In - vivo - Modell für die Prüfung von Wirkung von Hypoxie auf die Tumormetastasierung

Zusammenfassung

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

Zusammenfassung

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm³. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

Einleitung

Ewing-Sarkom (ES) ist eine aggressive Krebserkrankung Kindern und Jugendlichen zu beeinträchtigen. ¹ Die Tumoren entwickeln sich in Weichgewebe und Knochen, die üblicherweise in den Gliedern. Während das Vorhandensein von Metastasen für ES Patienten die einzige stärksten negativen prognostischer Faktor ist, bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen ihrer Entwicklung unklar. ² Tumorhypoxie ist eines der wenigen Faktoren in ES Progression beteiligt ist . In ES-Patienten wird das Vorhandensein von nicht-durchbluteten Bereichen innerhalb des Tumorgewebes mit einer schlechten Prognose verbunden. ³ In vitro erhöht Hypoxie Invasivität von ES - Zellen und löst die Expression von pro-metastatischen Gene. ^4-6 Doch trotz dieser Beweislinien, keinen direkten Beweis für Hypoxie-induzierte ES Progression und Verbreitung besteht. Darüber hinaus sind die Mechanismen, durch die Hypoxie solche Wirkungen ausübt, sind derzeit nicht bekannt. Daher haben wir ein in vivo - Modell zu füllen die Lücke zwischen den bestehenden In - vitro - Daten und der klinischen Obser erstelltvationen. Dieses Modellsystem ermöglicht die direkte Prüfung der Wirkungen von Hypoxie auf Tumoren in ihrer natürlichen Umgebung auftritt, Magnetresonanz - Bildgebung (MRI) der Tumorprogression und Metastasierung in vivo in Kombination mit ex vivo pathologischen und molekularen Analysen (Abbildung 1) zu folgen.

Da keine etablierte transgenes Modell ES derzeit verfügbar ist, die in vivo Studien an metastatischen Eigenschaften dieser Tumoren beruhen auf Injektionen von menschlichen Zellen in immungeschwächten Mäusen. Während die Verwendung von immunologisch beeinträchtigt Tiere auf dem Fortschreiten der Krankheit, die Auswirkungen des Immunsystems unterschätzen können, erhöht die Fähigkeit, menschliche Zellen zu verwenden Translatierbarkeit solcher Studien. Unter den verschiedenen Xenotransplantatmodellen, sind systemische Injektionen in die Schwanzvene am einfachsten zu führen, aber sie lassen Sie die ersten Schritte der Tumorzelle intravasation und die Flucht aus dem primären Standort des Wachstums. ^12.07 Auf der anderen Seite, orthoto pic xenografting, die Injektionen von Tumorzellen in Knochen (Femur, Rippe) oder Muskeln betrifft, ist technisch anspruchsvoll, aber auch mehr biologisch relevanten menschlichen Krebs. ^13-16 jedoch in der Vergangenheit die hohe Morbidität mit raschem Wachstum von primären Tumoren ist oft notwendig Einschläferung vor Metastasierung Entwicklung. In dieser Studie verwendeten wir ein zuvor etabliertes Modell von Zellinjektionen in den Gastrocnemius-Muskel durch Exzision des resultierenden primären Tumors gefolgt mit Längs Überwachung des metastasierten Progression durch MRT kombiniert. ^17,18 Solche Injektionen in gastrocnemius Muskel in der Nähe der Tibia erlauben für das Tumorwachstum in zwei natürlichen ES Umgebungen - Muskeln und Knochen - und in Fernmetastasen zu Orten führen in der Regel bei Menschen betroffen. Dadurch ^18, ist dieses Modell rekapituliert genau die metastatische Vorgänge im ES Patienten während der Progression der Erkrankung.

