一个简单的流式细胞仪法测量葡萄糖的摄取和葡萄糖转运表达单核细胞亚群的全血

摘要

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

摘要

单核细胞是可通过与某些慢性炎性疾病相关的病原体和炎症被激活先天免疫细胞。单核细胞激活诱导效应职能和免受氧化糖酵解来代谢随之而来的转变，伴随增加葡萄糖转运蛋白表达。这增加了糖酵解代谢也为单核细胞经过培训免疫力，先天免疫记忆形式观察。虽然在体外单核细胞检查葡萄糖转运蛋白表达和葡萄糖摄取的协议进行了说明，没有已被多参数流式细胞仪在全血检测。我们描述了荧光葡萄糖类似物2-NBDG摄取全血中总单核细胞和经典（CD14 ⁺ CD16 ^{- ）}测定的多参数流式细胞协议，中间体（CD14 ⁺ CD16 ^+）和非经典（ CD14 ⁺ CD16 ^+）单核细胞亚群。该方法可用于检查稳态和炎症性疾病中总单核细胞和单核细胞亚群的葡萄糖转运蛋白表达和葡萄糖摄取，并且可以容易地修改，以检查血液中的其它白细胞和白细胞亚群的葡萄糖摄取。

引言

单核细胞是正在迅速动员到感染和炎症¹的位点的人的先天免疫系统的重要组成部分。单核细胞的活化是限制由病原体产生急性损害的关键，也是中央对多种慢性疾病，包括动脉粥样硬化^2，3癌症和HIV ^4,5的发病机制。

静息和活化的单核细胞的代谢显着不同，以利用氧化代谢利用糖酵解代谢（ 即 ，葡萄糖发酵成乳酸）静息单核细胞和活化的单核^6。单核细胞的活化诱导葡萄糖转运，可以增加葡萄糖摄取糖酵解代谢⁷的表达。单核细胞葡萄糖转运蛋白1（的Glut1）是激活期间上调一个这样的转运，其表达已显示导致生产v中促炎细胞因子的itro和在肥胖小鼠⁸的脂肪组织。由卡波西肉瘤相关疱疹病毒单核细胞系感染导致⁹的Glut1细胞上调，我们最近发现，慢性感染艾滋病毒期间的Glut1表达的单核细胞百分比增加是未经处理及联合抗逆转录病毒疗法治疗的感染¹⁰时在座。总而言之，这些研究表明，葡萄糖摄取和由单核细胞糖酵解代谢许多炎性疾病的重要方面。因此，一个简单的方法来测量稳态期间的单核细胞的Glut1表达和葡萄糖摄取和炎性疾病可能是使用了广泛的研究人员。

人单核细胞是异质的，正在由能够由细胞表面标记物CD14和CD16 ^11,12的差异表达进行检查三个不同的子集。经典单核细胞表达CD14的较高水平，但不表达CD16（CD14 ⁺ CD16 ^{- ），}中间的单核细胞表达CD14的高水平和CD16（CD14 ⁺ CD16 ^+）的中间电平，和非经典的单核细胞表达CD14的水平低和CD16高的水平（CD14 ⁺ CD16 ^+）。表达CD16的单核细胞被称为CD16 ⁺单核细胞，这相比CD16 ^-单核细胞有炎性细胞因子的高表达和能力，更有效地呈递抗原^13,14。单核细胞的大约10％与炎症¹⁵中观察到的更高的百分比的动态平衡期间表达CD16。单核细胞亚群与某些疾病状态相关联，并且可能是疾病和疾病进展¹⁶的有用的生物标志物。

我们的目标是确定可以测量通过在尽可能接近的phy条件人单核细胞和单核细胞亚群的葡萄糖转运蛋白表达和葡萄糖摄取的方法siological条件越好。以前的研究测量的单核细胞葡萄糖转运蛋白的表达和葡萄糖摄取^17,18，虽然这些检测方法可以比较生理条件¹⁹已经改变蛋白表达分离的单核细胞，并没有以前的研究调查了人单核细胞亚群。使用多参数流式细胞术，我们描述的方法来检查该荧光葡萄糖类似物2-NBDG按总单核细胞和单核细胞亚群的葡萄糖转运蛋白表达和摄取（基于CD14和CD16的表达）全未经处理的血液内。

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研究方案

注:艾滋病病毒感染者和艾滋病病毒感染者是从传染病股在阿尔弗雷德医院在墨尔本，澳大利亚招募，并从当地社区，分别为。从所有参与者获得知情同意书，研究批准了阿尔弗雷德医院研究伦理委员会。

在单核细胞和单核细胞亚群1.细胞的Glut1表面检测

1. 收集血液柠檬酸ACD-B的抗凝管并开始实验在生物安全柜收集1小时之内。
2. 加入100微升血液聚丙烯管。加2ml 1X的裂解液（见材料表 ）来管，而冰，移液轻轻混合。孵育在冰上15分钟。离心在220×g离心5分钟。
3. 倒出并通过加入大约2-4毫升洗涤溶液（在1×PBS中的0.5％BSA）并在220 xg离心离心5分钟洗涤两次。
4. 使用管道TTE要小心地取出尽可能多的洗涤液成为可能。在100微升洗涤液管放置在冰上重新挂起。
5. 确定具体的单核细胞亚群染色细胞与步骤1.4制得每100抗体微升细胞悬浮液的以下量:5微升抗CD3-PE，5微升抗-CD14-APC，5微升抗CD16-PECy7，5微升的Glut1 -FITC或的IgG2b-FITC（同型对照管）。
6. 在冰上放置在黑暗中30分钟。用洗涤液洗2次。 200-300微升在1X PBS在0.5％甲醛固定。
7. 以下激发和发射波长在24小时之内流式细胞仪能够检测4种颜色流分析^{:FITC（488，530），PE（488，575），PECy7（488，780），APC（633，660），10。}

2.葡萄糖摄取单核细胞

1. 收集在步骤1.1中的聚丙烯管移液器90微升的血液。添加10微升14.60μM2 NBDG工作液来90微升的血液（1.46毫米终浓度），并轻轻一抖混合。这是非常关键的覆盖管用铝箔限制2 NBDG曝光。
2. 孵育在37℃下在黑暗中15-30分钟，然后立即置于冰上。加4毫升1×FACS裂解解决管在冰冷。离心在4 220 XG °C为5分钟。
3. 通过加入4毫升洗涤溶液（0.5％在1×PBS中的BSA）洗涤一次。离心在4 220 XG °C为5分钟。倒出并在冰上的地方。
4. 染色细胞用抗体:5微升抗CD3-PE，5微升抗-CD14-APC和5μl抗CD16-PECy7。混合，并在冰上放置在黑暗中30分钟。
   注:在此期间确保流式细胞仪已经准备好进行实时分析。获得以下几方面激发和发射波长范围内的单元格:2 NBDG（488，530），PE（488，575），PECy7（488，780），APC（633，660）。
5. 4ml冰冷的洗涤缓冲液（在1×PBS中的0.5％BSA）添加到管中。离心220 XG洗一次在4 °C为5分钟。倒出并加入200-300微升冰旧的PBS，并保持在黑暗冰（用铝箔覆盖）。在流式细胞仪采用激发和发射波长设定在2.4步10分钟的流量进行分析。

3.数据采集与分析

注意:假设流式细胞仪和数据分析方面的知识。

1. 用流式细胞仪能够至少4色分析的流，使用未染色和单独地染色样品设置的补偿。
   注意:使用FITC标记的CD4和CD14单染色可用于的Glut1和2- NBDG补偿。
2. 建立和采集取样前标注相应的窗口。绘制围绕单核细胞群体的栅极，并获得每个样品100,000-300,000事件在中等速率。每个样品赔偿50,000个事件就足够了。
   注:补偿之前，可以进行采样采集或在单细胞分析软件，以下的标准程序。
3. 出口和数据保存到一个适当的位置。打开的单细胞分析软件如的FlowJo或其他分析软件（ 参考图1）和拖放样品作为指定（ 参考图2）。
4. 双击打开文件（ 参考图3）。画一个圆门了一种基于单核细胞和图1A和补充图4所示侧向散射特性。双击单核细胞的人口。观察周围画了一个CD3箱^-人口（ 参考图4）。
5. 双击CD3 ^-人口。观察单核细胞亚群上的"X"轴选择CD14-APC和CD16-PECy7上的"Y'-轴，并相应标签（ 参考图5）。
6. 那里有没有明显阳性和阴性群，测量的Glut1在特定的单核细胞亚群表达或2-NBDG摄取。通过减去同种型和不2- NBDG背景（ 参考图6）确定的Glut1和2- NBDG的平均荧光强度（MFI）。
7. 其中，定义种群存在，则使用的IgG2b-FITC来设置的栅极，并确定百分比阳性细胞（ 图3）。
   注:使用此方法来分析总CD14 ⁺单核细胞。由于2-NBDG摄取通常是由在荧光移位标记强度数据最好由MFI和直方图表示。

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结果

补偿必须单独荧光染料，以防止荧光溢出来执行。单核细胞首先通过选通基于前向和侧向散射富集。给出的图是从六个或更多个参与者对全血进行至少六个独立实验的代表如先前报道¹⁰ 图1A示出了由CD3内选通由细胞散射和T细胞的排斥的单核细胞的最初选通^-人口。然后单核细胞被选通为单独或与CD16以确定总单核细胞或单核细胞亚群的组合CD14的?...

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讨论

这里描述的协议细节的简单方法来检查在全血中的单核细胞和单核细胞亚群的葡萄糖转运蛋白表达和荧光葡萄糖类似物的摄取。通过在全血评估-2- NBDG摄取，此技术允许类似于在体内条件。先前的研究中通过密度离心^17日全血中分离的单核细胞检测6 NBDG摄取。然而，这项研究并没有审查的单核细胞亚群，并从全血中单核细胞的分离可以潜在地改变某些细胞表面分子¹⁹的表达。...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes	Greiner Bio-One GmbH	455094
5 ml sterile polypropylene tubes	BD Biosciences	352063
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
16% formaldehyde solution	Electron Microscopy Science	15710
BD FACS lysing solution (10x)	BD Biosciences	349202	Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE	BD Biosciences	555340
anti CD14-APC	BD Biosciences	555399
anti-CD16-PECy7	BD Biosciences	557744
anti-Glut1-FITC	R & D Systems	FAB1418F
IgG2b-FITC	R & D Systems	IC0041F
2-NBDG	Life technologies	N13195	Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x)	Life technologies	14190-144	To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)