Une cytométrie en flux simple méthode pour mesurer l'absorption du glucose et de glucose Expression Transporter pour monocytes dans les sous-populations de sang total

Résumé

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Résumé

Les monocytes sont des cellules immunitaires innées qui peuvent être activées par des agents pathogènes et l'inflammation associées à certaines maladies inflammatoires chroniques. L'activation des monocytes induit des fonctions effectrices et un déplacement concomitant de l'oxydation du métabolisme glycolytique qui est accompagnée par une expression accrue de glucose dans le transporteur. Ce métabolisme glycolytique augmentation est également observée pour l'immunité formé des monocytes, une forme de mémoire immunologique innée. Bien que les protocoles in vitro examinant l' expression du transporteur du glucose et de l' absorption du glucose par les monocytes ont été décrits, aucun n'a été examiné par un flux multi-paramétrique cytométrie sur sang total. Nous décrivons un protocole de cytométrie de flux multi-paramétrique pour la mesure de la fluorescence du glucose analogique à 2 NBDG l' absorption dans le sang total par les monocytes total et le classique (CD14 ⁺⁺ CD16 ^-), intermédiaire (CD14 ⁺⁺ CD16 ⁺⁾ et non classique ( cellules CD14 ⁺ CD16 ⁺⁺⁾ monocytesous-populations. Cette méthode peut être utilisée pour examiner l'expression du transporteur de glucose et l'absorption du glucose pour les monocytes totaux et les sous-populations de monocytes pendant homéostase et de la maladie inflammatoire, et peut être facilement modifié pour examiner l'absorption du glucose pour d'autres leucocytes et des sous- populations de leucocytes au sein du sang.

Introduction

Les monocytes sont un composant majeur du système immunitaire inné humain qui sont rapidement mobilisée vers les sites d'infection et d' inflammation ^1. L' activation des monocytes est essentielle pour limiter les dommages aigus par des agents pathogènes et est également au centre de la pathogenèse de plusieurs maladies chroniques, y compris l' athérosclérose ^2, le cancer ^3, et le VIH ^4,5.

Le métabolisme de repos et des monocytes activés diffère de façon spectaculaire, avec des monocytes au repos en utilisant le métabolisme oxydatif et les monocytes activés en utilisant le métabolisme glycolytique (ie, la fermentation du glucose en lactate) ^6. L' activation des monocytes induit l' expression des transporteurs de glucose qui permet d'accroître l' absorption de glucose pour le métabolisme glycolytique ^7. Monocyte transporteur de glucose 1 (Glut1) est un tel transporteur upregulated lors de l'activation et son expression a été démontré que conduire à la production de cytokines pro-inflammatoires dans vitro et dans le tissu adipeux des souris obèses ^8. L' infection d'une lignée cellulaire monocytaire par Kaposi associé herpèsvirus conduit à une régulation positive cellulaire Glut1 ^9, et nous avons récemment montré qu'au cours de l' infection chronique par le VIH d' une augmentation du pourcentage de monocytes de Glut1 exprimant sont présents au cours de l' infection par le traitement traité par antirétroviraux non traitée et la combinaison ^10. Pris ensemble, ces études montrent que l'absorption du glucose et du métabolisme glycolytique par les monocytes sont des aspects importants de nombreuses maladies inflammatoires. Ainsi, une méthode simple pour mesurer l'expression des monocytes Glut1 et l'absorption du glucose au cours de l'homéostasie et la maladie inflammatoire est susceptible d'être utile à un large éventail de chercheurs.

Les monocytes humains sont hétérogènes, étant constitué de trois sous - ensembles distincts qui peuvent être examinés par l' expression différentielle des marqueurs de la surface cellulaire CD14 et CD16 ^11,12. monocytes classiques expriment un niveau élevé de CD14, mais n'expriment CD16 (CD14 ⁺⁺ CD16 ^-), monocytes intermédiaires expriment un niveau élevé de CD14 et un niveau intermédiaire de CD16 (CD14 ⁺⁺ CD16 ⁺⁾ et non-classique monocytes expriment un faible niveau de CD14 et un niveau élevé de CD16 (CD14 ⁺ CD16 ^++). Monocytes exprimant CD16 sont appelées CD16 ^+, des monocytes qui ont comparé au CD16 ^- les monocytes ont une forte expression de cytokines inflammatoires et de la capacité de manière plus efficace des antigènes présents ^13,14. Environ 10% des monocytes expriment CD16 au cours de l' homéostasie avec des pourcentages plus élevés observés au cours de l' inflammation ^15. Sous - populations de monocytes sont associés à certains états pathologiques et pourraient être des marqueurs biologiques utiles de la maladie et progression de la maladie ^16.

