JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

要約

単球は、特定の慢性炎症性疾患に関連する病原体および炎症によって活性化することができる自然免疫細胞です。単球の活性化は、エフェクター機能と増加したグルコース輸送体発現によって達成される解糖代謝への酸化から付随シフトを誘導します。この増加した解糖代謝はまた、訓練を受けた単球の免疫、先天性免疫記憶の形態で観察されます。単球によるグルコーストランスポーターの発現とグルコース取り込みを調べるインビトロプロトコルが記載されているが、いずれも全血マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって検討されていません。 （中間体（CD14 ++ CD16 +）および非古典-私たちは、総単球および古典（CD14 ++ CD16）によって全血における蛍光グルコースアナログ2-NBDGの取り込みを測定するためのマルチパラメトリックフローサイトメトリープロトコルを記述しますCD14 + CD16 ++）、単球亜集団。この方法は、恒常性および炎症性疾患の間の総単球及び単球亜集団のためのグルコーストランスポーターの発現及びグルコース取り込みを調べるために使用することができ、容易に血液中の他の白血球および白血球亜集団のためのグルコース取り込みを調べるために改変することができます。

概要

単球は、急速に感染し、炎症1の部位に動員されている人間の自然免疫系の主要な構成要素です。単球の活性化は、病原体による急性の損傷を制限するために重要であり、また、アテローム性動脈硬化症2、癌3、およびHIV 4,5を含むいくつかの慢性疾患の病因の中心です。

休止および活性化単球の代謝は休止単球は、解糖代謝（乳酸へのグルコースの、すなわち 、発酵）を利用した酸化的代謝および活性化単球を利用することで、劇的に異なる6。単球の活性化は、解糖系代謝7増加したグルコース取り込みを可能にするグルコース輸送体の発現を誘導します。単球のグルコーストランスポーター1（GLUT1）は、活性化の間にアップレギュレートさそのような輸送体であり、その発現は、Vにおける前炎症性サイトカインの産生をもたらすことが示されていますITROと肥満マウス8の脂肪組織インチカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスによって単球細胞株の感染はGLUT1 9の細胞のアップレギュレーションにつながる、と私たちは最近、慢性HIV感染の間にGLUT1を発現する単球の増加割合が未処理と併用抗レトロウイルス療法で処置した感染の10の間に存在していることを示しました。まとめると、これらの研究は、単球によるグルコース取り込み及び解糖代謝は、多くの炎症性疾患の重要な側面であることを示しています。従って、簡単な方法は、恒常性中単球GLUT1発現およびグルコース取り込みを測定し、炎症性疾患は、研究者の幅広い使用の可能性が高いです。

ヒト単球は、細胞表面マーカーCD14及びCD16 11,12の発現差によって調べることができる3つの別個のサブセットで構成され、不均一です。クラシック単球は、CD14の高いレベルを発現するが、CDを発現しません16（CD14 ++ CD16 - ）、中間の単球は、CD14の高レベルおよびCD16（CD14 ++ CD16 +）の中間レベルを発現し、非古典的単球は、CD14の低レベルとCD16の高レベル（CD14を発現し+ CD16 ++）。 CD16を発現する単球は、CD16に比べCD16 +単球を、と呼ばれる-単球は、高い炎症性サイトカインの発現とをより効果的に存在する抗原13,14能力を持っています。単球の約10％は、炎症15の間に観察されたより高い割合との恒常性の間にCD16を発現します。単球の亜集団は、特定の疾患状態と関連していると、病気や疾患の進行16の有用な生物学的マーカーである可能性があります。

私たちの目標は、PHYに近い条件でのヒト単球と単球亜集団によるグルコーストランスポーターの発現とグルコースの取り込みを測定することができる方法を同定することでしたできるだけsiological条件。これらの方法は、生理学的条件19に比べてタンパク質の発現が変化していることができ、単離された単球を検討しても以前の研究では、単球のグルコース輸送体の発現とグルコースの取り込み17,18を測定し、以前の研究では、ヒト単球亜集団を検討していません。フローサイトメトリーのマルチパラメトリックフローを使用して、我々は全体の未操作の血の中に（CD14およびCD16の発現に基づく）総単球及び単球亜集団によるグルコーストランスポーターの発現と蛍光グルコースアナログ2-NBDGの取り込みを調べるための方法を説明します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

注：HIV感染およびHIV非感染被験者は、メルボルンのアルフレッド病院で感染症のユニットから募集した、VIC、オーストラリア、そして地域社会から、それぞれ。インフォームドコンセントは、全ての参加者から入手した、と研究はアルフレッド病院研究倫理委員会によって承認されました。

