％に存在する微生物のファミリーである。加えて、それらはまた、永続的両方の症状の存在下および非存在下で流すことができる。具体的には、単純ヘルペスウイルス1および単純ヘルペスウイルス2（HSV-1およびHSV-2、それぞれ）HSV-1およびHSV-2の原因の歯肉口内炎の両方、免疫適格個体で。oronasopharynx及び生殖管におけるmicrobiomeの永久的なメンバーであるだけでなく、性器ヘルペス5-8。これらのサイトでは、HSVは、慢性持続nectins、ヘパラン硫酸、脂質ラフトとヘルペスウイルスエントリーメディエーターの表面発現の変化における細胞の結果にHSVの9。エントリを流しウイルス無症候性/腫瘍壊死によって特徴づけ潜伏感染を引き起こします因子受容体（HVEM / TNFR）10月25日 。これらは、潜在的に日和見病原体ながら、いくつかの細菌および真菌のための共有の受容体を表す例えば黄色ブドウ球菌およびカンジダ・アルビカンス、これ、またoronasopharynx 26,27の粘膜microbiomeのメンバーとして常駐することができます。 oronasopharynx S.内aureusおよびC.アルビカンスは植民地化のの2つの異なる部位を占めます。天然歯を持つホストでは、口腔粘膜は、HSV-1およびCによって共有されていますアルビカンス、前部鼻鼻孔はS.によって占有されている間黄色ブドウ球菌 28。しかし、にもかかわらず、in vitroでの知見そのS.黄色ブドウ球菌は、口腔上皮細胞に付着し、29,30 S.正常組織29,30存在する場合球菌はまれ経口標本から単離されます。リトルは、臨床所見ものを超える生殖管の共同植民地化のニッチについて知られているS.黄色ブドウ球菌は C.ながら、性器の炎症、放電および性交疼痛症によって特徴づけられる、好気性膣炎に関連していますアルビカンスは、口腔31〜35で観察されたものと同様の粘膜の病変を生成します。このように、経口および生殖器microbiのこれらのメンバーが、分類学的王国少しOMEクロスは、宿主細胞表面5への接着を介してバイオフィルムの形成を開始することが影響能力としてのそれらの相互作用について知られています。このプロトコルは、効果的に、共コロニー形成/感染の機能的結果を判定するために適用されています。

プロトコル

1. HSV株及び取扱い

注：組換え非拡散HSV-1（KOS）gL86およびHSV-2（KOS）333gJを- V. Twiari 36,37によって提供された使用β-ガラクトシダーゼレポーター活性を有します。

  1. 1で-80℃での単一のロットとストアからウイルスを使用してください：20％ウシ胎児血清（FBS）とダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の1の比率、使用するまでスキムミルク。ウイルスロット保存前、 入出力 -nitrophenyl-β-D-ガラクトピラノシド（ONPG）および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド（X-GAL）アッセイによりウイルス濃度を決定します。
  2. 前述のように、レポーターウイルス侵入アッセイを使用して各実験アッセイの実行のためのX-Gal染色により、感染のウイルス生存率および多重度（MOI）を決定する（ 図1）14。
  3. 希望のMOIに（オプトMEM）のウイルスを希釈します。染色の前に、単層（/ウェル0.5ミリリットルパラホルムアルデヒド）を修正しました。別々のmicroti中のウイルスの生存能力のコントロールを配置複数菌アッセイプレートと平行にタープレート。

2.のHeLa 299細胞の取扱い

  1. 4.5g / Lグルコース、10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、ゲンタマイシン（50μg/ ml）およびL-グルタミンを含むDMEM中で37℃、5％CO 2で成長します。トリプシン溶液で80％コンフルエンスで継代細胞（エチレンジアミン四酢酸、0.53 M EDTA、0.05％トリプシン; 5ミリリットル/フラスコ）。

