腫瘍転移に対する低酸素のテストの効果のためのインビボモデル

要約

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

要約

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm³. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

概要

ユーイング肉腫（ES）は、小児および青年に影響を与える積極的な悪性腫瘍です。 ¹腫瘍は一般的に手足に、軟部組織および骨に開発しています。転移の存在が、ES患者のための単一の最も強力な予後不良因子であるが、その開発の基礎となるメカニズムは不明です。 ²腫瘍の低酸素状態は、ESの進行に関与するいくつかの要因の一つです。 ES患者において、腫瘍組織内の非灌流領域の存在は、予後不良と関連しています。 ^図3は、 インビトロにおいて 、低酸素症は、ES細胞の侵襲性を増加させ、プロ転移性遺伝子の発現を誘発します。しかし、証拠のこれらの行にもかかわらず、低酸素誘導ESの進行および普及のためには直接の証拠が存在しない^4-6。また、低酸素症は、このような効果を発揮する機構は、現時点では不明です。したがって、我々は、in vitroデータおよび臨床obser に既存の間のギャップを埋めるためにin vivoモデルを作成しましたvations。このモデル系は、ex vivoでの病理学的および分子分析（ 図1）と組み合わせて、 インビボでの腫瘍の進行と転移に追従するように、磁気共鳴イメージング（MRI）を使用して、それらの自然環境で発生する腫瘍の低酸素の影響の直接的検査を可能にします。

ESの確立さトランスジェニックモデルは、現在利用可能ではないので、これらの腫瘍の転移特性に関するin vivo試験は、免疫不全マウスにヒト細胞の注射に依存しています。免疫学的障害の動物の使用は、疾患の進行の免疫系の影響を過小評価することができるが、ヒト細胞を使用する能力は、このような研究の翻訳可能を増加させます。異なる異種移植モデルの中では、尾静脈への全身注射は、実行するのが最も簡単です、まだ彼らは、腫瘍細胞の血管内の最初のステップを省略し、成長のプライマリサイトから脱出します。一方^{7-12、orthoto}骨への腫瘍細胞の注射を伴うPICの異種移植、（大腿骨、肋骨）または筋肉は、より技術的に困難なだけでなく、より生物学的に関連するヒト癌のです。 ^13-16しかし、過去には、原発腫瘍の急速な成長に関連した高い罹患率は、多くの場合、転移の開発の前に殺処分を必要としています。本研究では、MRIによって転移進行の長手方向の監視と合わせ、得られた原発腫瘍の切除に続いて腓腹筋への細胞注射の以前に確立されたモデルを採用しました。筋肉や骨- -脛骨に近接した腓腹筋に^17,18このような注射は、2つの固有のES環境において腫瘍増殖を可能にし、一般的にヒトでの影響を受けた場所に遠隔転移が生じます。 ¹⁸これにより、このモデルが正確に疾患の進行中に、ES患者に発生する転移プロセスを再現します。

テント ">下側後肢における原発腫瘍の局在化は、腫瘍組織への血液供給の正確な制御を容易にする。大腿動脈結紮（FAL）が遠位領域への血流を遮断するために、血管新生の研究に利用されるよく確立された技術であります脚部と虚血に応答して、組織の血管新生を調査する^。19,20重要なのは、血流の初期低下が担保血管の開口部と、ほぼ3日FAL後に観察される組織の再灌流が続いている^。20このように、腫瘍を有する肢で実行、このモデルは、急速に成長する腫瘍で自然に発生する低酸素/再灌流イベントを再作成し、新しくオープンした側副血管を経由して下位後肢への灌流の回復による転移性腫瘍細胞の脱出を可能にします^。21腫瘍サイズがある場合に重要なのは、この手順を実行する必要があります（典型的には、腫瘍を有するウシ容量で対照腫瘍における過剰な低酸素症を防止するのに十分に小さいですコントロールとFAL処置群間の腫瘍低酸素のレベルの有意な差を確保し250 mm ³で）、 - 150の梅。

