Détermination de biofilm Initiation sur les cellules infectées par le virus par les bactéries et les champignons

Résumé

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Résumé

L'étude des interactions polymicrobienne à travers les royaumes taxonomiques qui incluent les champignons, les bactéries et les virus n'ont pas été examinés précédemment en ce qui concerne la façon dont les membres virales du microbiome affectent les interactions microbiennes ultérieures avec ces cellules hôtes infectées par le virus. La cohabitation de virus avec des bactéries et des champignons est principalement présent sur les surfaces muqueuses de la cavité buccale et du tractus génital. les cellules des muqueuses, en particulier ceux avec des infections virales latentes chroniques ou persistantes persistants, pourraient avoir un impact significatif sur les membres du microbiome par altération du virus en nombre et le type de récepteurs exprimés. La modification de l'architecture de la membrane de la cellule hôte entraînerait une capacité altérée de nouveaux membres de la flore normale et des agents pathogènes opportunistes pour initier la première étape dans la formation de biofilm, à savoir l' adhérence. Cette étude décrit une méthode pour la quantification et l'examen visuel de l'effet de HSV sur l'ouverture de BIOFILla formation de m (d'adhésion) de S. aureus et C. albicans.

Introduction

Le microbiome humain comprend divers organismes provenant de plusieurs royaumes taxonomiques qui partagent des régions géographiques dans le corps. L'adhésion à la surface des cellules est une première étape essentielle dans la formation de biofilm, qui fait partie du processus de colonisation microbiome. Inclus dans le microbiome peuvent être des virus qui causent des infections chroniques et persistantes. L'infection chronique des cellules par ces virus peut provoquer une altération de la disponibilité du récepteur putatif. ^1,2 En outre, l' entrée de la cellule par des agents pathogènes intracellulaires pourrait également affecter la fluidité de la membrane hôte / hydrophobie qui à son tour peut modifier l' attachement des autres membres du microbiome, y compris les bactéries et les champignons . Afin de comprendre les interactions qui peuvent se produire entre ces multiples agents pathogènes qui co-localisent dans les mêmes régions géographiques de l'hôte humain, nous devons être en mesure d'étudier l'interaction des agents pathogènes qui représentent le spectre des royaumes taxonomiques présents à la surface de la muqueuse.

t "> Le Herpesviridae sont une famille de microbes présents dans 100% des humains en tant que membres permanents du microbiome ^3,4. En outre , ils peuvent également être constamment versé à la fois en présence et en l' absence de symptômes. Plus précisément, l' herpès simplex virus-1 et l'herpès simplex virus 2 (HSV-1 et HSV-2, respectivement) sont membres permanents du microbiome dans le oronasopharynx et l'appareil génital. chez les personnes immunocompétentes, HSV-1 et HSV-2 provoquent gingivostomatite, ainsi que herpès génital ^5-8. sur ces sites, HSV provoque une infection latente caractérisée par une nécrose chronique persistante virale asymptomatique excrétion ^9. entrée de HSV dans des cellules conduit à des altérations de l' expression de surface de nectins, l' héparane sulfate, les radeaux lipidiques et herpesvirus entrée médiateur / tumeur récepteur du facteur (HVEM / TNFR) ^10-25. Ces récepteurs potentiellement représentent partagés pour certaines bactéries et les champignons, par exemple S. aureus et C. albicans, qui , bien que des agents pathogènes opportunistes,peuvent également résider en tant que membres du microbiome de la muqueuse de l'oronasopharynx ^26,27. Au sein de la oronasopharynx S. aureus et C. Albicans occupent deux sites distincts de la colonisation. Dans des hôtes avec des dents naturelles, la muqueuse buccale est partagée par le HSV-1 et C. albicans, tandis que les nares nasales antérieures sont occupées par S. aureus ^28. Cependant, les résultats malgré in vitro que S. aureus adhère aux cellules épithéliales de la bouche, ^29,30 S. aureus est rarement isolé à partir d' échantillons oraux lorsque le tissu normal est présent ^29,30. On sait peu concernant génitales niches voies co-colonisation au - delà des résultats cliniques que S. aureus est associé à la vaginite aérobie, caractérisée par une inflammation génitale, la décharge et la dyspareunie, tandis que C. Albicans produit des lésions des muqueuses semblables à celles observées dans la cavité buccale ^31-35. Ainsi, bien que ces membres de la microbi orale et génitaleertains royaumes taxonomiques croisées peu est connu au sujet de leur interaction que son impact sur ​​leur capacité à initier la formation de biofilm par l' adhésion à la surface de la cellule hôte ^5. Ce protocole a été appliqué de manière efficace afin de déterminer les conséquences fonctionnelles de co-colonisation / infection.

Protocole

1. HSV Souches et Manipulation

Note: Recombinant non-propagation de HSV-1 (KOS) gL86 et HSV-2 (KOS) 333gJ ^- avec l' activité du rapporteur bêta-galactosidase utilisés ont été fournis par V. Twiari ^36,37.