Zelt "> Die Lokalisierung von Primärtumoren in der unteren hindlimb erleichtert auch die präzise Steuerung der Blutversorgung der Tumorgewebe. A. femoralis Ligatur (FAL) eine gut etablierte Technik, die in Angiogenese Forschung verwendet wird, ist der Blutfluss zu den distalen Regionen zu Block von das Bein und Gewebedurchblutung in Reaktion auf Ischämie untersuchen. ^19,20 Wichtig ist , dass der anfängliche Abfall des Blutfluss wird durch Sicherheiten Gefäßöffnung und Gewebe Reperfusion beobachtet ca. 3 Tage nach FAL gefolgt. ²⁰ wenn also in einem tumortragenden Glied durchgeführt, dieses Modell erschafft Hypoxie / Reperfusion Ereignisse , die natürlich in schnell wachsenden Tumoren und ermöglicht das Entweichen von metastasierenden Tumorzellen aufgrund Wiederherstellung der Perfusion an der unteren hinteren Gliedmaßen über neu eröffneten Kollateralen auftreten. ²¹ ist wichtig, dass dieses Verfahren durchgeführt werden , wenn die Tumorgröße ist klein genug, um eine übermäßige Hypoxie in Kontrolltumoren (typischerweise bei dem tumortragenden calf vol zu verhindernume von 150 bis 250 mm ^3), signifikante Unterschiede in der Höhe der Tumorhypoxie zwischen Kontrolle und FAL behandelten Gruppen zu gewährleisten.

Zusätzlich zur Längs Überwachung der Auswirkung der Hypoxie auf ES-Latenz und der Häufigkeit von Metastasen dieses Modell ermöglicht auch die Sammlung von Geweben und die Entwicklung neuer Zelllinien von sowohl primären Tumoren und Metastasen. Wichtig ist, dass festgestellt früheren Arbeiten, dass Metastasen abgeleiteten Zelllinien bei Wiedereinführung an Tiere verbessert metastatischen Potential aufweisen, was darauf hinweist, dass die Tumorausbreitung mit dauerhaften Veränderungen in der Tumorzelle Phänotyp assoziiert ist, und dadurch die Verwendung dieser Zelllinien Validierung der metastatischen Prozessen zu dechiffrieren. Insgesamt ¹⁸ Diese Modelle können nun für die genetische und molekulare Analysen zur Identifizierung von Hypoxie-induzierte metastasierendem Wege erforderlich verwendet werden.

Da Hypoxie ist ein Pro-metastatischen Faktor die Bösartigkeit verschiedener t Verbesserungumors, unser Modell kann als Plattform genutzt werden, um die Rolle von Hypoxie in anderen Tumorarten zu untersuchen, die von Natur aus in den Gliedern, wie Osteosarkom und Rhabdomyosarkom entwickeln. ^21-23 Darüber hinaus kann ein ähnlicher Ansatz zu Malignitäten mit einer gut definierten Weg der Blutversorgung wächst in anderen anatomischen Stellen aufgebracht werden. Letztlich kann das Modell modifiziert und ihre Nutzbarkeit weiter ausgebaut werden, je nach individuellen Forschungsbedarf.

Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Georgetown University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Zellpräparation für Orthotopische Injections

1. Kultur humanen ES-Zellen unter Standardbedingungen. Verwenden Sie etwa eine 15-cm-Zellkulturplatte nicht mehr als 70% der Konfluenz von mehr als für die Injektion von 5 Mäusen.
   HINWEIS: Für diese Studie wurden SK-ES1-Zellen wurden in McCoy 5A-Medium mit 15% fötalem Rinderserum (FBS) auf Kollagen beschichteten Platten und TC71-Zellen in RPMI kultiviert wurden mit 10% FBS und 1% 4- (2-hydroxyethyl ) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES). Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 ug / ml) und Fungizon (1 ug / ml) - Beide Medien wurden mit Antibiotika ergänzt.
2. Waschen Sie die ES-Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und trypsinize bei 70% Konfluenz mit 0,25% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für 5 min.
3. Entfernen Sie die ES-Zellen von der Platte mit Zellkultur media, dann für 5 min Zentrifugation bei 200 xg bei Raumtemperatur. Re-suspend die ES-Zellen in 10 ml kaltem PBS und dann die Anzahl der Zellen zu zählen.
4. Zentrifuge ES Zellen 5 min bei 200 xg bei Raumtemperatur und dann erneut zu suspendieren bei 2 x 10 ⁷ (SK-ES1) bzw. 10 ⁷ (TC71) Zellen pro ml in kaltem PBS. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, während Injektionen durchgeführt wird.