ES待ち時間および転移の頻度の低酸素の影響の長手方向の監視に加えて、このモデルは、組織の収集および原発腫瘍および転移の両方から新たな細胞系の開発を可能にします。重要なことには、以前の研究は、転移由来の細胞株は、腫瘍の播種は、腫瘍細胞の表現型の永久的な変化に関連し、それによって転移プロセスを解読するために、これらの細胞株の使用を検証していることを示す、動物に再導入時に強化転移の可能性を示すことを確立しました。 ^図18は、集合的に、これらのモデルは、現在、低酸素誘導性の転移の経路を識別するために必要な遺伝的および分子分析のために使用することができます。

低酸素症のような様々なトンの悪性度を高めるプロ転移因子でありますumors、我々のモデルは、例えば、骨肉腫および横紋筋肉腫のような自然に手足に発症する他の腫瘍タイプにおける低酸素の役割を調査するためのプラットフォームとして使用することができます。 ^21-23はまた、同様のアプローチは、血液供給の明確に定義された経路と他の解剖学的部位で増殖する悪性腫瘍に適用することができます。最終的に、モデルを変更することができ、その有用性はさらに、個々の研究の必要性に応じて、延長しました。

プロトコル

すべての手順は、ジョージタウン大学施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

同所注射用1.細胞調製

1. 標準条件下での培養ヒトES細胞。ない5匹のマウスの注射のための密集度の70％を超えて約1 15cmの細胞培養プレートを使用します。
   注：この研究のために、SK-ES1細胞は、コラーゲンコートしたプレート上で、15％ウシ胎児血清（FBS）とマッコイの5A培地で培養し、TC71の細胞を、10％FBSおよび1％の4-（2-ヒドロキシエチルを含むRPMI中で培養しました）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）。両方の培地は、抗生物質を補充した - ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシン（100μg/ ml）およびファンギゾン（1μg/ ml）を入れます。
2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いてES細胞を洗浄し、5分間、0.25％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）で70％コンフルエンスでトリプシン処理。
3. 細胞培養メディ付きプレートからES細胞を削除します、その後、室温で200×gで5分間遠心します。再懸濁冷PBS 10mlのES細胞を、次いで、細胞数を数えます。
4. その後、遠心分離機のES室温で200×gで5分間、細胞、および冷PBS 1ml当たり2×10 ^{7（SK-ES1）}または10 ^7（TC71）の細胞で再懸濁します。注射を行いながら、氷上で最終的な細胞懸濁液を保管してください。

腓腹筋へのES細胞の2同所注射

1. 4-6週齢の雌SCID /ベージュマウスを使用してください。
2. ES細胞を注入するために、そっと下後肢の内側を露出させ、マウスを保持し、第四および第五指の間にその左足を安定させます。
3. 28 G 1/2針を用いて、いずれかの腓腹筋に2×10 ^{6（SK-ES1）}または10 ^{6（TC71）ES}細胞（ 図2A）を含んで 、以前に調製した細胞懸濁液を0.1ml注入します。
   注：なお、筋肉内INJの最大音量ectionsこの特定の手順0.1 mlまでの体積の増加が原因で注入高い細胞数が必要であり、通常は0.05 mlです。この手順は、ジョージタウン大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されています。
   1. 脛骨稜/結節の方向に45度の角度 - 腓腹筋に前方に約30の針を挿入します。
   2. それは脛骨稜/結節を触れたら、少し針を撤回。ゆっくりと徐々に圧力を解放するために針を引き抜く、細胞懸濁液を注入します。
4. 苦痛の徴候のための次の24時間かけて注入したマウスを監視します。
   注：動物の取り扱いにはあまり経験を持つ研究者らは、腫瘍細胞注射のためのマウスを麻酔検討する必要があります。いくつかの機関は、安全上の理由から麻酔が必要な場合があります。

