Determinação do biofilme Iniciação em células infectadas por vírus por bactérias e fungos

Resumo

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Resumo

O estudo das interacções polimicrobianas através dos reinos taxonómicos que incluem fungos, bactérias e vírus não tenham sido previamente analisados ​​no que diz respeito à forma como membros virais da microbiota afectar micróbio subsequentes com estas células hospedeiras infectadas pelo vírus. A co-habitação com o vírus de bactérias e fungos é principalmente presentes nas superfícies das mucosas da cavidade oral e do tracto genital. células da mucosa, particularmente aqueles com infecções virais latentes crónicas ou persistentes persistentes, poderia ter um impacto significativo sobre os membros do microbioma através da alteração vírus em número e tipo de receptores expressos. Modificação em arquitectura membrana celular do hospedeiro iria resultar em capacidade alterada dos membros posteriores da flora normal e patógenos oportunistas para iniciar o primeiro passo na formação de biofilme, ou seja, a adesão. Este estudo descreve um método para a quantificação e exame visual do efeito de HSV na iniciação de biofilm formação (aderência) do S. aureus e C. albicans.

Introdução

O microbioma humano inclui diversos organismos de vários reinos taxonômicos que compartilham regiões geográficas no corpo. Aderência a superfícies celulares é um primeiro passo essencial na formação de biofilme, que é parte do processo de microbioma colonização. Incluído no microbioma pode ser vírus que causam infecções crônicas e persistentes. A infecção crónica de células por estes vírus pode provocar uma alteração na disponibilidade de receptor putativo. ^1,2 Além disso, a entrada celular por agentes patogénicos intracelulares podem também afectar a fluidez da membrana hospedeiro / hidrofobicidade, que por sua vez podem alterar a ligação de outros membros microbioma, incluindo bactérias e fungos . A fim de compreender as interações que podem ocorrer entre esses vários patógenos que co-localizam nas mesmas regiões geográficas do hospedeiro humano, devemos ser capazes de estudar a interação de agentes patogénicos que representam o espectro de reinos taxonômicos presentes na superfície da mucosa.

t "> O Herpesviridae é uma família de micróbios presentes em 100% dos seres humanos como membros permanentes da microbiota ^3,4. Além disso, eles podem também ser persistentemente derramado ambos na presença e ausência de sintomas. Especificamente, o vírus herpes simplex-1 e vírus herpes simplex-2 (HSV-1 e HSV-2, respectivamente) são membros permanentes do microbioma na oronasopharynx e tracto genital. nos indivíduos imuno-competentes, ambos de HSV-1 e HSV-2 causa gengivoestomatites, bem como herpes genital ^5-8. Nesses locais, HSV provoca uma infecção latente caracterizada por necrose tumoral crônica persistente assintomática viral derramamento ^9. entrada de HSV em células resulta em alterações na expressão de superfície do nectins, sulfato de heparano, jangadas lipídicas e herpesvírus mediador de entrada / receptor do factor (HVEM / TNFr) ^10-25. Estes receptores representam potencialmente partilhadas para algumas bactérias e fungos, por exemplo, S. aureus e C. albicans, enquanto que agentes patogénicos oportunistas,também pode residir como membros do microbioma da mucosa do oronasopharynx ^26,27. Dentro do oronasopharynx S. aureus e C. albicans ocupar dois locais distintos de colonização. Em hospedeiros com os dentes naturais, a mucosa oral é partilhada por HSV-1 e C. albicans, enquanto as narinas nasais anteriores são ocupados por S. aureus ^28. No entanto, apesar achados in vitro que S. aureus adere às células epiteliais bucais, ^29,30 S. aureus é pouco isolado a partir de amostras orais quando o tecido normal está presente ^29,30. Pouco se sabe a respeito genitais nichos co-colonização do trato além dos achados clínicos que S. aureus está associada com vaginite aeróbica, caracterizada por genital inflamação, descarga e dispareunia, enquanto C. albicans produz lesões nas mucosas semelhantes ao observado na cavidade oral ^31-35. Assim, embora estes membros da Microbi oral e genitalome reinos taxonômicos transversais pouco se sabe sobre a sua interação como ele afeta a sua capacidade de iniciar a formação de biofilme através da adesão à superfície da célula hospedeira ^5. Este protocolo tem sido efetivamente aplicada para determinar as consequências funcionais de co-colonização / infecção.

Protocolo

1. HSV Cepas e Manuseamento

Nota: recombinante não-invasiva de HSV-1 (KOS) gL86 e HSV-2 (KOS) 333gJ ^- com actividade repórter de beta-galactosidase utilizados foram fornecidos por V. Twiari ^36,37.

