Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli

Özet

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

Özet

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm³. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

Giriş

Ewing sarkomu (ES) çocukları ve ergenleri etkileyen agresif bir kanseridir. ¹ tümörler genellikle bacaklarda, yumuşak dokular ve kemikleri de gelişebilir. metastaz varlığı ES hastalar için tek ve en güçlü kötü prognostik faktör iken, onların gelişimini altında yatan mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. ² tümör hipoksi ES ilerlemesinde rol birkaç faktörlerden biridir. ES hastalarda, tümör dokusu içinde perfüze olmayan alanlarının varlığı kötü prognoz ile ilişkilidir. ³ in vitro, hipoksi ES hücrelerinin invazivliğini artırır ve pro-metastatik genlerin ifade tetikler. ^4-6 Bununla birlikte, kanıt bu satırları rağmen, hipoksi kaynaklı ES ilerlemesi ve yayılması için doğrudan kanıt var. Ayrıca, bilinmeyen hipoksi şu anda bu tür etkiler uygular hangi mekanizmalar. Dolayısıyla, biz in vitro verileri ve klinik glikozu mevcut arasındaki boşluğu doldurmak için bir in vivo model oluşturdukyenilikçiliklere. Bu model sistemi, ex vivo olarak, patolojik ve moleküler analizleri (Şekil 1) ile kombinasyon halinde, in vivo olarak tümör ilerlemesi ve metastaz takip manyetik rezonans görüntüleme (MRI) kullanılarak, doğal ortamında oluşan tümör üzerindeki hipoksiye doğrudan test sağlar.

ES yerleşik bir transgenik modeli mevcut olduğundan, bu tümörlerin metastatik özelliklerine in vivo çalışmalar immün sistemi baskılanmış farelere insan hücrelerinin enjeksiyonu güveniyor. immünolojik engelli hayvanların kullanımı hastalığın ilerlemesi üzerinde bağışıklık sisteminin etkisini hafife olsa da, insan hücrelerini kullanma yeteneği bu tür çalışmaların çevirilebilirlik artırır. Farklı ksenograft modelleri arasında, kuyruk damar içine sistemik enjeksiyonlar gerçekleştirmek için en kolay, henüz onlar tümör hücre intravazasyonunda ilk adımları ihmal ve büyümenin birincil sitesinden kaçmak. Öte ^{yandan, 7-12,} orthoto kemikler (femur, kaburga) ya da kas içine tümör hücrelerinin enjekte içeren pic Xenografting, biyolojik olarak daha insan kanser ile ilgili daha teknik açıdan zorlayıcı, ama aynı zamanda. Metastaz gelişmeden önce ^13-16 Bununla birlikte, geçmişte, primer tümörlerin hızlı büyüme ile ilişkili yüksek morbidite genellikle gerekli kılmıştır hayvan ötenazi. Bu çalışmada, biz MRG ile metastatik ilerlemesi boyuna izlenmesi ile birlikte ortaya çıkan primer tümörün eksizyonu takiben gastroknemius kasının içine hücre enjeksiyonu, önceden belirlenmiş bir model kullandı. Kaslar ve kemikler - - tibia yakın gastroknemius kas içine ^17,18 tür enjeksiyonlar iki doğal ES ortamlarında tümör büyümesi için izin ve tipik insanlarda etkilenen yerlere uzak metastaz ile sonuçlanır. ¹⁸ Böylece, bu model doğru hastalığın ilerlemesi sırasında ES hastalarda görülen metastatik süreçleri tartışıldı.

tert "> düşük hindlimb birincil tümörlerin lokalizasyonu, tümör dokusuna kan akımı hassas kontrolünü kolaylaştırır. femoral arter ligasyonu (FAL) uzak bölgelere kan akışını engellemek için anjiyojenez araştırmada kullanılan iyi bilinen bir tekniktir ayak ve iskemi tepki doku vaskülarizasyonu araştırılması. ^19,20 Önemli olarak, kan akımının başlangıç damla yaklaşık olarak 3 gün FAL sonra gözlenen kollateral açma ve reperfüzyonun takip etmektedir. ²⁰ Bu durumda, bir tümör taşıyan ekstremitede yapıldığında, Bu model, hızla büyüyen tümörlerde doğal olarak hipoksi / reperfüzyon olayları yeniden ve yeni açılan kollateral damarlar yoluyla alt hindlimb için perfüzyon restorasyon nedeniyle metastatik tümör hücrelerinin kaçmasını sağlar. ²¹ önemlisi, tümör boyutu olduğunda bu işlem yapılmalıdır tipik olarak tümör taşıyan buzağı VOL'de kontrol tümörlerinin aşırı hipoksi (önleyecek kadar küçükKontrol ve FAL tedavi edilen gruplar arasında, tümör hipoksi düzeylerinde anlamlı farklılıklar sağlanması 250 ^mm3), - 150 ume.

