No modelo in vivo para o ensaio do efeito de hipoxia em metástase tumoral

Resumo

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

Resumo

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm³. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

Introdução

Sarcoma de Ewing (ES) é uma neoplasia agressiva que afectam as crianças e adolescentes. ¹ Os tumores se desenvolvem em tecidos moles e ossos, comumente nos membros. Embora a presença de metástases é o factor adverso mais forte único prognóstico para pacientes ES, os mecanismos subjacentes ao seu desenvolvimento permanecem obscuros. ² tumor hipoxia é um dos poucos factores implicados na progressão ES. Em pacientes ES, a presença de áreas não perfundidas no interior do tecido do tumor está associada com mau prognóstico. ³ In vitro, a hipoxia aumenta a capacidade de invasão de células ES e desencadeia a expressão de genes pró-metastáticos. ^4-6 No entanto, apesar destas linhas de evidência, nenhuma prova direta para a progressão ES induzido por hipoxia ea propagação existe. Além disso, os mecanismos pelos quais a hipoxia exerce tais efeitos são, presentemente, desconhecido. Por isso, criamos um modelo in vivo para preencher a lacuna entre o existente dados in vitro e obser clínicavações. Este sistema modelo permite testar directa dos efeitos de hipoxia em tumores que ocorrem no seu ambiente natural, utilizando imagiologia de ressonância magnética (MRI) para seguir a progressão tumoral e metástases in vivo, em combinação com análise ex vivo patológicas e moleculares (Figura 1).

Uma vez que nenhum transgénico modelo estabelecido de ES está actualmente disponível, os estudos in vivo sobre as propriedades metastáticas destes tumores dependem de injeções de células humanas em ratinhos imunocomprometidos. Enquanto o uso de animais com deficiência imunologicamente pode subestimar o impacto do sistema imune na progressão da doença, a capacidade para utilizar células humanas aumenta tradutibilidade de tais estudos. Entre os diferentes modelos de xenotransplante, injeções sistêmicas na veia da cauda são mais fáceis de executar, mas omitem os passos iniciais da intravasation célula tumoral e fugir do local primário do crescimento. ^12/07 Por outro lado, orthoto xeno pic, que envolve injeções de células tumorais em ossos (fêmur, costela) ou nos músculos, é mais um desafio técnico, mas também biologicamente mais relevantes para câncer humano. ^13-16 eutanásia dos animais No entanto, no passado, a altas taxas de morbidade associada a um rápido crescimento de tumores primários foi frequentemente necessária antes do desenvolvimento de metástases. Neste estudo, que empregou um modelo previamente estabelecido de injecções de células no músculo gastrocnémio seguida por excisão do tumor primário resultante combinada com a monitorização longitudinal de progressão metastático por MRI. ^17,18 Essas injecções no músculo gastrocnémio em estreita proximidade com a tíbia permitir o crescimento do tumor em dois ambientes naturais ES - músculos e ossos - e resultar em metástases para locais distantes normalmente atingidas em seres humanos. ¹⁸ Deste modo, este modelo recapitula com precisão os processos metastáticos que ocorrem em pacientes ES durante a progressão da doença.

tenda "> A localização de tumores primários no membro posterior inferior também facilita o controle preciso do fornecimento de sangue ao tecido do tumor. A ligação da artéria femoral (FAL) é uma técnica bem estabelecida utilizada na investigação da angiogénese para bloquear o fluxo de sangue para as regiões distais do a perna e investigar vascularização do tecido em resposta a isquemia ^19,20. é importante ressaltar que a queda inicial no fluxo sanguíneo é seguido por abertura vaso colateral e reperfusão de tecidos observa-se aproximadamente 3 dias após FAL. ²⁰ Assim, quando realizada em um membro portador de tumor, este modelo recria eventos hipoxia / reperfusão que ocorrem naturalmente nos tumores de crescimento rápido e permite o escape de células tumorais metastáticas, devido ao restabelecimento da perfusão para o membro posterior inferior através de vasos colaterais recentemente abertas. ²¹ importante, este processo deve ser executado quando o tamanho do tumor está pequena o suficiente para evitar a excessiva hipoxia em tumores de controlo (tipicamente no bezerro vol portador de tumorume de 150-250 ^mm3), garantindo diferenças significativas nos níveis de hipoxia tumor entre grupos de controlo e tratados com FAL.