2. Orthotopische Injektion von ES-Zellen in Gastrocnemius Muskel

1. Verwenden Sie 4-6 Wochen alten weiblichen SCID / beige Mäuse.
2. Um ES-Zellen injizieren, sanft die Maus halten und zu stabilisieren, seine linke Bein zwischen dem vierten und fünften Finger, die mediale Seite des unteren hinteren Gliedmaßen ausgesetzt wird.
3. Unter Verwendung einer 28 G ½ Nadel injizieren 0,1 ml der zuvor hergestellten Zellsuspension , die entweder 2 × 10 ⁶ (SK-ES1) oder 10 ⁶ (TC71) ES - Zellen in den Gastrocnemius - Muskel enthält (Abbildung 2A).
   Hinweis: Obwohl maximale Lautstärke für die intramuskuläre injexionen beträgt typischerweise 0,05 ml, für dieses bestimmte Verfahren auf 0,1 ml der Volumenzunahme aufgrund der hohen Anzahl von Zellen injiziert notwendig ist. Dieses Verfahren wurde von der Georgetown University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.
   1. Führen Sie die Nadel in die gastrocnemius Muskel nach vorn bei etwa eine 30 - 45-Grad-Winkel in Richtung des Tibiakante / Tuber.
   2. Etwas die Nadel zurückziehen, sobald sie die Tibiakante / Tuber berührt. Langsam injizieren Lösung die Zellsuspension, allmählich die Nadel herausgezogen Druck abzulassen.
4. Überwachen Sie die injizierten Mäusen in den nächsten 24 Stunden für Anzeichen von Leiden.
   HINWEIS: Die Ermittler mit weniger Erfahrung im Umgang mit Tieren sollte anesthetizing Mäuse für die Tumorzellinjektionen in Betracht ziehen. Einige Einrichtungen können Anästhesie aus Sicherheitsgründen erforderlich.

3. Überwachung der Primärtumorwachstum

1. Überwachen Sie das Wachstum von Primärtumoren daily, bis die Tumorgröße erreicht das gewünschte Volumen.
   HINWEIS: In der aktuellen Studie, ein Kalb Volumen von 250 mm ³ wurde als Startpunkt des Experiments verwendet wird (2B). Typischerweise dauert es ca. 1 - 2 Wochen für die Tumore dieser Größe zu erreichen.
   1. Messen Sie die Wadengröße täglich mit digitalen Sätteln über seine medial-lateral und anterior-posterioren Längen.
   2. Bestimmen die calf Volumen durch die Formel (D xd ^2/6) x 3,14, wobei D der längere Durchmesser und d der kürzere Durchmesser der Tumor-tragenden unteren hinteren Gliedmaßen.
      HINWEIS: Die Größe des normalen erwachsenen Maus calf ist von etwa 40 - 50 mm ^3. Sein Volumen wird aufgrund des Tumorwachstums zu erhöhen und bei den späteren Phasen das Kalb wird in erster Linie von Tumorgewebe bestehen.