ES süresi için hipoksi etki ve metastaz frekans uzunlamasına izlenmesine ek olarak, bu model, doku toplanması ve primer tümörler ve metastazlar, hem yeni hücre çizgilerinin geliştirilmesine izin verir. Önemli bir şekilde, önceki çalışma metastaz türetilmiş hücre çizgileri, tümör yayılması, tümör sürekli hücre fenotipinde değişiklikler ve böylece metastatik işlemleri deşifre bu hücre çizgilerinin kullanımını geçerli ile ilişkili olduğunu gösteren hayvanlara yeniden yerleştirilmesi sırasında gelişmiş metastatik potansiyelini gösteren karar vermişlerdir. ^18. Toplu olarak, bu model artık hipoksi kaynaklı metastatik yollarının tanımlanması için gerekli olan genetik ve moleküler analiz için kullanılabilir.

hipoksi gibi çeşitli t malignite arttırıcı yanlısı metastatik faktördürumors, bizim model, osteosarkom ve rabdomyosarkomu doğal olarak bacaklarda geliştirmek diğer tümör türleri, hipoksi rolünü araştırmak için bir platform olarak kullanılabilir. ^21-23 Ayrıca, benzer bir yaklaşım, kan akışının iyi tanımlanmış bir yol ile anatomik yerle artan maligniteleri de uygulanabilir. Sonuçta, model modifiye edilebilir ve onun yarar daha bireysel araştırma ihtiyaçlarına bağlı olarak, genişletilmiş.

Protokol

Tüm işlemler, Georgetown Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Ortotopik Enjeksiyonluk 1. Hücre Hazırlanması

1. standart koşullar altında kültür, insan ES hücreleri. değil 5 farelerin enjeksiyon için confluency% 70 aşan yaklaşık bir 15 cm hücre kültürü plakası kullanın.
   NOT: Bu çalışma için, SK-ES1 hücreleri,% 10 FBS ve% 1 4- (2-hidroksietil RPMI kolajen kaplı plakalar ve TC71 hücreleri% 15 fetal sığır serumu (FBS) ile kültürlenmiş McCoy'un 5A ortamı içinde kültüre edildi ) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES). Her iki ortam antibiyotik ile takviye edilmiştir - penisilin (100 birim / ml), streptomisin (100 ug / ml) ve fungizon (1 ug / ml).
2. 5 dakika için% 0.25 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile% 70 izdiham fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) trypsinize ES hücreleri yıkayın.
3. Hücre kültürü medi plakadan ES hücreleri çıkarınA, daha sonra oda sıcaklığında, 200 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj. Yeniden askıya soğuk PBS, 10 ml ES hücreleri ve daha sonra hücre sayısı.
4. Daha sonra santrifüje ES oda sıcaklığında 200 x g'de 5 dakika boyunca hücreler ve askıya tekrar 2 x 10 ⁷ (SK-ES1) ya da soğuk PBS, ml başına 10 ⁷ (TC71) hücre. enjeksiyonları yaparken buz üzerinde nihai bir hücre süspansiyonu tutun.