Além disso a monitorização longitudinal do efeito de hipoxia na latência ES e a frequência de metástases, este modelo também permite a recolha de tecidos e o desenvolvimento de novas linhas de células de ambos os tumores primários e metástases. Importante, trabalho anterior demonstrou que as linhas celulares metástases derivadas exibem potencial metastático melhorada mediante a reintrodução para animais, indicando que a disseminação do tumor está associada com alterações permanentes no fenótipo de células de tumor, e validando assim a utilização destas linhas celulares para decifrar os processos metastáticos. ¹⁸ Em conjunto, estes modelos podem agora ser usados para as análises genéticas e moleculares necessários para a identificação de vias metastáticos induzida por hipoxia.

Como a hipóxia é um factor pró-metastático melhorar a malignidade de vários tumors, o nosso modelo pode ser usado como uma plataforma para investigar o papel de hipoxia em outros tipos de tumores que se desenvolvem naturalmente nos membros, tais como o osteossarcoma e rabdomiossarcoma. ^21-23 Por outro lado, uma abordagem similar pode ser aplicada a outras doenças malignas que crescem em localizações anatómicas com um percurso bem definido de fornecimento de sangue. Em última análise, o modelo pode ser modificada e a sua utilidade mais alargado, dependendo das necessidades individuais de investigação.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Georgetown.

1. Preparação de células para ortotópico Injeções

1. células ES Cultura humanos sob condições padrão. Usar cerca de uma placa de cultura celular de 15 cm não superior a 70% de confluência para injecção de 5 ratinhos.
   NOTA: Para este estudo, as células SK-ES1 foram cultivadas em meio 5A de McCoy com soro de bovino fetal a 15% (FBS) em placas revestidas com colagénio e células TC71 foram cultivadas em RPMI com 10% de FBS e 1% de 4- (2-hidroxietil ) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES). Ambos os meios foram suplementados com antibióticos - penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 ug / ml) e fungizona (1 ug / ml).
2. Lavam-se as células ES com fosfato salino tamponado (PBS) e trypsinize a 70% de confluência com 0,25% de ácido tripsina / etilenodiaminotetracético (EDTA) durante 5 min.
3. Remover as células ES a partir da placa de cultura celular com Medium, depois centrifugar durante 5 minutos a 200 xg à temperatura ambiente. Re-suspender as células ES em 10 ml de PBS frio e depois contar o número de células.
4. Células centrífuga ES por 5 min a 200 xg à temperatura ambiente, e então re-suspensão em 10 ⁷ (TC71) células por ml em PBS frio 2 x 10 ⁷ (SK-ES1) ou. Manter a suspensão de células final sobre gelo durante a realização de injecções.

2. injeção ortotópico de células ES em músculo gastrocnêmio

1. Use camundongos 4-6 semanas de idade SCID Mulher / bege.
2. Para injetar células-tronco embrionárias, segure suavemente o mouse e estabilizar a sua perna esquerda entre o quarto e quinto dedos, expondo o lado medial do membro posterior inferior.
3. Usando uma agulha de 28 G ½, injectar 0,1 ml da suspensão de células previamente preparada que contém quer de 2 x 10 ⁶ (SK-ES1) ou 10 células ⁽⁶ TC71) ES no músculo gastrocnémio (Figura 2A).
   NOTA: Embora o volume máximo para inj intramuscularexões é tipicamente de 0,05 mL, por este procedimento particular, o aumento de volume de 0,1 ml é necessária devido ao elevado número de células injectadas. Este procedimento foi aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Georgetown.
   1. Inserir a agulha no músculo gastrocnêmio anteriormente a aproximadamente a 30 - ângulo de 45 graus na direção do tibial crista / tubérculo.
   2. Ligeiramente retirar a agulha, uma vez que toca o tibial crista / tubérculo. Lentamente injetar a solução de suspensão de células, retirando gradualmente a agulha para liberar a pressão.
4. Monitorar os camundongos injetados durante as próximas 24 horas para sinais de sofrimento.
   NOTA: Os investigadores com menos experiência no manejo dos animais deve considerar anestesiar ratos para injeções de células de tumor. Algumas instituições podem requerer anestesia por razões de segurança.