単球及び単球亜集団1. GLUT1細胞表面検出

  1. クエン酸ACD-B抗凝固剤チューブに血液を収集し、収集の1時間以内に生物学的安全キャビネット内で実験を開始します。
  2. ポリプロピレンチューブに血液の100μLを加えます。氷の上で、ピペッティングを穏やかに混合する一方でソリューションを溶解1×2 mlを加え、チューブに（ 材料表を参照してください）。氷上で15分間インキュベートします。 5分間、220×gで遠心分離します。
  3. デカントし、約2〜4ミリリットルの洗浄溶液（1×PBS中0.5％BSA）のを添加し、5分間220×gで遠心分離することによって、二回洗います。
  4. パイプを使用してください慎重にできるだけ洗浄液の限りを削除します。場所チューブは氷の上に洗浄溶液100μlに再懸濁します。
  5. 5μlの抗CD3-PE、5μlの抗CD14-APC、5μlの抗CD16-PECy7、5μlのGLUT1：特定の単球の亜集団は、ステップ1.4で調製した100μlの細胞懸濁液あたりの抗体の以下の容量で細胞を染色同定するために、 -FITCまたはIgG2bの-FITC（アイソタイプコントロールチューブ）。
  6. 暗所で30分間氷上に置きます。洗浄溶液で2回洗浄します。 1×PBSで行われた0.5％ホルムアルデヒドの200から300μlの修正。
  7. FITC（488、530）、PE（488、575）、PECy7（488、780）、APC（633、660）10：以下、励起および発光波長内に24時間以内に4色を検出することが可能なフローサイトメーターで分析します。

単球2.グルコース取り込み

  1. ポリプロピレンチューブにステップ1.1で採取した血液のピペットを90μl。 14.60μM2-NBDGワーキング溶液10μlに追加血液90μlの（1.46 mMの最終濃度）と混合するために穏やかにフリック。アルミホイルでチューブを被覆することにより光2- NBDGの露出を制限することが重要です。
  2. 15〜30分間、暗所で37℃でインキュベートし、その後直ちに氷上に置きます。氷の上ながら、チューブへの解決策を溶解1X FACSの4ミリリットルを追加します。 4で220×gで遠心分離 5分間°C。
  3. 洗浄溶液4ml（1×PBS中0.5％BSA）を添加することにより1回洗浄。 4で220×gで遠心分離 5分間°C。デカントし、氷の上の場所。
  4. 抗体を用いた染色細胞：5μlの抗CD3-PE、5μlの抗CD14-APCおよび5μlの抗CD16-PECy7。混合し、暗所で30分間氷上に置きます。
    注：この期間中は、フローサイトメーターは、即時分析のための準備ができていることを確認してください。以下の励起および発光波長内の細胞を買収：2-NBDG（488、530）、PE（488、575）、PECy7（488、780）、APC（633、660）。
  5. チューブに氷冷洗浄緩衝液（1×PBS中0.5％BSA）の4ミリリットルを追加します。4で220×gで遠心分離することによって1回洗浄 5分間°C。デカントし、氷古いPBSの200から300μlを添加し、暗所で氷（アルミ箔で覆われた）に保ちます。ステップ2.4​​のように励起および発光波長設定を使用して10分以内にフローサイトメーターで分析します。

3.データ収集と分析

注：フローサイトメトリーデータ分析の知識が仮定されます。

  1. 染色されていない個別染色したサンプルを使用して補正を設定し、少なくとも4色の分析が可能なフローサイトメーターを使用して。
    注：FITC標識CD4及びCD14を使用して単一の染色はGLUT1及び2-NBDGの補償のために使用することができます。
  2. 設定し、サンプルを取得する前に、適切なウィンドウにラベルを付けます。単球集団の周りにゲートを描き、中速度でサンプル100,000 300,000イベントを取得します。補償サンプルあたり50,000イベントで十分です。
    注：補正前の試料に行ってもよいです標準的な手順に従って取得又は単一細胞解析ソフトウェアで、。
  3. 適切な場所にデータをエクスポートし、保存します。指定されたように、単一のそのようなFlowJoソフトや他の解析ソフトウェアなどの細胞解析ソフトウェア（ 補足図1）とドラッグ＆ドロップのサンプルを開きます（ 補足図2）。
  4. ファイルを開くにはダブルクリックして（ 補足図3）。 図1Aおよび補足図4に示すように、ゲート順に基づいて、単球および側方散乱特性をに円を描く。単球集団をダブルクリックします。 CD3の周りにボックスを確認し、描く-人口（ 補足図4）。
  5. ダブルCD3をクリックします-人口を。単球亜集団を観察するには、 'X'軸上のCD14-APCを選択し、CD16-PECy7 'Y'軸上、及び（ 補足図5）に応じてラベルを付けます。
  6. 明確な存在しない場合には正と負の集団は、特定の単球亜集団におけるGLUT1の発現または2-NBDGの取り込みを測定します。アイソタイプなし2-NBDGの背景（ 補足図6）を引いGLUT1と2-NBDGの平均蛍光強度（MFI）を決定します。
  7. ここで定義された集団は、ゲートを設定し、パーセント陽性細胞（ 図3）を決定するためのIgG2b-FITCを使用し、存在します。
    注：総CD14 +単球を分析するために、この手順を使用します。 2-NBDGの取り込みは、通常、蛍光のシフトによってマークされているので、データは最高のMFIとヒストグラムで表される強度。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