Gastrocnemius Muscle içine ES hücrelerinin 2. Ortotopik Enjeksiyon

1. 4-6 haftalık dişi SCID / bej fareler kullanın.
2. Embriyonik kök hücrelerin enjekte etmek, nazikçe alt hindlimb medial tarafını açığa fare tuşunu basılı tutun ve dördüncü ve beşinci parmakları arasında sol bacak stabilize.
3. Bir 28 G ½ iğne kullanarak ya gastroknemıus kasına 2 x 10 ⁶ (SK-ES1) ya da 10 ⁶ (TC71) ES hücreleri (Şekil 2A) içeren, daha önce hazırlanan hücre süspansiyonu, 0.1 ml enjekte edilir.
   NOT: Her ne kadar kas içi inj için maksimum sesections enjekte edilen, yüksek hücre sayısı, bu özel işlem için, tipik olarak 0.1 mL gerekli olduğu için hacim artışı 0.05 ml'dir. Bu prosedür Georgetown Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
   1. tibia tepe / tübero- yönünde 45 derecelik bir açı - gastroknemius kas içine öne yaklaşık 30 iğne takın.
   2. tibial tepe / tuberositas dokunduğunda hafifçe iğneyi çıkartın. Yavaşça basıncı kademeli serbest bırakmak için iğne çekilmesi, hücre süspansiyonu çözümü enjekte edilir.
4. sıkıntı belirtileri önümüzdeki 24 saat boyunca enjekte fareler izleyin.
   NOT: Hayvan işlemede daha az deneyime sahip Müfettişler tümör hücresi enjeksiyonları için fareler anestezi düşünmelisiniz. Bazı kurumlar güvenlik nedeniyle anestezi gerekebilir.

3. Birincil Tümör Büyüme İzleme

1. d birincil tümörlerin büyümesini izlemekünlük tümör boyutu istenilen hacim ulaşıncaya kadar.
   NOT: Bu çalışmada, 250 mm ³ buzağı hacmi deney (Şekil 2B) bir başlangıç noktası olarak kullanılmıştır. tümörler bu büyüklüğe ulaşması için 2 hafta - Tipik olarak, yaklaşık 1 sürer.
   1. onun-medial lateral ve ön-arka uzunlukları yoluyla dijital kumpas ile günlük buzağı boyutunu ölçmek.
   2. D uzun çapı ve d tümör taşıyan düşük hindlimb kısa çapı 3.14 x, formül (D xD ^2/6) ile dana hacmini belirler.
      NOT: - 50 mm ³ normal erişkin fare buzağı boyutu yaklaşık 40 olduğunu. Hacim tümörün büyümesi ve baldır esas olarak tümör dokusu oluşacak sonraki aşamalarında artacaktır.

Tümör taşıyan hindlimb hipoksi Başlatmaya 4. Femoral Arter Ligasyonu (FAL)