3. C.取り扱いアルビカンス

注：C.臨床検査源から得アルビカンス媒体約2倍のスキムミルクRemmelに-80℃で保存します。

  1. 文化はサブローデキストロース培地（37℃）に株式を凍結しました。 24時間のサブカルチャーC.後Fungisel媒体へアルビカンス （37°C、48時間）の使用のため。
  2. 発芽管（GT）の形を生成（; 3ミリリットルFBSを、代表的なコロニーを選ぶ3時間、37℃、腹筋600、0.3）。インキュベーション後、GT洗浄（HBSSを、2倍、4,000×gでの）。 （37＆温めHBSSに洗浄GTを追加します。＃176; C; 0.32のAbs 600）。 GT形態は、血球計数によって決定されるように観察された細胞の99％であるべきです。
  3. 代表Fungiselコロニーピッキングによって酵母形（YF）株式懸濁液を作る（HBSS、3ミリリットルを、0.32のAbs 600）。 /微視的に血球計数器を使用して、mlのYFのフォームの数をカウントします。 YF形態は、血球計数によって決定されるように観察された細胞の99％であるべきです。
  4. 作業の真菌株（; 37℃; 10 5 CFU / mlの25ミリリットルHBSS中のGTまたはYF株式の250μl）を作ります

4. S.球菌取り扱い

  1. ストアS.黄色ブドウ球菌 ATCC 25923（-80°C; Remmelは牛乳の2倍を脱脂）。ヒツジ血液寒天培地（; 37℃、24時間、5％）上に培養。代表的なコロニーを選択し、株式のために2日以内に培地塩をマンニトールへの転送（37℃、18時間）。
  2. S.を作ります黄色ブドウ球菌ストック懸濁液（3ミリリットルHBSS; 1.32腹筋600; 10 8 CFU / ml）を
    1. S.作業してください黄色ブドウ球菌株（100μlの25ミリリットルのHBSSの株式の。 10 5 CFU / mlで）。

5. カンジダとS.球菌懸濁液

  1. メイク混合C.アルビカンスおよびS.黄色ブドウ球菌懸濁液（250μlのYFまたはGTの株式と25ミリリットルHBSS中の100μlの黄色ブドウ球菌株 ）。

6.複数菌バイオフィルムアッセイ

  1. 2×10 5 HeLa細胞/ mlの200μlの（85％のコンフルエンスのレベル）でシード96ウェルプレート。ロックプレート（30から45分、37℃）インキュベーション前（37℃、5％CO 2インキュベーター; 18時間）。ウォッシュ単層（1×;オプトMEM）をHSVにシード（HSV-1（KOS）gL86またはHSV-2（KOS）33 GJ - 100μl中のOpt-MEM; MOI 50及び10）。プレートをインキュベート（3時間、37℃、5％CO 2）。 1日に1回だけウイルス株を使用してください。
  2. 感染した単層（; Mgの2及びCa 2を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）;100μlの1×）で洗浄します。 25＆＃残し暖かいHBSSでPBSを交換してください181;各ウェルのリットル。
    1. YF、GTおよび/ ​​またはSを追加します。 表1に示されるように平板培養する（静的に、30分間、37°C、5％CO 2） 黄色ブドウ球菌ワーキング懸濁液（N = 16; 1、100μlの細胞比の目標= 5）。
  3. インキュベーション後、一度に吸引1列には、すぐにマグネシウム2およびCa +2で300μlのPBSで再充填します。ラジオ免疫沈降アッセイ溶解バッファー（;濾過滅菌; 1:50希釈の200μlのRIPA）を追加し二回、この手順を繰り返します。
  4. 急速にHeLa細胞溶解物は、次いでマンニトール塩（MS）及び/又はFungisel（F）培地（ 図2）の上に50μlのを配置し粉砕します。 90°の角度でガラス棒を曲げを使用して溶解液を広げます。 （37℃で18時間）培養します。手動でプレートあたりのコロニー数をカウントします。コントロールは、Sから成り黄色ブドウ球菌および/ ​​またはC. HSV-非感染HeLa細胞へアルビカンス付着 。