1. Utiliser des virus à partir d'un lot unique et stocker à -80 ° C, à un rapport 1: 1 de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 20% de sérum de fœtus bovin (FBS) et le lait écrémé jusqu'à utilisation. Avant le stockage du lot viral, déterminer la concentration du virus par o - nitrophényl-β-D-galactopyranoside (ONPG) et de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) dosage.
2. Déterminer la viabilité du virus et de la multiplicité d'infection (MOI) par X-Gal coloration pour chaque série de test expérimental utilisant un test d'entrée du virus de la reporter, comme décrit précédemment (Figure 1) ^14.
3. Diluer virus (Opt-MEM) à MOI désiré. Fix monocouches (paraformaldéhyde; ainsi 0,5 ml /) avant la coloration. Placez les contrôles de viabilité du virus dans un microti séparéplaque de ter en parallèle avec des plaques d'essai polymicrobienne.

2. HeLa 299 cellules Manipulation

1. Croissance à 37 ° C, 5% de _CO2 dans du DMEM avec 4,5 g / L de glucose, 10% de sérum fœtal bovin (FBS), de la gentamicine (50 pg / ml) et de L-glutamine inactivé par la chaleur. cellules Passage à 80% de confluence avec une solution de trypsine (acide éthylènediaminetétraacétique, 0,53 M EDTA, 0,05% de trypsine, 5 ml / flacon).

3. C. albicans Manutention

Remarque: C. albicans obtenus à partir d' une source de laboratoire clinique est stocké à -80 ° C dans Remmel lait écrémé 2x moyen.

1. Culture gelé pâte sur Sabouraud Dextrose Medium (37 ° C). Après 24 heures sous - culture de la C. albicans sur le milieu Fungisel (37 ° C; 48 h) pour une utilisation.
2. Générer tube germinatif (GT) des formes (choisir colonies représentatives; 3 ml de FBS, 3 h; 37 ° C; Abs _600, 0,3). Après incubation, laver GT (HBSS; 2x; 4000 g). Ajouter GT lavé pour réchauffé HBSS (37 &# 176; C; 0,32 Abs _600). formes GT devraient être 99% des cellules observées tel que déterminé par le nombre de hémocytomètre.
3. Faire forme de levure (YF) actions suspensions en choisissant des colonies de Fungisel représentatives (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs _600). Comptez le nombre de formes YF / ml au microscope en utilisant un hémocytomètre. formes de YF devraient être 99% des cellules observées tel que déterminé par le nombre de hémocytomètre.
4. Faire stock de travail fongique (250 pi de GT ou YF stock en 25 ml de HBSS; 37 ° C; 10 ⁵ UFC / ml)

4. S. aureus Manipulation

1. Magasin S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel écrémé 2x lait). La culture sur de la gélose au sang de mouton (5%, 37 ° C; 24 h). Prélever des colonies représentatives et transfert à mannitol sels moyenne dans les 2 jours pour le stock (37 ° C; 18 h).
2. Faire S. aureus suspension stock (3 ml HBSS; 1,32 Abs _600; 10 ⁸ UFC / ml)
   1. Faire S. travail aureus actions (100 pidu stock dans 25 ml de HBSS; 10 ⁵ UFC / ml).

5. Candida et S. aureus Suspensions

1. Faire mixte C. albicans et S. aureus suspension (250 pl YF ou GT stock et 100 pi de S. aureus disponible dans 25 ml de HBSS).

6. polymicrobienne biofilm Assay

1. Semences des plaques à 96 puits avec 200 pi de 2 x 10 ⁵ cellules HeLa / ml (taux de confluence de 85%). Plaques de roche (30 - 45 min; 37 ° C) avant l' incubation (37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur; 18 h). Monocouches Wash (1x; Opt-MEM) , puis ensemencer avec HSV (HSV-1 (KOS) gL86 ou HSV-2 (KOS) 33 gJ ^- dans 100 ul Opt-MEM; MOI 50 et 10). Incuber les plaques (3 h, 37 ° C; 5% CO _2). Utilisez une seule souche virale par jour.
2. Laver les monocouches infectées (1x; tampon phosphate salin (PBS) avec du Mg et du Ca ^{2 2;} 100 ul). Remplacer PBS avec HBSS chaud laissant 25 & #181; l dans chaque puits.
   1. Ajouter YF, GT et / ou S. Les suspensions aureus travail (100 ul; rapport cible cellulaire = 5: 1; n = 16). comme il est indiqué dans le tableau 1 Incuber les plaques (statiques; 30 min; 37 ° C; 5% CO _2).
3. Après incubation, aspirer une colonne à la fois le remplissage immédiatement avec 300 ul de PBS avec Mg ⁺² et Ca ^+2. Répétez cette étape deux fois, puis ajouter le tampon test lyse radio immunoprécipitation (RIPA, filtre stérilisé; 200 ul d'une dilution au 1:50).
4. Rapidement triturer la cellule lysat HeLa puis placer 50 ul sur des sels de mannitol (MS) et / ou Fungisel (F) médias (figure 2). Passez le lysat en utilisant une tige coudée de verre à un angle de 90 °. Incuber les plaques (18 h à 37 ° C). compter manuellement le nombre de colonies par plaque. Les contrôles sont constitués de S. aureus et / ou C. albicans adhérence aux cellules HeLa HSV-non infectées.