1. Bu işlem için gerekli cerrahi aletler hazırlayın: curved veya sivri ince forseps, forseps, cerrahi makas ve iğne tutucu çekti. Bir otoklav veya sıcak-boncuk sterilizatör kullanılarak cerrahi öncesi bu araçları sterilize edin. Ayrıca, bu ameliyat için hazır ince pamuklu çubuklarla var.
   NOT: Bu araçlar işlem sırasında gerektiği gibi ucunda yeniden sterilize edilmesi tavsiye edilir.
2. Analjezik ajan (Carprofen 5 mg / kg) deri altından (SQ) enjekte edilir. algılamak ve hipoksi doğrulamak için, hypoxyprobe-1 (pimonidazol, 60 mg / kg) enjekte edilir.
   NOT: Bu doz fare başına 1.5 mg eşittir ve intraperitonal PBS (IP) 'de 15 mg / ml hypoxyprobe çözeltisi 0.1 mL püskürtülmesiyle elde edilir. hypoxyprobe sonra immünohistokimyasal olarak hayvan dokularında saptanabilen postmortem olduğunu.
3. 1 L / dakikalık bir akış hızında% 100 oksijen içinde% 5 izofluran - 3 ihtiva eden bir anestezi indüksiyonu odasında fare yerleştirin.
4. dış uyaranlara tepkisiz kadar indüksiyon odasında fare bırakın. Sonra i hayvan kaldırmaknduction odası. İşletim yüzeyinde bir ısınma pad üstüne yerleştirilen steril bir örtü üzerinde yatar pozisyonda hayvan yerleştirin. 0.8 L / dakikalık bir akış hızında% 100 oksijen içinde% 3 izofluran - 1, sürekli bir akış bağlamak için bir burun konisi kullanın.
   1. kornea kurumasını önlemek için her gözün steril olmayan ilaçlı oftalmik merhem sürün. iyice cerrahi alan atmaktadır için en fazla 10 saniye boyunca cilt üzerinde bırakarak, epilasyon kremi uygulayın. Sonra bir etanol hazırlık takımını kullanarak epilasyon kremi silin.
5. Uzatın ve yaklaşık 45 derecelik fare orta hattan bant parçası ile hindlimb sabitleyin. hindlimb güvenli sonra iki kez daha her tekrarlayarak, etanol, ardından% 10 povidon / iyot çubukla / çözeltisi ile maruz cildinizi silin. cerrahi işlem geri kalanı için, arka bacak bölgesinin büyütülmüş bir görünümünü elde etmek için bir stereo mikroskop kullanımı.
6. sivri forseps ve cerrahi makas kullanarak, sk bir kesi yapmakyaklaşık 1 cm uzunluğunda, içinde, kasık bölgesine doğru orta uyluk. tuzlu ıslatılmış ince pamuklu çubuklarla kullanarak, yavaşça uyluk kas çevreleyen deri altı yağ dokusu uzak fırça.
7. Dikkatle cilt altı yağ dokusu ile künt diseksiyon ile yatan femoral arter ortaya koymaktadır. orta üst adduktor kas damarsal maruz yara ve cerrahi alan stabilize.
8. yavaşça delip membranöz femoral kılıf sayesinde, ince forseps kullanarak nörovasküler demet ortaya çıkarmak. Ince forseps temiz bir set kullanarak incelemek ve inguinal ligament distal kasık yakın proksimal yerde femoral ven ve sinir femoral arter ayırın. femoral ven duvarını delici kaçınmak için dikkatli kullanın.
9. diseksiyon ardından, lateral sirkumfleks femoral arter (LCFA) şubesine femoral arter ve distal altında 6-0 ipek sütür bir iplikçik geçmektedir. Çift düğüm (Şekil 3) kullanılarak femoral arter tıkamak.
10. 6-0 polipropilen sütür ile kesi kapatın. kesi kapattıktan sonra, sıvı dengesi tedavisi için sıcak tuzlu su SQ, 0.5 ml enjekte edilir. kurtarma kafesine bir dökümlü sıcak ped üstüne hayvan koyun ve uyanık kadar sürekli izlemek.
11. Analjezik ajan ameliyat sonrası ilk 6 saat boyunca hayvanlar izlemek ve enjekte (Carprofen 5 mg / kg, SQ) 3 gün süre ile her gün. Dikişler steril makas kullanarak 10 gün sonrası ameliyat çıkarın.

Bacak Amputasyon tarafından 5. Birincil Tümör eksizyonu

NOT: buzağı boyutu kontrol grubu için 250 mm ³ veya hipoksik grup için FAL sonra 3 gün ulaştığında tümör taşıyan alt hindlimb organını.