4. Femoralarterie Ligatur (FAL) zum Induzieren Hypoxie in dem Tumor-tragenden hinteren Gliedmaßen

1. Bereiten Sie die chirurgische Instrumente für diesen Vorgang benötigt: curved oder spitz feinen Pinzette, spitz Pinzetten, chirurgische Scheren und Nadelhalter. Sterilisieren Sie diese Tools vor der Operation einen Autoklaven oder einen Wärmetönungs Sterilisator verwenden. Zusätzlich haben, Wattestäbchen feine bereit für diese Operation.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, dass die Werkzeuge an den Spitzen erneut sterilisiert werden, da während des Verfahrens erforderlich ist.
2. Injizieren Analgetikum (Carprofen 5 mg / kg) subkutan (SQ). Zur Erkennung und Hypoxie bestätigen, injizieren hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 mg / kg).
   ANMERKUNG: Diese Dosis entspricht 1,5 mg pro Maus und wird erreicht, indem 0,1 ml einer 15-mg / ml-Lösung in PBS hypoxyprobe Injektion intraperitoneal (IP). Die hypoxyprobe ist dann nachweisbar Obduktion in tierischen Geweben durch Immunhistochemie.
3. Platzieren Sie die Maus in einer Anästhesieinduktionskammer enthält, 3 bis 5% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l / min.
4. Lassen Sie die Maus in die Induktionskammer, bis er nicht mehr reagiert auf äußere Reize ist. Dann entfernen Sie das Tier aus dem induction Kammer. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einem sterilen Tuch auf einem wärmenden Pad auf der Arbeitsfläche platziert. Verwenden, um einen Nasenkonus an einen kontinuierlichen Fluss von 1 zu verbinden - 3% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Flussrate von 0,8 L / min.
   1. Bewerben sterile nicht-medizinischen Augensalbe für jedes Auge Hornhaut Austrocknen zu verhindern. Um gründlich den OP-Bereich enthaaren, gelten Enthaarungscreme, es auf der Haut zu verlassen für nicht mehr als 10 Sekunden. die Enthaarungscreme mit einem Ethanoltupfer abwischen.
5. Verlängern und sichern Sie den hinteren Gliedmaßen mit einem Stück Klebeband etwa 45 Grad von der Mittellinie der Maus. Sobald die hinteren Gliedmaßen sicher ist, wischen Sie die betroffene Hautpartien mit 10% Povidon / Iod-Tupfer / Lösung, gefolgt von Ethanol, je zwei weitere Male wiederholen. Für den Rest des chirurgischen Eingriffs, mit einem Stereomikroskop eine vergrößerte Ansicht des hinteren Gliedmaßen Region zu erhalten.
6. Mit spitzen Pinzette und chirurgische Scheren, machen einen Einschnitt des skin ca. 1 cm lang, von der Mitte des Oberschenkels in Richtung der Leistengegend. Mit Kochsalzlösung befeuchtet feinen Wattestäbchen, Bürste sanft subkutanes Fett Gewebe um den Oberschenkelmuskel entfernt.
7. Vorsichtig zeigen die darunter liegende Femoralarterie über stumpfe Präparation durch das subkutane Fettgewebe. Stabilisieren Sie die Wunde und OP-Feld das Gefäßsystem des mittleren oberen Schließmuskel zu belichten.
8. Mit einer feinen Pinzette vorsichtig stechen durch die membranartige Oberschenkelscheide das Gefäßnervenbündel zu belichten. Mit einem sauberen Satz von feinen Pinzette, sezieren und die Oberschenkelarterie aus der Oberschenkelvene und Nerven in der Nähe der Leiste, distal des Leistenbandes am proximalen Stelle trennen. Seien Sie vorsichtig, Einstechen in die Oberschenkelvene Wand zu vermeiden.
9. Nach Präparation, passieren einen Strang von 6-0 Seidennaht unterhalb der Femoralarterie und distal der Zweig der A. circumflexa femoris lateralis (LCFA). Verschließen Sie die Femoralarterie mit Doppelknoten (Abbildung 3).
10. Schließen Sie den Schnitt mit 6-0 Polypropylen Nähten. Nach dem Schnitt zu schließen, SQ 0,5 ml warmem Salzlösung für den Flüssigkeitshaushalt Therapie injizieren. Legen Sie das Tier auf einem drapierten warmen Pad im Erholungskäfig und überwachen kontinuierlich bis wach.
11. Überwachen Sie die Tiere während der ersten 6 Stunden nach der Operation und injizieren das Analgetikum (Carprofen 5 mg / kg, SQ) jeden Tag für 3 Tage. Entfernen Nähte 10 Tage nach der Operation mit einer sterilen Schere.