3.原発腫瘍の増殖を監視

1. D原発腫瘍の成長を監視しますaily腫瘍の大きさは、所望の体積に達するまで。
   注：現在の研究では250 mm ³でのウシ体積は実験（ 図2B）の出発点として使用しました。このサイズに到達するために腫瘍のため2週間 - 一般的に、それはおよそ1かかります。
   1. その内側 - 外側と前後長を介してデジタルノギスで毎日ふくらはぎのサイズを測定します。
   2. Dは長い直径であり、dは担癌下後肢の短径である3.14をxは式（D XDを^2月6日 ）によるふくらはぎのボリュームを、決定します。
      注： - 50ミリメートル³正常な成体マウスのふくらはぎのサイズは約40です。そのボリュームは、腫瘍の成長にとふくらはぎが主に腫瘍組織で構成され、後の段階で増加します。

腫瘍を有する後肢に低酸素症を誘発するため4.大腿動脈結紮（FAL）

1. CUR：この操作に必要な手術器具を準備VEDや細かい鉗子を指摘し、鉗子、手術用はさみと針ホルダを指摘しました。オートクレーブまたはホットビーズ滅菌器を使用して、手術前にこれらのツールを滅菌します。また、この手術の準備ができて細かい綿棒を持っています。
   注：手順の間に、必要に応じてツールがヒントで再滅菌することをお勧めします。
2. 鎮痛剤を注入し（カルプロフェンは5mg / kg）を皮下（SQ）。検出し、低酸素状態を確認するために、hypoxyprobe-1（ピモニダゾール、60ミリグラム/キログラム）を注入します。
   注：この用量は、マウス当たり1.5ミリグラムに相当し、腹腔内（IP）、PBS中の15 mg / mlでhypoxyprobe溶液0.1mlを注入することによって達成されます。 hypoxyprobeその後、免疫組織化学による動物組織において検出可能死後です。
3. 1 L /分の流速で100％酸素中の5％イソフルラン - 3を含む麻酔導入チャンバー内にマウスを置き。
4. それは、外部刺激に応答しなくなるまで誘導チャンバ内でマウスを残します。それから私から動物を削除しますnduction室。操作面での温暖化パッドの上に配置された滅菌ドレープ上仰臥位で動物を置きます。 0.8 L /分の流速で100％酸素中3％イソフルラン - 1の連続的な流れに接続するためにノーズコーンを使用します。
   1. 角膜の乾燥を防ぐために、それぞれの目に、無菌非薬用の眼軟膏を適用します。徹底的に手術領域を脱毛するためには、せいぜい10秒のための皮膚の上にそれを残して、脱毛クリームを適用します。その後、エタノールプレップパッドを使用して脱毛クリームを拭き取ります。
5. 約45度のマウスの正中線からテープの切れ端で後肢を拡張し、固定します。後肢が安全になると、さらに2回ずつ繰り返し、10％のポビドン/ヨウ素綿棒/ソリューション、エタノール、続いて露出した皮膚を拭いてください。手術手順の残りの部分については、後肢た領域の拡大図を得るために、立体顕微鏡を使用しています。
6. 尖ったピンセットおよび外科ハサミを使用して、SKの切開を行います約1cmの長、中、鼠径部に向かって半ば腿から。生理食塩水で湿らせた上質なコットンの綿棒を使用して、静かに太ももの筋肉を取り巻く皮下脂肪組織を離れて磨きます。
7. 慎重に皮下脂肪組織を通って鈍的切開を介して下層の大腿動脈を明らかにしました。半ば上部転筋の血管系を露出するために傷や手術野を安定させます。
8. 穏やかピアス膜性大腿シースを通って、微細なピンセットを使用して神経血管束を露出させます。細かい鉗子のクリーンセットを使用して、鼠径靱帯の遠位に、脚の付け根に近い近位の位置で大腿静脈や神経から大腿動脈を解剖し、分離します。大腿静脈壁を貫通しないように注意してください。
9. 解剖の後、横方向の回旋大腿動脈（LCFA）の枝に大腿動脈および遠位の下に6-0絹縫合糸のストランドを渡します。ダブルノット（ 図3）を使用して大腿動脈を閉塞します。
10. 6-0ポリプロピレン縫合糸を使用して切開部を閉じます。切開を閉じた後、体液バランスの治療のために温かい生理食塩水のSQ 0.5ミリリットルを注入。回復ケージにドレープ暖かいパッドの上に動物を置き、目を覚ましまで継続的に監視します。
11. 手術後の最初の6時間の間、動物を監視し、3日間毎日の鎮痛剤（カルプロフェン5ミリグラム/キログラム、SQ）を注入します。滅菌はさみを使用して、手術後10日縫合糸を取り外します。