Notre objectif était d'identifier une méthode qui permet de mesurer l'expression du transporteur de glucose et de l'absorption du glucose par les monocytes humains et des sous-populations de monocytes dans des conditions aussi proches phyconditions siologique que possible. Des études antérieures mesurées monocytes glucose expression du transporteur et de l' absorption du glucose ^17,18, bien que ces méthodes examinées monocytes isolés qui peuvent avoir modifié l' expression des protéines par rapport à des conditions physiologiques ^19, et aucune étude précédente a examiné les sous - populations de monocytes humains. En utilisant un écoulement multi-paramétrique cytométrie, nous décrivons une méthode pour étudier l'expression du transporteur de glucose et de l'absorption du glucose analogue fluorescent 2-NBDG par les monocytes totaux et les sous-populations de monocytes (basé sur l'expression de CD14 et CD16) dans le sang entier non manipulée.

Protocole

NOTE: infectés par le VIH et les sujets séronégatifs ont été recrutés dans l'Unité des maladies infectieuses à l'Hôpital Alfred à Melbourne, VIC, Australie, et de la communauté locale, respectivement. Le consentement éclairé a été obtenu à partir de tous les participants, ainsi que la recherche a été approuvé par le Comité de la recherche et de l'éthique Alfred Hospital.

1. Glut1 Détection de surface cellulaire sur les monocytes et monocytes sous-populations

1. Recueillir le sang dans des tubes anticoagulants ACD-B citrate et de commencer les expériences dans une enceinte de sécurité biologique dans les 1 h de collection.
2. Ajouter 100 pi de sang dans des tubes en polypropylène. Ajouter 2 ml de solution 1x lyse (voir tableau des matériaux) à des tubes tandis que sur la glace, pipetage doucement pour mélanger. Incuber pendant 15 min sur la glace. Centrifuger à 220 g pendant 5 min.
3. Décanter et laver deux fois par addition d'environ 2-4 ml de solution de lavage (0,5% de BSA dans du PBS 1X), et en centrifugeant à 220 g pendant 5 min.
4. Utilisez un tuyauTTE pour enlever soigneusement autant de la solution de lavage que possible. Placer les tubes sur la glace et remettre en suspension dans 100 pi de solution de lavage.
5. Pour identifier les sous-populations de monocytes spécifiques colorent les cellules avec le volume suivant d'anticorps par 100 ul de suspension cellulaire préparée à l'étape 1.4: 5 ul anti-CD3-PE, 5 ul anti-CD14-APC, 5 ul anti-CD16-PECy7, 5 pi Glut1 FITC ou IgG2b-FITC (tube de contrôle isotypique).
6. Placer sur la glace pendant 30 min dans l'obscurité. Laver 2 fois avec une solution de lavage. Fixer avec 200-300 pi de 0,5% de formaldéhyde réalisés dans PBS 1x.
7. Analyser sur un cytomètre en flux capable de détecter 4 couleurs dans les 24 heures au sein de l'excitation et l' émission de longueur d' onde suivantes: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) ^10.

2. l'absorption du glucose par les monocytes

1. Pipette 90 ul de sang recueillies à l'étape 1.1 dans des tubes en polypropylène. Ajouter 10 ul d'une solution de travail de 14,60 pM 2 à NBDGles 90 ul de sang (1,46 mM de concentration finale) et flick doucement pour mélanger. Il est essentiel de limiter 2-NBDG exposition à la lumière, en recouvrant les tubes de papier d'aluminium.
2. Incuber à 37 ° C dans l'obscurité pendant 15-30 min, puis placer immédiatement sur la glace. Ajouter 4 ml de FACS 1x solution à tubes lysants tandis que sur la glace. Centrifuger à 220 xg à 4 ° C pendant 5 min.
3. Laver une fois en ajoutant 4 ml d'une solution de lavage (0,5% de BSA dans 1 x PBS). Centrifuger à 220 xg à 4 ° C pendant 5 min. Décanter et placer sur la glace.
4. cellules Stain avec des anticorps: 5 ul anti-CD3-PE, 5 ul anti-CD14-APC et 5 pi anti-CD16-PECy7. Mélanger et placer sur de la glace pendant 30 minutes dans l'obscurité.
   NOTE: Au cours de cette période, assurez-vous que le flux est cytomètre prêt pour l'analyse immédiate. Acquérir des cellules dans la longueur d'onde d'excitation et d'émission suivantes: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
5. Ajouter 4 ml de tampon de lavage à froid glace (0,5% de BSA dans PBS 1x) à tubes.Laver une fois par centrifugation à 220 xg à 4 ° C pendant 5 min. Décanter et ajouter 200-300 pi de vieille glace PBS et garder sur la glace dans l'obscurité (recouverts d'une feuille d'aluminium). Analyser un cytomètre à écoulement à moins de 10 min en utilisant l'excitation et le réglage d'émission de longueur d'onde comme dans l'étape 2.4.