5. Primärtumor Exzision von Beinamputation

HINWEIS: amputieren die tumortragenden unteren hinteren Gliedmaßen , wenn das Kalb Größe 250 mm ³ für die Gruppensteuerung erreicht oder 3 Tage nach FAL für die hypoxische Gruppe.

1. Shave Haar aus dem tumortragenden Glied aus der distalen Tibia auf den Beckenbereich mit Haarschneidemaschinen, während sanft um das Tier zu halten. Spritzen Sie das Analgetikum (Carprofen 5 mg / kg, SQ) vor dem Eingriff.
2. Platzieren Sie die Maus in eine Narkoseeinleitung chamber enthaltend 3 bis 5% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l / min. Lassen Sie die Maus in die Induktionskammer, bis er nicht mehr reagiert auf äußere Reize ist. Dann entfernen Sie das Tier aus der Induktionskammer.
3. Legen Sie das Tier in der rechten Seitenlage auf einem sterilen Tuch gelegt auf eine Erwärmung Pad auf der Bedienoberfläche. Verwenden, um einen Nasenkonus an einen kontinuierlichen Fluss von Isofluran zu verbinden, von 1 bis 3% in 100% Sauerstoff bei einer Flussrate von 0,8 L / min. Bewerben sterile nicht-medizinischen Augensalbe für jedes Auge Hornhaut Austrocknen zu verhindern
4. Bereiten Sie die Operationsstelle mit 10% Povidon / Iod-Tupfer / Lösung, gefolgt von Ethanol, wiederholen 3 mal. Tragen Sie eine sterile Gaze (zB Operationstuch) über die Maus , um einen sterilen OP - Bereich zu erhalten.
5. Machen Sie eine mittlere Oberschenkelumfangshautschnitt, gefolgt durch stumpfe Dissektion und Einfahren der proximal Haut. Setzen Sie die mediale Oberschenkelneurovaskuläre Pedikel auf der Mittelseite des Beines, und dann ligierenin der Nähe des Leistenbandes 4-0 beschichtet (Polyglactin 910) resorbierbares Nahtmaterial verwendet wird.
6. Führen Sie eine Mitte Oberschenkeldurchtrennung von Muskelgruppen mit einer Schere, durch stumpfe Präparation von Weichgewebe an der Hüftgelenk gefolgt. Mit Hilfe eines Knochenschneider, führen Sie eine Mitte Femurosteotomie. Mit einem sterilen feinen Wattestäbchen oder eine resorbierbare Gelatineschwamm, drücken Sie sanft die Osteotomie zu minimieren und zu verhindern, Blutungen.
7. Schließen Sie die darüber liegende Haut mit chirurgischen Wundklammern und injizieren 0,5 ml warmem Salz SQ für den Flüssigkeitshaushalt Therapie. Legen Sie das Tier auf einem drapierten warmen Pad im Erholungskäfig und überwachen kontinuierlich bis wach.
8. Nach der Operation, Gewebeproben von primären Tumoren für RNA, DNA oder Proteinisolierung, Snap freeze in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C zu sammeln. Für das primäre Zellkultur, Gewebeproben bei diesem Schritt zu sammeln, wie in Abschnitt 9 unten beschrieben. Befestigen Sie die restlichen Gliedmaßen Gewebe in 10% neutral gepuffertem Formalin für die Histologie und immunochemisversuchen, einschließlich hypoxyprobe-1-Erkennung.
9. Überwachen Sie die Tiere für die Fortbewegung, Schmerzen und Lebensmittelkonsum während der ersten 6 Stunden nach der Operation, dann jeden Tag für 3 Tage. Spritzen Sie das Analgetikum (Carprofen 5 mg / kg, SQ) täglich für 3 Tage. Entfernen Sie die Wundklammern 10 Tage nach der Amputation eines Wundklammer-Entferner.