1. Use vírus a partir de um único lote e armazenar a -80 ° C a uma razão de 1: 1 de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com soro de bovino fetal a 20% (FBS) e leite desnatado até à sua utilização. Antes do armazenamento lote viral, determinar a concentração de vírus de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido de ensaio (X-Gal).
2. Determinar a viabilidade do vírus e a multiplicidade de infecção (MOI) por coloração X-Gal para cada ensaio experimental, utilizando um ensaio de entrada de vírus repórter, tal como anteriormente descrito (Figura 1) ^14.
3. Diluir vírus (Opt-MEM) para MOI desejada. Fix monocamadas (paraformaldeído; 0,5 ml / cavidade) antes da coloração. Colocar controles de viabilidade vírus em um microti separadaplaca ter em paralelo com placas de ensaio polimicrobianas.

2. HeLa 299 Manipulação celular

1. Crescer a 37 ° C, 5% de CO ₂ em meio DMEM com 4,5 g / L de glucose, 10% inactivado por calor soro fetal de bovino (FBS), gentamicina (50 ug / ml) e L-glutamina. células de passagem em 80% de confluência com uma solução de tripsina (ácido etilenodiaminotetra-acético, 0,53 M de EDTA; 0,05% de tripsina; 5 ml / frasco).

3. C. Manuseamento albicans

Nota: C. albicans obtidas a partir de uma fonte de laboratório clínico é armazenado a -80 ° C em 2x Remmel leite desnatado forma.

1. Cultura congelada estoque em Sabouraud Dextrose médio (37 ° C). Após 24 h a subcultura C. albicans em meio Fungisel (37 ° C; 48 h) durante a utilização.
2. Gerar tubo germinativo (GT) formas (escolher colónias representativos; 3 ml FBS; 3 horas; 37 ° C; Abs _600, 0,3). Após incubação, lava-GT (HBSS; 2x; 4000 xg). Adicionar GT lavada com HBSS aquecido (37 &# 176; C; 0,32 Abs _600). formas GT deve ser de 99% de células observadas como determinado pela contagem de hemocitómetro.
3. Faça suspensões forma de levedura (FA) de ações, escolhendo colônias Fungisel representativos (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs _600). Contar o número de formas de YF / ml microscopicamente usando um hemocitômetro. formas de YF deve ser de 99% de células observadas como determinado pela contagem de hemocitómetro.
4. Tornar o trabalho estoque fúngica (250 mL de GT ou estoque YF em 25 ml HBSS; 37 ° C; 10 ⁵ UFC / ml)

4. S. Manuseamento aureus

1. Loja S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel desnatado 2x leite). Cultura em agar de sangue de ovelha (5%; 37 ° C; 24 h). Escolha colónias representativos e transferir de mannitol sais médio prazo de 2 dias para estoque (37 ° C; 18 h).
2. Faça S. aureus suspensão de ações (3 ml HBSS; 1,32 Abs _600; 10 ⁸ UFC / ml)
   1. Tornar o trabalho S. Stock aureus (100 uldo estoque em 25 ml HBSS; 10 ⁵ CFU / ml).

5. Candida e S. aureus Suspensões

1. Faça misto C. albicans e S. suspensão aureus (250 mL YF ou estoque GT e 100 ul da S. aureus em 25 ml HBSS).

6. polimicrobiana biofilme Assay

1. Semente de placas de 96 poços com 200 ul de 2 x 10 ⁵ células HeLa / ml (nível de confluência de 85%). Placas de rocha (30 - 45 min; 37 ° C) antes da incubação (37 ° C; 5% de _CO2; 18 h). Monocamadas de lavagem (1x; Opt-MEM), em seguida, semente com HSV (HSV-1 (KOS) gL86 ou HSV-2 (KOS) 33 GJ ^- em 100 ul Opt-MEM; MOI 50 e 10). Incubar as placas (3 h; 37 ° C; 5% de CO _2). Use apenas uma estirpe viral por dia.
2. Lavar as monocamadas infectadas (1x; salina tamponada com fosfato (PBS) com Mg e Ca ^{2 2;} 100 ul). Substitua PBS com HBSS quente deixando 25 & #181; L em cada poço.
   1. Adicionar YF, GT e / ou S. aureus suspensões de trabalho (100 ul; a proporção de células-alvo = 5: 1; n = 16). tal como indicado na Tabela 1 Incubar as placas (estáticos; 30 min; 37 ° C; 5% de CO _2).
3. Após a incubação, aspirado de uma coluna de cada vez imediatamente reenchimento com 300 ul de PBS com ² Mg e Ca ^{+ 2.} Repetir este passo duas vezes e depois adicionar radio-imunoprecipitação tampão de ensaio de lise (RIPA; esterilizado por filtração; 200 ul de uma diluição de 1:50).
4. Rapidamente triturar o ligado de células HeLa, em seguida, colocar 50 ul em sais de manitol (MS) e media / ou Fungisel (F) (Figura 2). Espalhe o lisado utilizando uma vareta de vidro dobrada a um ângulo de 90 °. Incubar as placas (18 hr a 37 ° C). contar manualmente o número de colónias por placa. Os controlos consistem em S. aureus e / ou C. albicans adesão a células HeLa HSV-não infectadas.