1. nazikçe hayvanı tutarken saç kesme makineleri ile pelvik bölgeye distal tibia tümör taşıyan uzuv saç tıraş. İşlemden önce analjezik ajan (Carprofen 5 mg / kg, SQ) enjekte edilir.
2. Bir anestezi indüksiyon ch içine fare yerleştirin1 L / dakikalık bir akış hızında% 100 oksijen içinde% 5 izofluran - sarı 3 ihtiva etmektedir. dış uyaranlara tepkisiz kadar indüksiyon odasında fare bırakın. Sonra indüksiyon odasından gelen hayvan çıkarın.
3. İşletim yüzeyinde bir ısınma pad üzerinde yerleştirilen steril bir örtü üzerinde sağ lateral yatar pozisyonda hayvan yerleştirin. 0.8 L / dakikalık bir akış hızında% 100 oksijen içinde% 3 - izofluran 1 sürekli bir akış bağlamak için bir burun konisi kullanın. kornea kurumasını önlemek için her gözün steril olmayan ilaçlı oftalmik merhem sürün
4. 3 kez tekrarlayarak etanol, ardından% 10 povidon / iyot bezi / solüsyonu kullanılarak cerrahi siteyi, hazırlayın. Steril cerrahi alanında elde etmek için fare üzerinde bir steril gazlı bez (örneğin, cerrahi drape) uygulayın.
5. Künt diseksiyon ve proksimal cildin geri çekilmesi ardından orta femur çevresel cilt kesisi, emin olun. bacağın ortalama tarafında medial femoral nörovasküler pedikül Açığa ve ardından Arter4-0 kaplamalı (Polyglactin 910) emilebilir sütür materyali kullanarak inguinal ligament yakın.
6. koksofemoral eklem yumuşak doku künt diseksiyon ardından makas ile kas gruplarının, bir orta-femoral kesiye gerçekleştirin. Bir kemik kesici kullanarak, orta femoral osteotomi gerçekleştirin. steril ince pamuklu bir bez veya bir emilebilir jelatin sünger kullanarak, yavaşça en aza indirmek ve kanamayı önlemek için osteotomi sitesini basın.
7. cerrahi yara klipleri kullanarak örten cilt kapatın ve sıvı dengesi tedavisi için ılık tuzlu su SQ 0.5 ml enjekte edilir. kurtarma kafesine bir dökümlü sıcak ped üstüne hayvan koyun ve uyanık kadar sürekli izlemek.
8. cerrahi üzerine, RNA, DNA veya protein izolasyonu için primer tümörlerden doku örnekleri toplamak -80 ° C'de sıvı nitrojen ve mağaza dondurma oturtun. Aşağıdaki bölümde 9'da tarif edildiği gibi, birincil hücre kültürü için, bu aşamada, doku örnekleri toplamak. histoloji ve immunochemis için% 10 nötr tamponlu formalin kalan uzuv doku Fixhypoxyprobe-1 tespiti de dahil olmak üzere, deneyin.
9. 3 gün boyunca sonra her gün, ameliyat sonrası ilk 6 saat içinde hareket, ağrı ve gıda tüketimi için hayvan izleyin. 3 gün süreyle günlük olarak analjezik madde (Carprofen 5 mg / kg, SQ) enjekte edilir. Bir yara klip çıkarıcı kullanarak amputasyon sonrası yara klipleri 10 gün çıkartın.

Metastazlarının Varlığı 6. İzleme Fareler

1. günlük fareler gözlemlemek ve haftada en az iki kez metastaz klinik belirtileri için onları değerlendirmek.
   1. çeşitli yerlerde, genellikle omuz, kontralateral bacak ve çene geliştirmek kitleler olarak ortaya makrometastazı varlığını hayvanları gözlemlemek. Bu amaçla, dikkatlice baş, boyun ve koltuk altı bölgeleri ve kontralateral hindlimb palpe. MR tarama ile birlikte karın şişliği yoluyla iç organ metastazları kontrol edin.
   2. inde ile xiphoid süreci (sternum alt ucu) tuşuna basarak akciğer metastazlarının varlığı için kontrol edinx parmak. ²⁴
      NOT: Bu basınç diyafram solunum kapasitesini azaltır. ileri evre akciğer metastazları ile Fareler zahmetli nefes alarak kendini solunum sıkıntısı belirtileri gösteriyor.
   3. Böyle merkezi sinir sistemine metastaz düşündüren bacak felç ve ataksi gibi nörolojik semptomların, hayvanları gözlemlemek.
   4. Potansiyel hastalık ilerlemesinin bir göstergesi olarak, kilo kaybı için en az haftada bir kez fareler izleyin. işlem öncesi ağırlığının% 15 aşan vücut ağırlığı kaybı insancıl son nokta olarak kabul edilir.