3. Monitoramento crescimento do tumor primário

1. Monitorar o crescimento de tumores primários dAily até que o tamanho do tumor alcança o volume desejado.
   Nota: No estudo actual, um volume de vitelo de 250 mm, ³ foi usado como um ponto da experiência (Figura 2B) de partida. Normalmente, leva cerca de 1-2 semanas para os tumores atingirem esse tamanho.
   1. Medir o tamanho bezerro diariamente com paquímetro digital via seus comprimentos médio-lateral e ântero-posterior.
   2. Determinar o volume de vitelo pela fórmula (D xd ^6/2) x 3,14, onde D é o diâmetro mais longo e d é o diâmetro mais curto do membro posterior inferior portador de tumor.
      NOTA: O tamanho do vitelo normal do rato adulto é de aproximadamente 40 - 50 ^mm3. O seu volume irá aumentar devido ao crescimento do tumor e nas fases posteriores do bezerro será composto, principalmente do tecido tumoral.

4. Artéria Femoral Ligadura (FAL) para induzir hipóxia em pata portadores de tumor

1. Prepare os instrumentos cirúrgicos necessários para esta operação: curved ou uma pinça fina apontados, apontou fórceps, tesouras cirúrgicas e um suporte de agulha. Esterilizar estas ferramentas antes da cirurgia usando uma autoclave ou esterilizador talão quente. Além disso, tem cotonetes finos prontos para esta cirurgia.
   NOTA: É recomendado que as ferramentas de ser re-esterilizado nas pontas conforme necessário durante o procedimento.
2. Injectar agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg) por via subcutânea (SQ). Para detectar e confirmar a hipóxia, injectar hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 mg / kg).
   NOTA: Esta dose corresponde a 1,5 mg por rato e é conseguido através da injecção de 0,1 ml de solução hypoxyprobe 15 mg / ml em PBS por via intraperitoneal (IP). O hypoxyprobe é, em seguida, post-mortem detectável em tecidos animais por imuno-histoquímica.
3. Colocar o rato numa câmara de indução de anestesia contendo 3-5% de isoflurano em 100% de oxigénio a um caudal de 1 L / min.
4. Deixar o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal do icâmara de nduction. Colocar o animal em decúbito dorsal em uma cortina estéril colocado em cima de uma almofada de aquecimento na superfície da operação. Usar um cone de nariz para o ligar a um fluxo contínuo de 1 - 3% de isoflurano em 100% de oxigénio a um caudal de 0,8 L / min.
   1. Aplicar pomada oftálmica estéril não-medicamentoso para cada olho para evitar a secagem da córnea. Para depilar completamente a área cirúrgica, aplique creme de depilação, deixando-o na pele por não mais do que 10 segundos. Em seguida, limpe o creme de depilação usando uma almofada de etanol prep.
5. Ampliar e garantir o membro posterior com um pedaço de fita de aproximadamente 45 graus da linha média do mouse. Uma vez que o membro posterior é seguro, limpe a pele exposta com 10% de povidona / iodo cotonete / solução, seguido pelo etanol, repetindo mais duas vezes cada. Para o resto do procedimento cirúrgico, usar um microscópio estéreo para obter uma vista ampliada da região de membro posterior.
6. Utilizando uma pinça de pontas e tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão do skem, aproximadamente 1 cm de comprimento, a partir de meio da coxa para a região inguinal. Usando cotonetes fino de algodão umedecido com solução salina, escove delicadamente o tecido adiposo subcutâneo em torno do músculo da coxa.
7. Cuidadosamente revelar a artéria femural subjacente através de dissecção romba através do tecido adiposo subcutâneo. Estabilizar a ferida e campo cirúrgico para expor a vasculatura do músculo adutor médio-superior.
8. Usando uma pinça fina, delicadamente Pierce através da bainha femoral membranoso para expor o feixe neurovascular. Usando um conjunto limpo de uma pinça fina, dissecar e separar a artéria femoral a partir da veia femoral e do nervo no local proximal perto da virilha, distal ao ligamento inguinal. Tenha cuidado para evitar a perfuração da parede da veia femoral.
9. Na sequência de dissecação, passar um fio de 6-0 sutura de seda por baixo da artéria femoral e distal para o ramo da artéria femoral circunflexa lateral (AGCL). Oclusão da artéria femoral usando nós dobro (Figura 3).
10. Fechar a incisão utilizando 6-0 de polipropileno. Depois de fechar a incisão, injeta SQ 0,5 ml de solução salina morna para a terapia de equilíbrio de fluidos. Colocar o animal no topo de uma almofada quente envolto na gaiola de recuperação e monitorizar continuamente até acordado.
11. Monitorizar os animais durante o primeiro 6 h após a cirurgia e injectar o agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg, SQ) todos os dias durante 3 dias. Remover suturas 10 dias pós-cirurgia usando uma tesoura esterilizada.