7.イメージング研究

  1. 各ラウンドガラスカバースリップを洗ってください（12ミリメートル、50ミリリットルのアセトンミリリットルビーカー100中）。乾燥及び滅菌カバースリップ（キムワイプ;ガラスシャーレ）。アルコール火炎滅菌鉗子で滅菌24ウェルプレートのウェルに、乾燥、滅菌カバースリップを置きます。
  2. 洗浄滅菌ラウンドガラスカバースリップを含む24ウェルプレートのウェルに、HeLa細胞（96ウェルプレートに使用される5倍の体積1ミリリットル）を追加します。上記の手順6.4に6.2.1で説明したように、その後インキュベートし、プロセス、5×96ウェルプレートに使用する音量でテンプレート（表2）によれば、ウイルス、細菌および真菌を追加します。
  3. 最終洗浄後、メタノールでスライドをフラッディングし、それを蒸発させることにより、顕微鏡検査のために細胞を固定します。染色まで室温でプレートを保管してください。
  4. 明視野顕微鏡（1,000倍、最終的な元の倍率）のために脱イオン水でメタノール固定カバースリップを含むウェルを埋めます。すぐに水を吸引。グラムクリスタルバイオレットで各カバースリップをカバー。ウォッシュは、非結合染色（脱イオン水）の自由カバースリップ。 その場で乾燥したカバースリップは、その後、標識されたスライドにメディアをマウントハードセット（図3）とそれらを接着します。
  5. 蛍光顕微鏡（100倍の対物; 1,000倍、最終的な元の倍率）のためにステップ7.4で説明したように、洗浄は、基本的にメタノールの自由カバースリップ。ウェル中のカバースリップを乾燥させます。
    1. 乾燥させた後、カバースリップを削除し、ラベルされたスライド上に置きます。 （ - 5μL1）次に、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合単純ヘルペスウイルスのタイプの1：20希釈のカバースリップをカバーするために1 + 2のgD抗体を十分な量を追加します。
    2. 30分間、37℃で湿気チャンバー内でスライドをインキュベートします。インキュベーション後、PBSの4変化​​でカバースリップを洗います。
    3. 最終洗浄後、標識されたスライドにカバースリップを返します。 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（;湿度室、30分間、37°C​​ DAPI）で染色。インキュベーション後4ちゃんにカバースリップを洗いますPBSのGESは、その後、メディアをマウントハードセットで標識されたスライドに貼り付けます。
    4. マウンティング培地は暗所で室温で24時間硬化させます。 FITCおよびDAPIカットオフフィルターで明視野顕微鏡や蛍光顕微鏡のいずれかで油浸対物レンズの下にカバースリップを調べます。共局在（ 図4）のために少なくとも50フィールド（生物ごとに最低100個の細胞）の写真を調べます。

結果

このレポートに記載されているシステムから得られるデータの堅牢性のレベルは、 図2のaf 38に示されています。このシステムを使用することによりウイルス感染細胞や互いの密着性に及ぼす影響とブドウ球菌と真菌の相互作用の変調が描写することができます。多菌相互作用が同じ細胞で発生しているかどうかを決定するために、 図3

ディスカッション

現在のところ情報は、原核生物、真核生物およびウイルスの複数の分類学上のドメイン、 すなわち 、交差ホストmicrobiomeの半永久的なメンバーに永久の間の複雑な相互作用に利用できません。したがって、我々はSでバイオフィルムの開始を研究するためのインビトロモデルシステムで小説を開発しましたaureusおよびC. HSV-1またはHSV-2上アルビカンス?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
C.albicans
BBL Sabouraud DextroseBD211584
Fungisel AgarDot Scientific7205A
S.aureus
Mannitol Salt AgarTroy Biologicals7143B
Sheep blood agarTroy Biologicals221239
Hela cells
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvateCorning10-017-CM
Gentamicin 50mg/mlSigma139750µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1XCorning25-052-CI
Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicalsS1115010% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPGThermo Scientific34055
Ultra-Pure X galInvitrogen15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)Corning20-021-CV
1XPBSDot Scientific30042-500
RIPA LysisLife Technologies89901
Staining
MethanolFisher ScientificA433P-4
HSV 1&2, specific for gDViroStat196
DAPISIGMAD8417-5MG
Gram Crystal VioletTroy Biologicals212527
Supplies
Petri dish 100X15Dot Scientific229693 
Petri dish 150X15Kord Valmark2902
96-Well platesEvergreen Scientific222-8030-01F
24-well platesEvergreen Scientific222-8044-01F
Culture tubes 100x13Thomas Scientific9187L61
Cover slip circles, 12mmDeckglaserCB00120RA1

参考文献

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