脚切断術5.原発腫瘍切除

注：ふくらはぎのサイズは、対照群のための250ミリメートル³または低酸素グループのFALの3日後に到達したときに、腫瘍を有する下後肢を切断します。

1. 優しく動物を保持しながら、バリカンで骨盤領域に遠位脛骨から腫瘍を有する四肢から毛を剃ります。手続きの前に鎮痛薬（カルプロフェン5ミリグラム/キログラム、SQ）を注入します。
2. 麻酔誘導chの上にマウスを置きます1 L /分の流速で100％酸素中の5％イソフルラン - 琥珀3を含みます。それは、外部刺激に応答しなくなるまで誘導チャンバ内でマウスを残します。そして、誘導チャンバーから動物を削除します。
3. 操作面での温暖化パッドの上に配置された無菌ドレープを右側臥位で動物を置きます。 0.8 L /分の流量で100％酸素中3％ - イソフルラン1の連続的な流れに接続するためにノーズコーンを使用します。角膜の乾燥を防ぐために、それぞれの目に、無菌非薬用の眼軟膏を適用します。
4. 3回繰り返し、10％のポビドン/ヨウ素綿棒/ソリューション、続いてエタノールを使用して手術部位を準備します。無菌手術野を得るために、マウスの上に滅菌ガーゼ（ 例えば 、外科用ドレープ）を適用します。
5. 近位皮膚の鈍的切開と後退が続くミドル大腿周皮膚切開を、作ります。脚部の中央側の内側大腿神経血管椎弓根を露出させ、その後、連結4-0コーティングされた（ポリグラクチン910）吸収性縫合糸材料を使用して、鼠径靱帯の近く。
6. 寛骨大腿の関節への軟部組織の鈍的切開に続いてはさみで筋肉群の半ば大腿切断を実行します。骨カッターを使用して、半ば大腿骨骨切り術を行います。滅菌細かい綿棒または吸収性ゼラチンスポンジを使用して、静かに最小限に抑え、出血を防ぐために、骨切り術部位を押してください。
7. 手術創クリップを使用して覆っている皮膚を閉じ、体液バランスの治療のために温かい生理食塩水SQの0.5ミリリットルを注入。回復ケージにドレープ暖かいパッドの上に動物を置き、目を覚ましまで継続的に監視します。
8. 手術時には、-80℃の液体窒素とストア内の凍結スナップ、RNA、DNAまたはタンパク質の単離のために原発腫瘍から組織サンプルを収集します。初代細胞培養については、セクション9以下で説明するように、この段階で組織サンプルを収集します。組織学およびimmunochemis 10％中性緩衝ホルマリン中の残りの四肢の組織を修正hypoxyprobe-1の検出を含む、試してみてください。
9. 3日間毎日、その後、手術後最初の6時間の間に移動、痛みや食料消費のために動物を監視します。 3日間毎日の鎮痛剤（カルプロフェン5ミリグラム/キログラム、SQ）を注入します。創傷クリップリムーバーを使用して、10日間の切断後に創傷クリップを削除します。

転移の存在6.監視マウス

1. 毎日マウスを観察し、少なくとも週に二回転移の臨床徴候のためにそれらを評価します。
   1. 様々な場所、通常、肩、反対側の脚とジョーに開発塊として提示マクロ転移の存在のために動物を観察します。この目的を達成するために、慎重に頭、首、腋窩領域、および対側後肢を触診します。 MRIスキャンと一緒に腹部膨満を介して内部臓器転移を確認してください。
   2. INDEで剣状突起（胸骨の下端）を押して肺転移の有無を確認してくださいX指。 ²⁴
      注：この圧力は、横隔膜呼吸容量を減少させます。高度な肺転移を有するマウスは、面倒な呼吸によって明らかに呼吸困難の兆候を示しています。
   3. このような中枢神経系への転移を示唆する脚麻痺や運動失調などの神経症状、のために動物を観察します。
   4. 潜在的な疾患進行の指標として、減量のために少なくとも一週間に一度、マウスを監視します。事前手続き重量の15％を超える体重減少を人道的エンドポイントとみなされます。