7. Des études d'imagerie

1. Laver chaque lamelle de verre ronde (12 mm, 50 ml d'acétone dans bêcher de 100 ml). Sec et stériliser les lamelles (Kimwipes; boîtes de Pétri en verre). Placer les lamelles stériles secs dans les puits de plaques à 24 puits stériles, avec de l'alcool flamme pinces stérilisées.
2. Ajouter des cellules HeLa (1 ml; volume de 5x utilisé pour plaques à 96 puits) dans les puits de plaques à 24 puits contenant des lamelles de verre rondes lavées stériles. Ajouter les virus, les bactéries et les champignons selon le modèle (tableau 2) à 5x le volume utilisé pour les plaques à 96 puits, puis incuber et procédé tel que décrit dans les étapes 6.2.1 à 6.4 ci - dessus.
3. Après le lavage final, fixer les cellules pour la microscopie en inondant la lame avec du methanol et en le laissant évaporer. Stocker les plaques à la température ambiante jusqu'à ce que la coloration.
4. Pour la microscopie en champ clair (1,000x finale d'agrandissement d'origine) remplir les puits contenant des lamelles de méthanol fixe avec de l'eau déminéralisée. Immédiatement aspirer l'eau. Couvrir chaque lamelle avec du cristal violet Grams. Lavez lamelles de libre tache non liée (eau déminéralisée). Lamelles sèches in situ puis les adhèrent avec l' ensemble de dureté moyenne à une diapositive marquée de montage (Figure 3).
5. Pour la microscopie (objectif 100x; 1,000x finale grossissement) fluorescent lavage exempt de lamelles de méthanol essentiellement comme décrit dans l'étape 7.4. Sécher les lamelles dans les puits.
   1. Après séchage, enlever les lamelles et les placer sur des lames marquées. Puis ajouter une quantité suffisante de dilution de 1:20 isothiocyanate de fluorescéine (FITC) de l'Herpès Simplex Virus Type 1 + 2 gD anticorps pour couvrir la lamelle couvre-objet (1 - 5 ul).
   2. Incuber les lames dans une chambre d'humidité à 37 ° C pendant 30 min. Après incubation, laver les lamelles en 4 changements de PBS.
   3. Après le lavage final, le retour de la lamelle à la diapositive marquée. Tache avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, la chambre d'humidité, 37 ° C pendant 30 minutes). Après incubation, laver les lamelles dans 4 changements de PBS, puis apposer sur la diapositive marquée avec jeu dur milieu de montage.
   4. Laisser le milieu de montage durcir pendant 24 heures à température ambiante dans l'obscurité. Examiner les lamelles sous l'objectif du pétrole soit sur un microscope à fond clair ou microscope à fluorescence avec des filtres de coupure FITC et DAPI. Examiner les images d'au moins 50 champs (100 cellules par organisme minimum) pour la co-localisation (Figure 4).

Résultats

Le niveau de la solidité des données obtenues à partir du système décrit dans le présent rapport est illustré à la figure 2 af ^38. Grâce à l'utilisation de ce système, la modulation de l'interaction staphylococcique et fongique avec des cellules infectées par des virus et de leur effet sur l'adhésion de l'autre peut être délimitée. Ces types d'études nécessitent un examen au microscope de l'interaction , comme illustr?...

Discussion

Actuellement , aucune information est disponible sur les interactions complexes entre permanent aux membres semi-permanents du microbiome hôte qui traversent plusieurs domaines taxonomiques, à savoir, procaryotes, eucaryotes et virales. Nous avons donc développé un roman dans le système de modèle in vitro pour étudier biofilm initiation par S. aureus et C. albicans sur le HSV-1 ou HSV-2 infectées HeLa 229 ⁽³⁸ HeLa). Le système de modèle de cellules HeLa p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose	BD	211584
Fungisel Agar	Dot Scientific	7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar	Troy Biologicals	7143B
Sheep blood agar	Troy Biologicals	221239
Hela cells
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate	Corning	10-017-CM
Gentamicin 50mg/ml	Sigma	1397	50µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X	Corning	25-052-CI
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150	10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG	Thermo Scientific	34055
Ultra-Pure X gal	Invitrogen	15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)	Corning	20-021-CV
1XPBS	Dot Scientific	30042-500
RIPA Lysis	Life Technologies	89901
Staining
Methanol	Fisher Scientific	A433P-4
HSV 1&2, specific for gD	ViroStat	196
DAPI	SIGMA	D8417-5MG
Gram Crystal Violet	Troy Biologicals	212527
Supplies
Petri dish 100X15	Dot Scientific	229693
Petri dish 150X15	Kord Valmark	2902
96-Well plates	Evergreen Scientific	222-8030-01F
24-well plates	Evergreen Scientific	222-8044-01F
Culture tubes 100x13	Thomas Scientific	9187L61
Cover slip circles, 12mm	Deckglaser	CB00120RA1