5. retirada do tumor primário por amputação do pé

NOTA: Amputar do membro posterior inferior portador de tumor quando o tamanho de vitelo atinge 250 milímetros ³ para o grupo de controlo ou 3 dias após FAL para o grupo hipóxico.

1. Raspar o cabelo do membro portador de tumor da tíbia distal à região pélvica com cortar cabelo com suavidade, enquanto segurando o animal. Injectar o agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg, SQ) antes do procedimento.
2. Posicione o mouse em um ch indução da anestesiaâmbar contendo 3-5% de isoflurano em 100% de oxigénio a um caudal de 1 L / min. Deixar o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal da câmara de indução.
3. Colocar o animal na posição de decúbito lateral direito em uma cortina estéril colocado sobre uma almofada de aquecimento na superfície da operação. Usar um cone de nariz para o ligar a um fluxo contínuo de isoflurano 1-3% em 100% de oxigénio a um caudal de 0,8 L / min. Aplicar pomada oftálmica estéril não-medicamentoso para cada olho para evitar a secagem da córnea
4. Prepare o local da cirurgia usando 10% de povidona / iodo cotonete / solução, seguido pelo etanol, repetindo 3 vezes. Aplicar uma gaze estéril (por exemplo, campo cirúrgico) sobre o mouse para obter um campo cirúrgico estéril.
5. Faça uma incisão na pele meio femoral circunferencial, seguido por dissecção romba e retração da pele proximal. Expor o pedículo neurovascular femoral medial no lado médio do pé, e, em seguida, ligarperto do ligamento inguinal usando 4-0 revestido (poliglactina 910) material de sutura absorvível.
6. Executar uma transecção mid-femoral de grupos musculares com uma tesoura, seguido por dissecção romba dos tecidos moles para a articulação coxo-femoral. Usando um cortador de osso, realizar uma osteotomia mid-femoral. Usando um cotonete fina estéril ou uma esponja de gelatina absorvível, pressione suavemente o local da osteotomia para minimizar e prevenir o sangramento.
7. Feche a pele sobrejacente usando clipes de feridas cirúrgicas e injectar 0,5 ml de SQ salina morna para a terapia de equilíbrio de fluidos. Colocar o animal no topo de uma almofada quente envolto na gaiola de recuperação e monitorizar continuamente até acordado.
8. Após a cirurgia, recolher amostras de tecido de tumores primários para RNA, DNA ou o isolamento de proteínas, encaixe congelamento em nitrogênio líquido e armazenar a -80 C. Para a cultura de células primárias, recolher amostras de tecido nesta etapa, como descrito na secção 9 abaixo. Fixe o tecido do membro remanescente em 10% de formalina neutra tamponada para histologia e immunochemistente, incluindo hypoxyprobe-1 de detecção.
9. Monitorar os animais para a locomoção, a dor eo consumo de alimentos durante as primeiras 6 horas após a cirurgia, em seguida, a cada dia, durante 3 dias. Injectar o agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg, SQ) diariamente durante 3 dias. Retire os agrafos 10 dias após a amputação usando um removedor ferida clipe.