7磁気共鳴イメージング検出転移に対する（MRI）

1. 所望の時点で転移を検出するために、MRIを実行します。 ¹⁸
   注：現在の研究では、7テスラの水平分光器を使用しました。 MRIは、SK-ES1細胞のためとTC71細胞のための15日目の日15および35後の切断で行いました。
2. 麻酔誘導chambeにマウスを置きます30％の酸素および70％一酸化二窒素の混合ガス中の3％イソフルラン - 1を含むR。
3. それは、外部刺激に応答しなくなるまで誘導チャンバ内でマウスを残します。そして、誘導チャンバーから動物を削除します。
4. 1.5％イソフルランと30％亜酸化窒素の連続投与と呼吸と温度monitorizationで定位ホルダーに麻酔をかけたマウスを転送します。角膜の乾燥を防ぐために、それぞれの目に、無菌非薬用の眼軟膏を適用します。画像動物のいずれかをそれぞれ、全身または脳イメージングのための40または23ミリメートルブルカーマウスボリュームコイルインチ
5. TR = 3000ミリ秒、TE = 24ミリ秒、マトリックス= 256、FOV = 4.35 X 3.0センチ、スライス厚= 0.5ミリメートル、RAREファクター= 4、平均値= 4. ^18：2次元、T2強調RAREシーケンスを使用します
6. 暖かい回復ケージに動物を置き、目を覚ましまで継続的に監視します。
   注：麻酔の浅い面が使用されているので、マウスは急速に回復します。
7. 麻酔の悪影響がないことを確認するために、イメージング後の最初の6時間の間に動物を監視します。

8.安楽死と剖検

1. MRIおよび/または疾患の進行の臨床症状によって検出可能な転移を有する本動物に一度、マウスを安楽死させます。
   注：現在の研究では、マウスはそれぞれ、日50およびSK-ES1とTC71異種移植片を有する動物のための25のポスト切断で屠殺しました。いくつかのケースでは、以前の安楽死は、高い転移の負担に必要でした。
2. （ -安楽死室容積/分の30％の10でCO _2）/分で1.5 Lに_{CO 2}に暴露することにより、マウスを安楽死させます。動物の死を確保するために、CO ₂の暴露後に頸椎脱臼を行います。
3. 70％エタノールでマウス全体をスプレーし、層流フード内に配置します。採血TUに1mlシリンジと転送に25 G 1/2針を使用して、心臓穿刺により血液を採取EDTAの2ミリグラムを含有します。
4. 脾臓、副腎、卵巣、腎臓、肝臓、肺、脳、右脚、上腕骨や背骨だけでなく、他の場所に存在する巨視的な転移の両方から骨髄：以下の組織を収集します。 ^25,26
5. hypoxyprobe-1の検出を含む、組織学および免疫化学、10％中性緩衝ホルマリン中で各組織の半分を修正しました。スナップは、RNA、DNAまたはタンパク質の単離のために-80℃で保存した後、液体窒素中で他の半分を凍結します。以下のセクション9に記載されるように、一次細胞培養^25,26は 、組織サンプルを収集します。