6. Überwachung Mäuse für das Vorhandensein von Metastasen

1. Beachten Sie die Mäuse täglich und werten sie für die klinische Anzeichen einer Metastasierung mindestens zweimal pro Woche.
   1. Beachten Sie die Tiere auf die Anwesenheit von Makrometastasen als Massen präsentiert, die an verschiedenen Standorten entwickeln, in der Regel Schultern, kontralateralen Beine und Kiefer. Zu diesem Zweck ertasten vorsichtig Kopf, Nacken und Achselbereiche und kontralateralen hindlimb. Überprüfen Sie für die interne Organmetastasen über Abdomens zusammen mit MRT-Untersuchung.
   2. Überprüfen Sie das Vorhandensein von Lungenmetastasen durch den Xyphoid Pressverfahren (das untere Ende des Brustbeins) mit index Finger. ²⁴
      HINWEIS: Dieser Druck vermindert die Zwerchfellatmung Kapazität. Mäuse, die mit fortgeschrittenen Lungenmetastasen zeigen Anzeichen von Atemnot durch mühsame Atmung manifestiert.
   3. Beachten Sie die Tiere für neurologische Symptome, wie Beinlähmung und Ataxie Metastasen des zentralen Nervensystems hinweist.
   4. Überwachen Sie die Mäuse mindestens einmal pro Woche für Gewichtsverlust, als ein Hinweis auf einen möglichen Krankheitsprogression. Körpergewichtsverlust 15% der vorprozessualen Gewicht von mehr als eine humane Endpunkt betrachtet.

7. Magnetic Resonance Imaging (MRI) zur Erfassung Metastasierung

1. Führen MRT Metastasen in gewünschten Zeitpunkten zu erfassen. ¹⁸
   HINWEIS: In der aktuellen Studie, ein 7-Tesla horizontal Spektrometer verwendet wurde. MRT wurde an den Tagen 15 und 35 nach der Amputation für SK-ES1 Zellen und am Tag 15 für TC71-Zellen durchgeführt.
2. Platzieren Sie die Maus in eine Narkoseeinleitung chamber enthaltend von 1 bis 3% Isofluran in einem Gasgemisch aus 30% Sauerstoff und 70% Distickstoffoxid.
3. Lassen Sie die Maus in die Induktionskammer, bis er nicht mehr reagiert auf äußere Reize ist. Dann entfernen Sie das Tier aus der Induktionskammer.
4. Übertragen Sie die narkotisierten Maus auf einen stereotaktischen Halter mit der Atmung und Temperatur monitorization bei kontinuierlicher Gabe von 1,5% Isofluran und 30% Lachgas. Bewerben sterile nicht-medizinischen Augensalbe für jedes Auge Hornhauttrockenheit zu verhindern. Bild das Tier entweder in einem 40 oder 23 mm Bruker Maus Volumenspule für den ganzen Körper oder Gehirn-Bildgebung sind.
5. Verwenden Sie einen zweidimensionalen, T2-gewichteten RARE - Sequenz: TR = 3000 ms, TE = 24 msec, Matrix = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, Schichtdicke = 0,5 mm, RARE Faktor = 4 und mittelt = 4. ¹⁸
6. Legen Sie das Tier in einem warmen Erholungskäfig und überwachen kontinuierlich bis wach.
   HINWEIS: Die Mäuse erholen sich schnell, da eine flache Ebene der Anästhesie verwendet wird.
7. Überwachen Sie die Tiere während der ersten 6 Stunden nach der Bebilderung, um sicherzustellen, dass es keine negativen Auswirkungen der Anästhesie.

8. Euthanasie und Necropsy

1. Euthanize die Mäuse, sobald die Tiere vorhanden mit Metastasen nachweisbar durch MRI und / oder klinische Symptome der Krankheitsprogression.
   HINWEIS: In der aktuellen Studie wurden die Mäuse an den Tagen 50 und 25 nach der Amputation für Tiere mit SK-ES1 und TC71 Xenotransplantate geopfert sind. In einigen Fällen notwendig war früher Euthanasie aufgrund einer hohen Belastung der Metastasierung.
2. Euthanize die Mäuse durch Exposition ₂ bei 1,5 L / min zu CO (CO ₂ bei 10 bis 30% der Euthanasie Kammer vol / min). Zervikaldislokation nach CO ₂ Exposition gegenüber Tier Tod gewährleisten, führen.
3. Sprühen Sie die gesamte Maus mit 70% Ethanol und legen Sie sie in die Laminarströmungsabzug. Sammeln Sie das Blut durch Herzpunktion eine 25 G ½ Nadel mit einer 1-ml-Spritze und die Übertragung auf eine Blutentnahme mit tumit 2 mg EDTA sein.
4. Sammeln Sie die folgenden Gewebe: Milz, Nebennieren, Ovarien, Nieren, Leber, Lunge, Gehirn, rechtes Bein, das Knochenmark aus beiden humeri und der Wirbelsäule, sowie makroskopische vorhanden Metastasen an anderen Orten. ^25,26
5. Fix Hälfte jedes Gewebe in 10% neutral gepuffertem Formalin für die Histologie und Immun, einschließlich hypoxyprobe-1-Erkennung. Snap-einfrieren, die andere Hälfte in flüssigem Stickstoff, dann bei -80 ° C für RNA, DNA oder Protein Isolation. ^25,26 Für die Primärzellkultur sammeln Gewebeproben , wie in Abschnitt 9 unten beschrieben.

9. Primärzellkultur

1. Zur primären Zellkultur durchführen, sezieren Gewebe aus dem amputierten Extremität (Abschnitt 5) oder während der Obduktion (Abschnitt 8 oben) unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube.
2. Bereiten Zellkulturmedien geeignet für die Zelllinie für die orthotope Injektionen verwendet, ergänzt mit Penicillin (200 Einheiten / ml),Streptomycin (200 ug / ml), Fungizon (1 ug / ml) und 0,2% Mycoplasma prophylaktische Antibiotikum. Platzieren 2,5 ml der primären Kulturmedium in eine 6 cm-Zellkulturplatte.
3. Wählen Sie vitalen Tumorgewebebereiche aus primären Tumoren oder Metastasen, und dann isolieren zwei vor drei Segmente bei 2-3 mm jede sterile Schere.
   HINWEIS: Lebensfähige Tumorgewebe in der Regel an den Rändern des Tumors gefunden wird und kann von Nekrose durch seine rosa oder rötliche Farbe, die wesentlichen Glanz und insgesamt nassen Aussehen unterschieden werden. Im Gegensatz dazu wird Nekrosen häufig im Zentrum des Tumors und präsentiert als weißlicher / Creme Farbmasse mit einem dumpfen, käsig Erscheinung gesehen. ²⁷
4. Übertragen Sie die isolierten Segmente zu einer 6-cm-Zellkulturplatte Primärkulturmedium in Schritt 9.2 beschrieben enthält.
5. Kultur Zellen unter Standardbedingungen, wie in Abschnitt 1 (HINWEIS) und 9.2 beschrieben. ^18,28 Prüfen Sie die Kultur für die zelluläre Auswuchs die sich aus den Gewebestücken, which sollte innerhalb weniger Tage beobachtet werden. Sobald Zellen Zusammenfluß erreichen, trypsinize und propagieren sie nach Standardzellkulturtechniken.
   HINWEIS: Die primäre Zellkultur kann anschließend Wachstum und metastatischen Eigenschaften verwendet werden, der Zellen von Steuerung und hypoxischen Tumoren, sowie deren molekularen Eigenschaften, abgeleitet zu bewerten, wie zuvor beschrieben. ¹⁸