7. Manyetik Rezonans Görüntüleme algılama Metastazına (MRG)

1. İstenilen zaman noktalarında metastaz MRI gerçekleştirin. ¹⁸
   NOT: Bu çalışmada, 7 Tesla yatay spektrometre kullanıldı. MR günlerde 15 gerçekleştirilen ve SK-ES1 hücreleri ve TC71 hücreleri için günde 15 35 sonrası amputasyon oldu.
2. Bir anestezi indüksiyon Chambe içine fare yerleştirin% 30 oksijen ve% 70 azot oksit bir gaz karışımı içinde% 3 izofluran - 1 içeren R.
3. dış uyaranlara tepkisiz kadar indüksiyon odasında fare bırakın. Sonra indüksiyon odasından gelen hayvan çıkarın.
4. % 1.5 izofluran sürekli yönetim ve% 30 nitröz oksit ile solunum ve sıcaklık monitörizasyonu ile bir stereotaksik tutucu üzerine anestezi fare aktarın. kornea kurumasını önlemek için her gözün steril olmayan ilaçlı oftalmik merhem sürün. Görüntü hayvan ya sırasıyla tüm vücut ya da beyin görüntüleme için 40 veya 23 mm Bruker fare hacmi bobin.
5. TR = 3.000 msn, TE = 24 msn, matris = 256, FOV = 4.35 x 3,0 cm, dilim kalınlığı = 0.5 mm, NADİR faktörü = 4 ve ortalamalar = 4. ^18: iki boyutlu, T2 ağırlıklı NADİR sırasını kullanmak
6. Sıcak bir kurtarma kafeste hayvan koyun ve uyanık kadar sürekli izlemek.
   NOT: anestezi sığ bir düzlem kullanıldığından dolayı fareler hızla iyileşir.
7. anestezi hiçbir yan etkisi olmadığından emin olmak için görüntüleme sonraki ilk 6 saat boyunca hayvan izleyin.

8. Ötanazi ve Nekropsi

1. MR ve / veya hastalığın ilerlemesi klinik semptomlarla saptanabilir metastaz mevcut hayvanların kez fareler Euthanize.
   NOT: Bu çalışmada, fareler günde 50 kurban ve sırasıyla, SK-ES1 ve TC71 ksenograftları taşıyan hayvanlar için 25 sonrası amputasyon. Bazı durumlarda, daha önce ötanazi nedeniyle yüksek metastaz yükü için gerekliydi.
2. (- Ötenazi odası hacim / dk% 30 10'da CO ₂₎ / dk 1.5 L CO ₂ maruz fareler Euthanize. Hayvan ölümü sağlamak için, CO ₂ maruz kaldıktan sonra servikal dislokasyon gerçekleştirin.
3. % 70 etanol ile tüm fare Sprey ve laminer akış kaputu içine yerleştirin. Bir kan toplama tu için 1 ml şırınga ve transfer 25 G ½ iğne kullanılarak kalp delme yoluyla kan toplayınEDTA, 2 mg olması.
4. humeri ve omurga yanı sıra başka yerlerde mevcut makroskobik metastaz hem dalak, böbreküstü bezleri, yumurtalıklar, böbrekler, karaciğer, akciğer, beyin, sağ bacak, kemik iliği: Aşağıdaki dokuları toplayın. ^25,26
5. hypoxyprobe-1 tespiti de dahil olmak üzere histoloji ve immünokimyanın için% 10 nötr tamponlu formalin her doku yarısını sabitleyin. Ek bileşen daha sonra RNA, DNA ya da protein izolasyonu için -80 ° C'de saklayın, sıvı nitrojen içinde, diğer yarısı dondurma. Aşağıdaki bölümde 9'da tarif edildiği gibi, birincil hücre kültürü için ^25,26 doku örnekleri toplamak.

9. Primer Hücre Kültürü

1. Primer hücre kültürü gerçekleştirmek için, bir laminer akış kaputu steril koşullar altında nekropsi (yukarıdaki bölüm 8) sırasında ampute ekstremitenin (yukarıdaki bölüm 5) veya dokuların teşrih.
2. penisilin ortotopik enjeksiyon için kullanılan hücre hattı (200 birim / ml), hücre kültür ortamı uygun olan hazırlanması,streptomisin (200 ug / ml), fungizon (1 ug / ml) ve% 0.2 Mycoplasma profilaktik antibiyotik. 6 cm hücre kültür plakasına primer kültür ortamına 2.5 ml yerleştirin.
3. Primer tümör veya metastaz gelen canlı tümör dokusu alanları seçin ve ardından steril makas kullanılarak her 2-3 mm iki üç segment izole.
   NOT: Canlı tümör dokusu genellikle tümörün kenarlarında bulunan ve pembemsi veya kırmızımsı renkte, belirgin parlaklık ve genel ıslak görünüşü nekroz ayırt edilebilir. Buna karşılık, nekrotik doku yaygın tümör merkezinde görülür ve donuk, sevimsiz bir görünüme sahip bir beyazımsı / krem ​​rengi kitle şeklinde ortaya çıkar. ²⁷
4. Adım 9.2'de tarif edilen primer kültür ortamı içeren bir 6-cm hücre kültürü plakasının izole segmentleri aktarın.
5. standart koşullar altında kültür hücreleri gibi bölüm 1 (NOT) ve 9.2 tarif. ^18,28 wh doku parçaları, kaynaklanan hücresel akıbet için kültür edinIch birkaç gün içinde gözlenmelidir. Hücreler izdiham ulaştıklarında, trypsinize ve standart hücre kültür tekniklerine göre bunları yaymak.
   Not: Birincil hücre kültürü, daha sonra, daha önce tarif edildiği gibi, büyüme ve kontrolü ve hipoksik tümör, hem de moleküler özellikleri elde edilen hücrelerin metastaz özelliklerinin değerlendirilmesi için kullanılabilir. ¹⁸