補償は、蛍光波及を防ぐために、個々の蛍光色素のために実行する必要があります。単球は、最初の前方および側方散乱に基づいてゲートすることによって濃縮されます。以前に10を報告したように提示したプロットは、6人以上の参加者からの全血で行われ、少なくとも6つの独立した実験の代表で、図1Aは、CD3以内ゲーティングによるT細胞の細?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、全血における単球及び単球亜集団によるグルコーストランスポーターの発現と蛍光グルコースアナログの取り込みを調べるための簡単​​な方法を詳しく説明します。全血中の2-NBDG取り込みを評価することにより、この技術は、 インビボでのものと同様の条件を可能にします。以前の研究では、密度遠心分離17によって、全血から分離した単球?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

この研究は、サポートされている賞番号AI027757の下エイズ研究のためのワシントン大学のセンター（CFAR）、NIH資 ​​金提供プログラムからHIVや肝炎ウイルス学研究（ACH 2）オーストラリアセンター、2010発達グラント（CNIHR）によって賄われていました以下のNIH研究所およびセンター（NIAID、NCI、NIMH、NIDA、NICHD、NHLBI、NIA）によります。 CSPはCNIHRとACH 2助成金の受取人です。 SMCは、オーストラリア国立保健医療研究評議会（NHMRC）主な研究フェローシップの受領者です。作者は感謝しバーネット研究所によって受信されたビクトリア朝の運用インフラ支援プログラムのこの作業への貢献を認めます。私たちは訓練と技術的なアドバイス、フローサイトメトリーのためのAMREPフローサイトメトリーコアファシリティから下座PaukovicとエヴァOrlowski - オリバーの支援を認めます。私たちは、メディアのコーチングやビデオ撮影の組織のためのアンガス・モーガンに感謝します。私たちの感謝の気持ちジェシーマッソンとジハード・アブドゥルアジーズK. Alzahraniにビデオ撮影時のラボの支援のために。我々は重要な方法論的なアドバイスを提供した医学研究科で博士デビッドSimar、UNSW、オーストラリアの努力に感謝します。 CSPは感謝したいと思いwww.nice-consultants.comをグラフィック協議するため。

レビューアの貢献：

CSPは、設計と実験を行い、分析し、データを解釈し、プロジェクトを考案し、原稿を書きました。 JJAは、データを解釈し、原稿を書きました。 TRBは、原稿を書きました。 JMMは、データを解釈し、重要な知的な提案を行い、原稿をレビューしました。 SMCは、データを解釈し、重要な知的提案を行い、原稿をレビューしました。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubesGreiner Bio-One GmbH455094
5 ml sterile polypropylene tubesBD Biosciences352063
Albumin from Bovine Serum (BSA)Sigma-AldrichA7906
16% formaldehyde solutionElectron Microscopy Science15710
BD FACS lysing solution (10x)BD Biosciences349202Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PEBD Biosciences555340
anti CD14-APCBD Biosciences555399
anti-CD16-PECy7BD Biosciences557744
anti-Glut1-FITCR & D SystemsFAB1418F
IgG2b-FITCR & D SystemsIC0041F
2-NBDGLife technologiesN13195Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x)Life technologies14190-144To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

参考文献

  1. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
  3. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
  4. Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819(2014).
  5. Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. , (2016).
  6. Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684(2014).
  7. Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
  8. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
  9. Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79(2013).
  10. Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
  11. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
  13. Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
  14. Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
  15. Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
  16. Ziegler-Heitbrock, L. Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. , Springer. 3-36 (2014).
  17. Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
  18. Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
  19. Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
  20. Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
  21. Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
  22. Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
  23. Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
  24. Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
  25. Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
  26. Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. , 1-12 (2015).
  27. Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection? AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
  28. McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
  29. Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
  30. Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. , 80-90 (2016).
  31. Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29(2015).
  32. Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218(2015).
  33. Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516(2016).
  34. Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
  35. Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98(2014).
  36. Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864(2015).
  37. Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
  38. Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

114 2 NBDG PBMC HIV GLUT1 immunometabolism

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved