Un semplice citometria a flusso metodo per misurare il glucosio assorbimento e glucosio Expression Transporter per monociti sottopopolazioni nel sangue intero

Riepilogo

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Abstract

I monociti sono cellule immunitarie innate che possono essere attivati ​​da agenti patogeni e l'infiammazione associata con alcune malattie infiammatorie croniche. L'attivazione dei monociti induce funzioni effettrici e uno spostamento concomitante da ossidativo al metabolismo glicolitico che è accompagnato da un aumento dell'espressione trasportatore del glucosio. Questo aumento del metabolismo glicolitico si osserva anche per l'immunità qualificato di monociti, una forma di memoria immunologica innata. Anche se sono stati descritti in vitro protocolli in esame espressione trasportatore di glucosio e l'assorbimento di glucosio da parte dei monociti, nessuno è stato esaminato dal flusso multiparametrica citometria nel sangue intero. Descriviamo un multi-parametrica protocollo citometria di flusso per la misurazione della fluorescenza analogico glucosio 2-NBDG assorbimento nel sangue intero dal totale monociti e classico (CD14 ⁺⁺ CD16 ^-), intermedio (CD14 ⁺⁺ CD16 ⁺⁾ e non classica ( CD14 ⁺ CD16 ⁺⁺⁾ monocitisottopopolazioni. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare l'espressione trasportatore di glucosio e l'assorbimento di glucosio per un totale di monociti e sottopopolazioni monociti durante l'omeostasi e la malattia infiammatoria, e può essere facilmente modificato per esaminare l'assorbimento del glucosio per altri leucociti e sottopopolazioni di leucociti all'interno del sangue.

Introduzione

I monociti sono una componente importante del sistema immunitario innato umano, che stanno rapidamente mobilitato per siti di infezione e infiammazione ^1. L'attivazione dei monociti è fondamentale per limitare i danni acuti da patogeni ed è anche fondamentale per la patogenesi di diverse malattie croniche, tra cui l'aterosclerosi ^2, il cancro ^3, e l'HIV ^4,5.

Il metabolismo di riposo e monociti attivati ​​differisce notevolmente, con monociti riposo che utilizzano il metabolismo ossidativo e monociti attivati ​​utilizzando il metabolismo glicolitico (vale a dire, la fermentazione del glucosio in lattato) ^6. L'attivazione dei monociti induce l'espressione di trasportatori del glucosio che permette di aumentare l'assorbimento del glucosio per il metabolismo glicolitico ^7. Monociti trasportatore di glucosio 1 (Glut1) è un tale trasportatore upregulated durante l'attivazione e la sua espressione è dimostrato di portare alla produzione di citochine pro-infiammatorie in vItro e nel tessuto adiposo dei topi obesi ^8. L'infezione di una linea cellulare monocitica da sarcoma di Kaposi associato herpesvirus porta ad upregulation cellulare di Glut1 ^9, e abbiamo recentemente dimostrato che durante l'infezione cronica da HIV una maggiore percentuale di monociti GLUT1 esprimenti sono presenti durante antiretrovirale un'infezione non trattata e terapia di combinazione trattati ^10. Presi insieme, questi studi dimostrano che l'assorbimento di glucosio e il metabolismo glicolitico da monociti sono aspetti importanti di molte malattie infiammatorie. Così, un metodo semplice per misurare l'espressione Glut1 monociti e l'assorbimento del glucosio durante l'omeostasi e la malattia infiammatoria è probabile che sia di utilità per una vasta gamma di ricercatori.

Monociti umani sono eterogenei, essendo composto da tre sottoinsiemi distinti che possono essere esaminati da espressione differenziale di marcatori di superficie delle cellule CD14 e CD16 ^11,12. monociti classici esprimono un elevato livello di CD14, ma non esprimono CD16 (CD14 ⁺⁺ CD16 ^-), monociti intermedie esprimono un elevato livello di CD14 e un livello intermedio di CD16 (CD14 ⁺⁺ CD16 ^+), e non classica monociti esprimono un basso livello di CD14 e un alto livello di CD16 (CD14 ⁺ CD16 ^++). I monociti che esprimono CD16 sono chiamati CD16 ⁺ monociti, che rispetto al CD16 ^- monociti hanno alta espressione di citochine infiammatorie e la capacità di più efficace antigeni presenti ^13,14. Circa il 10% dei monociti esprimono CD16 durante l'omeostasi con percentuali più elevate osservate durante l'infiammazione ^15. Sottopopolazioni monociti sono associati a determinate patologie e potrebbero essere utili marcatori biologici della malattia e della progressione della malattia ^16.

Il nostro obiettivo era quello di individuare un metodo in grado di misurare l'espressione del trasportatore del glucosio e l'assorbimento di glucosio da monociti umani e sottopopolazioni monociti in condizioni come vicino a PHYcondizioni siological possibili. Studi precedenti misurati espressione del trasportatore del glucosio e dei monociti assorbimento del glucosio ^17,18, anche se questi metodi esaminati monociti isolati che possono aver alterato l'espressione della proteina rispetto alle condizioni fisiologiche ^{di 19,} e nessun precedente studio ha esaminato sottopopolazioni monociti umani. Utilizzando flusso multiparametrica citometria, si descrive un metodo per esaminare l'espressione trasportatore di glucosio e l'assorbimento del glucosio analogico fluorescente 2-NBDG dal totale monociti e sottopopolazioni monociti (sulla base di CD14 e CD16 espressione) all'interno di sangue intero non manipolata.

Protocollo

NOTA: HIV-infetti e soggetti non infetti da HIV sono stati reclutati da l'Unità Malattie Infettive presso l'Alfred Hospital di Melbourne, VIC, Australia, e dalla comunità locale, rispettivamente. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti, e la ricerca è stato approvato dal Comitato Etico della ricerca e Alfred Hospital.

1. Glut1 rilevamento cellulari di superficie sui monociti e dei monociti sottopopolazioni

1. Raccogliere il sangue in citrato tubi anticoagulanti ACD-B e iniziare gli esperimenti in una cappa di sicurezza biologica entro 1 ora di raccolta.
2. Aggiungere 100 ml di sangue per tubi in polipropilene. Aggiungere 2 ml di 1x Soluzione di Lisi (vedi Materiali tabella) per i tubi, mentre sul ghiaccio, pipettaggio delicatamente per miscelare. Incubare per 15 minuti in ghiaccio. Centrifugare a 220 xg per 5 min.
3. Decantare e lavare due volte aggiungendo circa 2-4 ml di soluzione di lavaggio (0,5% BSA in PBS 1x) e centrifugazione a 220 xg per 5 min.
4. Utilizzare un tubotte rimuovere accuratamente la maggior quantità di soluzione di lavaggio possibile. Porre le provette su ghiaccio e risospendere in 100 ml di soluzione di lavaggio.
5. Per identificare specifiche sottopopolazioni di monociti colorare le cellule con il seguente volume di anticorpi per 100 microlitri sospensione cellulare previste al punto 1.4: 5 ml anti-CD3-PE, 5 ml di anti-CD14-APC, 5 ml di anti-CD16-PECy7, 5 ml Glut1 -FITC o IgG2b-FITC (provetta di controllo isotipo).
6. Mettere in ghiaccio per 30 minuti al buio. Lavare 2 volte con soluzione di lavaggio. Fissare con 200-300 ml di 0,5% di formaldeide made in 1x PBS.
7. Analizzare su un citofluorimetro in grado di rilevare 4 colori entro 24 ore all'interno del seguente eccitazione ed emissione di lunghezza d'onda: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) ^10.

2. Il glucosio assorbimento da parte dei monociti

1. Pipettare 90 ml di sangue raccolto nella fase 1.1 in tubi di polipropilene. Aggiungere 10 ml di una soluzione di lavoro 14.60 mM 2-NBDG a90 ml di sangue (1,46 mM concentrazione finale) e flick delicatamente per miscelare. E 'fondamentale per limitare a 2 NBDG esposizione alla luce coprendo i tubi con un foglio di alluminio.
2. Incubare a 37 ° C al buio per 15-30 min e poi subito disporli sul ghiaccio. Aggiungere 4 ml di 1x FACS soluzione lisante ai tubi mentre sul ghiaccio. Centrifugare a 220 xga 4 ° C per 5 min.
3. Risciacquare una volta con l'aggiunta di 4 ml di soluzione di lavaggio (0,5% BSA in PBS 1x). Centrifugare a 220 xga 4 ° C per 5 min. Decantare e posto sul ghiaccio.
4. cellule macchia con anticorpi: 5 ml anti-CD3-PE, 5 ml di anti-CD14-APC e 5 ml di anti-CD16-PECy7. Mescolare e mettere in ghiaccio per 30 minuti al buio.
   NOTA: Durante questo periodo di assicurarsi che il citofluorimetro è pronto per l'analisi immediata. Acquisire cellule all'interno del seguente eccitazione ed emissione di lunghezza d'onda: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
5. Aggiungere 4 ml di tampone di ghiaccio lavaggio a freddo (0,5% BSA in PBS 1x) ai tubi.Lavare una volta per centrifugazione a 220 xg a 4 ° C per 5 min. Decantare e aggiungere 200-300 ml di ghiaccio vecchio PBS e tenere in ghiaccio al buio (coperto con un foglio di alluminio). Analizzare su un citofluorimetro entro 10 minuti con eccitazione e regolazione lunghezza d'onda di emissione come al punto 2.4.

3. Acquisizione dati e analisi

NOTA: La conoscenza della citometria a flusso e l'analisi dei dati è assunto.

1. Utilizzando un citofluorimetro capace di analisi almeno a 4 colori, impostare la compensazione utilizzando campioni non colorati e colorate singolarmente.
   NOTA: colorazione singola con un CD4 coniugati con fluoresceina e CD14 può essere utilizzato per Glut1 e compensazione 2-NBDG.
2. Impostare ed etichettare le finestre appropriate prima di acquisire campioni. Disegnare un cancello intorno alla popolazione dei monociti, e di acquisire 100.000 a 300.000 eventi per campione a tasso medio. 50.000 eventi per campione di compensazione è sufficiente.
   NOTA: La compensazione può essere effettuata prima di assaggiareacquisizione o in singolo software di analisi delle cellule, seguendo le procedure standard.
3. Esporta e salvare i dati in un luogo appropriato. Aprire il software di analisi singola cella come FlowJo o altri software di analisi (Supplemental Figura 1) ed i campioni di trascinamento, come specificato (Figura supplementare 2).
4. Fare doppio clic su file (Supplemental Figura 3) aprire. Disegnare un cerchio di monociti basati su avanti e le proprietà laterali scatter come mostrato nella Figura 1A e supplementare Figura 4 porta. Fare doppio clic la popolazione dei monociti. Osservare e disegnare una casella attorno al CD3 ^- popolazione (Supplemental Figura 4).
5. Fare doppio clic sul CD3 ^- popolazione. Per osservare le sottopopolazioni monociti selezionare CD14-APC sulla 'x' asse, e CD16-PECy7 sul 'asse y'-, e l'etichetta di conseguenza (Supplemental Figura 5).
6. Dove non ci sono distintepopolazioni positive e negative, misurano l'espressione di Glut1 o 2 NBDG assorbimento nelle specifiche sottopopolazioni monociti. Determinare le intensità di fluorescenza media (MFI) di Glut1 e 2-NBDG sottraendo isotipo e no 2-NBDG sfondo (Supplemento Figura 6).
7. Se esistono popolazioni definite, utilizzare il IgG2b-FITC per impostare il cancello, e determinare percentuale di cellule positive (figura 3).
   NOTA: Utilizzare questa procedura per analizzare i totali CD14 ⁺ monociti. Dal 2-NBDG assorbimento è di solito caratterizzato da uno spostamento della fluorescenza intensità dei dati è meglio rappresentata da IFM e istogrammi.

Risultati

Compensazione deve essere eseguita per singoli fluorocromi per prevenire la fluorescenza spillover. I monociti vengono prima arricchite da gating sulla base in avanti e scatter laterale. Le trame presentate sono rappresentanti di almeno sei esperimenti indipendenti condotti su sangue intero da sei o più partecipanti, come riportato in precedenza ¹⁰ Figura 1a mostra il gating iniziale di monociti di dispersione delle cellule e l'esclusione delle cellule T ...

Discussione

Il protocollo descritto qui DETTAGLI un metodo semplice per esaminare l'espressione trasportatore di glucosio e fluorescenti glucosio assorbimento analogico da monociti e monociti sottopopolazioni di sangue intero. Valutando 2-NBDG assorbimento nel sangue intero, questa tecnica consente di condizioni simili a quelle in vivo. Un precedente studio ha esaminato 6-NBDG assorbimento nei monociti separati dal sangue intero dalla densità centrifugazione ^17. Tuttavia, questo studio non ha esaminato sott...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes	Greiner Bio-One GmbH	455094
5 ml sterile polypropylene tubes	BD Biosciences	352063
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
16% formaldehyde solution	Electron Microscopy Science	15710
BD FACS lysing solution (10X)	BD Biosciences	349202	Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C)
anti-CD3-PE	BD Biosciences	555340
anti CD14-APC	BD Biosciences	555399
anti-CD16-PECy7	BD Biosciences	557744
anti-Glut1-FITC	R & D Systems	FAB1418F
IgG2b-FITC	R & D Systems	IC0041F
2-NBDG	Life technologies	N13195	Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X)	Life technologies	14190-144	To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C)