Sonuçlar

Gastrokinemius kası içine ES hücrelerinin enjeksiyonundan sonra, primer tümörler 250 ^mm3 bir baldır boyutu büyümesine izin verilir (Şekil 1, 2). sırasıyla, SK-ES1 xenogreftler için TC71 20-25 gün 15 gün - tümörler için gerekli zaman bu hacim genellikle 10 arasında değişmektedir ulaşmak için. 250 ^mm3 sergi endojen hipoksi, nispeten düşük düzeyde bir buzağı hacminde tümörleri hypoxybrobe-1 (pimonidazole) göre, (tümör d...

Tartışmalar

Bizim modelimiz iki deney gruplarında metastaz karşılaştırılmasını içerir - tümörler 250 mm ³ bir buzağı hacmine ulaşmıştır üzerine amputasyon ardından hindlimb geliştirmek için izin verilen bir kontrol grubu, ve bir hipoksi maruz grubu, hangi tümöre içinde taşıyan arka bacak 3 gün sonra amputasyon, ardından aynı hacimde FAL tabi tutulur. Kontrol tümörlerine kıyasla bu deneylerde FAL-tedavi edilen tümörler, küçük bir gecikme ile ampute olsa da, onların büyüklük ligasyo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells	ATCC
TC71 Human ES cells			Kindly provided from Dr. Toretsky
McCoy's 5A (modified) Medium	Gibco by Life Technologies	12330-031
RPMI-1640	ATCC	30-2001
PBS	Corning Cellgro	21-040-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500mL
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life Technologies	25200-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco by Life Technologies	15140-122
Fungizone® Antimycotic	Gibco by Life Technologies	15290-018
MycoZap™ Prophylactic	Lonza	VZA-2032
Collagen Type I Rat tail high concetration	BD Biosciences	354249
SCID/beige mice	Harlan or Charles River	250 (Charles River) or 18602F (Harlan)
1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle	BD	329424
Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP)	Hospira, INC	NDC 0409-7984-37
Digital calipers	World Precision Instruments, Inc	501601
Surgical Tools	Fine Science Tools
Rimadyl (Carprofen) Injectable	Zoetis
Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid)	HPI, Inc	HP-100mg
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg)	HPI, Inc	CCI-103F-250mg
Povidone-iodine Swabstick	PDI	S41350
Sterile alcohol prep pad	Fisher HealthCare	22-363-750
LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment)	Major Pharaceuticals	NDC 0904-5168-38
VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56617-014
Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade	Oster	078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade)
Nair Lotion with baby oil	Church & Dwight Co., Inc.
Silk 6-0	Surgical Specialties Corp	752B
Prolene (polypropylene) suture 6-0	Ethicon	8680G
Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0	Ethicon	J386H
Fisherbrand Applicators (Purified cotton)	Fisher Scientific	23-400-115
GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4	Pfizer Pharmaceutical	9039605
Autoclip Wound Clip Applier	BD	427630
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Autoclip remover	BD	427637
Aound clip	BD	427631
MRI 7 Tesla	Bruker Corporation
Paravision 5.0 software	Bruker Corporation
CO2 Euthanasia system	VetEquip
25 G 5/8 Needle (for heart-puncture)	BD	305122
0.1 ml syringe (for heart-puncture)	Terumo	SS-01T
K3-EDTA Micro tube 1.3 ml	Sarstedt	41.1395.105
10% Neutral Buttered Formalin	Fisher Scientific	SF100-4