7. Estudos Imaging

1. Lave cada lamela de vidro redonda (12 mm; 50 ml de acetona em 100 ml copo). lamelas secar e esterilizar (Kimwipes; placas de petri de vidro). Coloque lamelas estéreis secas nas cavidades da estéreis placas de 24 poços com álcool de chama fórceps esterilizados.
2. Adicionar células HeLa (1 ml; volume de 5x usado para placas de 96 poços) para os poços de placas de 24 poços contendo as lamelas de vidro redondas esterilizadas lavadas. Adicionar o vírus, bactérias e fungos de acordo com o modelo (Tabela 2) em 5x o volume utilizado para as placas de 96 poços, depois incubar e processo, tal como descrito nos passos 6.2.1 a 6.4 acima.
3. Após a lavagem final, fixar as células para microscopia inundando o diapositivo com metanol e deixando-se evaporar. Armazenar as placas à temperatura ambiente até a coloração.
4. Para a microscopia de campo claro (1.000x última ampliação original) encher os poços contendo lamelas fixo-metanol com água deionizada. Imediatamente aspirar água. Cubra cada lamela com Grams cristal violeta. Wash lamelas livre mancha não ligada (água deionizada). Lamelas secas in situ, em seguida, aderir-los com um conjunto de dureza média a um slide marcado de montagem (Figura 3).
5. Para a microscopia (objetiva de 100x; 1.000x original final ampliação) fluorescente lavagem lamelas livre de metanol essencialmente como descrito no passo 7.4. Secam-se as lamelas nos poços.
   1. Após a secagem, remover as lamelas e colocá-los em lâminas marcadas. Em seguida, adicionar uma quantidade suficiente de diluição de 1:20 de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated vírus herpes simplex tipo 1 + 2 gD anticorpo para cobrir a lamela (1-5 ul).
   2. Incubar as lâminas numa câmara de humidade a 37 ° C durante 30 min. Após a incubação, lavar as lamelas em 4 mudanças de PBS.
   3. Após a lavagem final, voltar a lamela ao slide marcado. Mancha com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; câmara de humidade; 37 ° C durante 30 min). Após a incubação, lavar as lamelas em 4 changes de PBS, em seguida, apor ao slide marcado com jogo duro meio de montagem.
   4. Permitir que o meio de montagem a curar durante 24 horas à TA no escuro. Examine as lamelas no âmbito do objectivo de óleo em cada um microscópio de campo claro ou um microscópio fluorescente com filtros de corte FITC e DAPI. Examinar imagens de pelo menos 50 campos (100 células por mínimos organismo) para co-localização (Figura 4).

Resultados

O nível de robustez dos dados que podem ser obtidos a partir do sistema descrito neste relatório é mostrado na Figura 2 AF ^38. Através da utilização deste sistema a modulação da interacção de estafilococos e fungos com células viralmente infectadas e o seu efeito sobre a adesão de cada um pode ser delineado. Estes tipos de estudos requerem um exame microscópico da interacção, como mostrado nas Figuras 3 e 4

Discussão

Actualmente não há informações disponíveis sobre as interacções complexas entre permanente aos membros semi-permanentes do microbioma acolhimento que atravessam vários domínios taxonómico, ou seja, procariotas, eucariotas e virais. Por isso, desenvolvemos um romance no sistema de modelo in vitro para estudar a iniciação biofilme por S. aureus e C. albicans em HSV-1 ou HSV-2 infectadas células HeLa (HeLa 229) ^38. O sistema modelo de células He...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose	BD	211584
Fungisel Agar	Dot Scientific	7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar	Troy Biologicals	7143B
Sheep blood agar	Troy Biologicals	221239
Hela cells
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate	Corning	10-017-CM
Gentamicin 50mg/ml	Sigma	1397	50µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X	Corning	25-052-CI
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150	10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG	Thermo Scientific	34055
Ultra-Pure X gal	Invitrogen	15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)	Corning	20-021-CV
1XPBS	Dot Scientific	30042-500
RIPA Lysis	Life Technologies	89901
Staining
Methanol	Fisher Scientific	A433P-4
HSV 1&2, specific for gD	ViroStat	196
DAPI	SIGMA	D8417-5MG
Gram Crystal Violet	Troy Biologicals	212527
Supplies
Petri dish 100X15	Dot Scientific	229693
Petri dish 150X15	Kord Valmark	2902
96-Well plates	Evergreen Scientific	222-8030-01F
24-well plates	Evergreen Scientific	222-8044-01F
Culture tubes 100x13	Thomas Scientific	9187L61
Cover slip circles, 12mm	Deckglaser	CB00120RA1