9.初代細胞培養

1. 初代細胞培養を行うためには、層流フード内で無菌条件下で切断肢（上記のセクション5）から、または剖検（上記セクション8）の間に組織を解剖。
2. 、ペニシリン（200単位/ ml）を補充した同所注射用細胞株のための細胞培養培地に適切に調製ストレプトマイシン（200 / mlの）、ファンギゾン（を1μg/ ml）を、0.2％のマイコプラズマ予防的抗生物質。 6 cmの細胞培養プレートに初代培養培地の2.5ミリリットルを置きます。
3. 原発腫瘍または転移からの生存腫瘍組織領域を選択し、滅菌したハサミを使用して、各2〜3ミリメートルで、2〜3のセグメントを分離します。
   注：生存腫瘍組織は、通常、腫瘍の縁に見出され、そのピンクまたは赤みを帯びた色、かなりの光沢及び総合的なウェット出現により壊死を区別することができます。これとは対照的に、壊死組織は、一般的に、腫瘍の中心に見られ、鈍い、安っぽい外観と白っぽい/クリーム色の塊として現れます。 ²⁷
4. ステップ9.2で説明した初代培養培地を含む6 cmの細胞培養プレートに分離されたセグメントを転送します。
5. セクション1（注）および9.2に記載されているように標準的な条件下で培養細胞、。 ^18,28 WH組織片から生じる細胞性伸長のための培養をチェックICHは、数日以内に観察されるはずです。細胞がコンフルエントに達したら、トリプシン処理し、標準的な細胞培養技術に従って、それらを伝播します。
   注：一次細胞培養物は、その後、前述のように、制御および低酸素性腫瘍由来の細胞、並びにそれらの分子構造の成長および転移特性を評価するために使用することができます。 ¹⁸

結果

腓腹筋へのES細胞の注入後、原発腫瘍が250ミリメートル³のふくらはぎのサイズに成長することが許可されている（ 図1、2）。それぞれ、SK-ES1異種移植片のためTC71 20-25日間、15日間 - 腫瘍は、通常、このボリュームに到達するために必要な時間は、10の範囲です。 250 mm ³で展示内因性低酸素症の比較的低レベルのウシ体積における腫瘍はhypox...

ディスカッション

腫瘍が250ミリメートル³のふくらはぎのボリュームに達したときに切断が続く後肢に開発することが許可されている対照群、および低酸素曝露群で腫瘍-我々のモデルは、2つの実験群における転移の比較を含みます軸受後肢は3日後に切断、続いて、同じ音量でFALに供されます。対照腫瘍と比較して、これらの実験でFAL処理された腫瘍は、少し遅れて切断されているにもかかわらず、そ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells	ATCC
TC71 Human ES cells			Kindly provided from Dr. Toretsky
McCoy's 5A (modified) Medium	Gibco by Life Technologies	12330-031
RPMI-1640	ATCC	30-2001
PBS	Corning Cellgro	21-040-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500mL
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life Technologies	25200-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco by Life Technologies	15140-122
Fungizone® Antimycotic	Gibco by Life Technologies	15290-018
MycoZap™ Prophylactic	Lonza	VZA-2032
Collagen Type I Rat tail high concetration	BD Biosciences	354249
SCID/beige mice	Harlan or Charles River	250 (Charles River) or 18602F (Harlan)
1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle	BD	329424
Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP)	Hospira, INC	NDC 0409-7984-37
Digital calipers	World Precision Instruments, Inc	501601
Surgical Tools	Fine Science Tools
Rimadyl (Carprofen) Injectable	Zoetis
Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid)	HPI, Inc	HP-100mg
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg)	HPI, Inc	CCI-103F-250mg
Povidone-iodine Swabstick	PDI	S41350
Sterile alcohol prep pad	Fisher HealthCare	22-363-750
LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment)	Major Pharaceuticals	NDC 0904-5168-38
VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56617-014
Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade	Oster	078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade)
Nair Lotion with baby oil	Church & Dwight Co., Inc.
Silk 6-0	Surgical Specialties Corp	752B
Prolene (polypropylene) suture 6-0	Ethicon	8680G
Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0	Ethicon	J386H
Fisherbrand Applicators (Purified cotton)	Fisher Scientific	23-400-115
GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4	Pfizer Pharmaceutical	9039605
Autoclip Wound Clip Applier	BD	427630
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Autoclip remover	BD	427637
Aound clip	BD	427631
MRI 7 Tesla	Bruker Corporation
Paravision 5.0 software	Bruker Corporation
CO2 Euthanasia system	VetEquip
25 G 5/8 Needle (for heart-puncture)	BD	305122
0.1 ml syringe (for heart-puncture)	Terumo	SS-01T
K3-EDTA Micro tube 1.3 ml	Sarstedt	41.1395.105
10% Neutral Buttered Formalin	Fisher Scientific	SF100-4