Acquisition de données et analyse 3.

NOTE: Une connaissance de cytométrie en flux et l'analyse des données est supposé.

1. L'utilisation d'un cytomètre de flux capable d'analyser au moins 4 couleurs, compensation en utilisant des échantillons non colorés et colorées individuellement.
   REMARQUE: coloration unique en utilisant un CD4 marqué au FITC et CD14 peut être utilisé pour Glut1 et de compensation 2-NBDG.
2. Mettre en place et étiqueter les fenêtres appropriées avant d'acquérir des échantillons. Dessiner une grille autour de la population de monocytes, et d'acquérir 100.000 à 300.000 événements par échantillon au taux moyen. 50.000 événements par échantillon de rémunération est suffisante.
   NOTE: La compensation peut être effectuée avant de goûteracquisition ou logiciel unique d'analyse de cellules, en suivant les procédures standard.
3. Exporter et enregistrer des données dans un endroit approprié. Ouvrez simple logiciel d'analyse de cellules telles que FlowJo ou un autre logiciel d'analyse (Figure 1 supplémentaire) et des échantillons de glisser-déposer comme indiqué (Figure supplémentaire 2).
4. Double - cliquez pour ouvrir le fichier (figure supplémentaire 3). Tracez un cercle de monocytes basé sur l' avant et les propriétés de dispersion de côté comme le montre la Figure 1A et supplémentaire Figure 4 porte. Double cliquez sur la population de monocytes. Observer et dessiner une zone autour de la CD3 ^- population (figure supplémentaire 4).
5. Double cliquez sur le CD3 ^- population. Pour observer les sous - populations de monocytes sélectionner CD14-APC sur le 'x' axe, et CD16-PECy7 sur le 'axe Y'-, et étiqueter en conséquence (figure supplémentaire 5).
6. Là où il n'y a pas distinctepopulations positives et négatives, de mesurer l'expression de Glut 1 ou 2 NBDG absorption dans les sous-populations de monocytes spécifiques. Déterminer les intensités de fluorescence moyenne (IFM) de Glut 1 et 2 NBDG en soustrayant l'isotype et n ° 2 NBDG-fond (figure 6 Supplement).
7. Lorsque les populations définies existent, utilisez le IgG2b-FITC pour régler la porte, et de déterminer les cellules positives de pourcentage (figure 3).
   REMARQUE: Utilisez cette procédure pour analyser CD14 ⁺ monocytes totales. Depuis le 2-NBDG absorption est généralement marquée par un changement de fluorescence intensités les données sont mieux représentées par des IMF et des histogrammes.

Résultats

La rémunération doit être effectuée pour fluorochromes individuels pour prévenir les fuites de fluorescence. Les monocytes sont d'abord enrichis par gating sur la base de l'avant et la diffusion latérale. Les parcelles présentées sont des représentants d'au moins six expériences indépendantes réalisées sur sang total de six participants ou plus comme précédemment rapporté ¹⁰ Figure 1A montre le déclenchement initial de monocytes pa...

Discussion

Le protocole décrit ici en détail une méthode simple pour étudier l'expression du transporteur de glucose et fluorescent absorption d'analogue du glucose par les monocytes et les sous-populations de monocytes dans le sang entier. En évaluant 2 NBDG l' absorption dans le sang entier, cette technique permet des conditions similaires à celles in vivo. Une précédente étude a examiné 6-NBDG absorption dans les monocytes séparés du sang total par la densité centrifugation ^17. Cepen...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes	Greiner Bio-One GmbH	455094
5 ml sterile polypropylene tubes	BD Biosciences	352063
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
16% formaldehyde solution	Electron Microscopy Science	15710
BD FACS lysing solution (10X)	BD Biosciences	349202	Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C)
anti-CD3-PE	BD Biosciences	555340
anti CD14-APC	BD Biosciences	555399
anti-CD16-PECy7	BD Biosciences	557744
anti-Glut1-FITC	R & D Systems	FAB1418F
IgG2b-FITC	R & D Systems	IC0041F
2-NBDG	Life technologies	N13195	Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X)	Life technologies	14190-144	To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C)