Ergebnisse

Nach der Injektion von ES - Zellen in Gastrocnemius - Muskel, werden die primären Tumoren erlaubt einer Wadengröße von 250 mm ³ (1, 2) zu wachsen. 15 Tage für TC71 bis 20-25 Tage für SK-ES1 Xenotransplantate, bzw. - Die Zeit, die für die Tumoren dieses Volumen typischerweise im Bereich von 10 zu erreichen. Tumoren bei einem Kalb Volumen von 250 mm ³ einen relativ niedrigen Pegel von endogenen Hypoxie (ca. 3% des Tumorgewebes), bezogen auf hypo...

Diskussion

Unser Modell beinhaltet den Vergleich von Metastasen in beiden Versuchsgruppen - eine Kontrollgruppe, wo Tumoren erlaubt sind in der hinteren Gliedmaßen durch Amputation bei Erreichen eines Kalbes Volumen von 250 mm ³ und eine Hypoxie-exponierten Gruppe gefolgt zu entwickeln, in dem die Tumor- Lager hindlimb wird bei gleichem Volumen zu FAL unterworfen, die später von Amputations 3 Tage gefolgt. Auch wenn die FAL-behandelten Tumoren in diesen Experimenten mit einer leichten Verzögerung amputiert werden, zu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells	ATCC
TC71 Human ES cells			Kindly provided from Dr. Toretsky
McCoy's 5A (modified) Medium	Gibco by Life Technologies	12330-031
RPMI-1640	ATCC	30-2001
PBS	Corning Cellgro	21-040-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500mL
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life Technologies	25200-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco by Life Technologies	15140-122
Fungizone® Antimycotic	Gibco by Life Technologies	15290-018
MycoZap™ Prophylactic	Lonza	VZA-2032
Collagen Type I Rat tail high concetration	BD Biosciences	354249
SCID/beige mice	Harlan or Charles River	250 (Charles River) or 18602F (Harlan)
1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle	BD	329424
Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP)	Hospira, INC	NDC 0409-7984-37
Digital calipers	World Precision Instruments, Inc	501601
Surgical Tools	Fine Science Tools
Rimadyl (Carprofen) Injectable	Zoetis
Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid)	HPI, Inc	HP-100mg
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg)	HPI, Inc	CCI-103F-250mg
Povidone-iodine Swabstick	PDI	S41350
Sterile alcohol prep pad	Fisher HealthCare	22-363-750
LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment)	Major Pharaceuticals	NDC 0904-5168-38
VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56617-014
Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade	Oster	078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade)
Nair Lotion with baby oil	Church & Dwight Co., Inc.
Silk 6-0	Surgical Specialties Corp	752B
Prolene (polypropylene) suture 6-0	Ethicon	8680G
Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0	Ethicon	J386H
Fisherbrand Applicators (Purified cotton)	Fisher Scientific	23-400-115
GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4	Pfizer Pharmaceutical	9039605
Autoclip Wound Clip Applier	BD	427630
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Autoclip remover	BD	427637
Aound clip	BD	427631
MRI 7 Tesla	Bruker Corporation
Paravision 5.0 software	Bruker Corporation
CO2 Euthanasia system	VetEquip
25 G 5/8 Needle (for heart-puncture)	BD	305122
0.1 ml syringe (for heart-puncture)	Terumo	SS-01T
K3-EDTA Micro tube 1.3 ml	Sarstedt	41.1395.105
10% Neutral Buttered Formalin	Fisher Scientific	SF100-4