6. Ratos A monitorização da presença de metástases

1. Observe os ratos diariamente e avaliá-los para sinais clínicos de metástase, pelo menos, duas vezes por semana.
   1. Observar os animais para a presença de macrometástases que apresentam como massas que se desenvolvem em vários locais, tipicamente ombros, pernas contralateral e mandíbulas. Para este fim, palpar cuidadosamente regiões axilares cabeça, pescoço e e membro posterior contralateral. Verificar a existência de metástases de órgãos internos através de distensão abdominal, juntamente com ressonância magnética.
   2. Verificar a presença de metástases do pulmão, premindo o processo xifóide (a extremidade inferior do esterno) com index dedo. ²⁴
      NOTA: Esta pressão diminui a capacidade de respiração diafragmática. Os ratos com metástases pulmonares avançadas mostrar sinais de desconforto respiratório manifestada pela respiração trabalhosa.
   3. Observar os animais para os sintomas neurológicos, tais como a paralisia de perna e ataxia sugerindo metástases no sistema nervoso central.
   4. Monitorar a ratinhos, pelo menos, uma vez por semana para perda de peso, como uma indicação de progressão da doença potencial. perda de peso corporal superior a 15% do peso pré-processual é considerado um ponto final humano.

7. Magnetic Resonance Imaging (MRI) para detectar metástases

1. Realizar ressonância magnética para detectar metástases em pontos de tempo desejados. ¹⁸
   NOTA: No presente estudo, foi utilizado um espectrômetro horizontal de 7 Tesla. MRI foi realizada nos dias 15 e 35 de pós-amputação por células SK-ES1 e no dia 15 para TC71 células.
2. Posicione o mouse em um chambe indução da anestesiaR contendo 1-3% de isoflurano em uma mistura gasosa de 30% de oxigénio e óxido nitroso a 70%.
3. Deixar o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal da câmara de indução.
4. Transferir o rato anestesiado em um suporte estereotáxico com a respiração e a monitorização da temperatura com a administração contínua de 1,5% de isoflurano e óxido nitroso a 30%. Aplicar pomada oftálmica estéril não-medicamentoso para cada olho para evitar o ressecamento da córnea. Imagem do animal ou em um 40 ou 23 milímetros Bruker bobina volume de rato para o corpo inteiro ou imagens do cérebro, respectivamente.
5. Use, uma sequência de duas dimensões em T2 RARE: TR = 3.000 ms, TE = 24 ms, matriz = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, espessura de corte = 0,5 mm, fator RARE = 4 e médias = 4. ¹⁸
6. Colocar o animal em uma gaiola de recuperação quente e monitorar continuamente até acordado.
   NOTA: Os ratos vão se recuperar rapidamente desde um avião da anestesia rasa é usado.
7. Monitorar os animais durante as primeiras 6 horas após a imagem ter certeza de que não existem efeitos adversos da anestesia.

8. A eutanásia e necropsia

1. Eutanásia os ratos uma vez que os animais apresentam-se com metástases detectáveis ​​por ressonância magnética e / ou sintomas clínicos de progressão da doença.
   NOTA: No presente estudo, os ratos foram sacrificados nos dias 50 e 25 de pós-amputação por animais portadores SK-ES1 e TC71 xenotransplantes, respectivamente. Em alguns casos, a eutanásia anterior era necessária devido a uma elevada carga metástase.
2. Eutanásia os ratos por exposição a _CO2 a 1,5 L / min (CO ₂ a 10 - 30% da câmara eutanásia vol / min). Para garantir a morte do animal, execute deslocamento cervical após a exposição ao CO _2.
3. Spray de todo o rato com 70% de etanol e colocá-lo na câmara de fluxo laminar. Coletar o sangue por punção cardíaca utilizando uma agulha de 25 G ½ com uma seringa de 1 ml e transferir para uma coleta de sangue tuser contendo 2 mg de EDTA.
4. Recolher os seguintes tecidos: baço, glândulas adrenais, ovários, rins, fígado, pulmões, cérebro, perna direita, de medula óssea de ambos os úmeros e coluna vertebral, bem como metástases macroscópicas presentes em outros locais. ^25,26
5. Fix metade de cada tecido em formalina 10% neutra tamponada para histologia e imunoquímica, incluindo hypoxyprobe-1 detecção. Snap congelar a outra metade em nitrogênio líquido, em seguida, armazenar a -80 ° C para o RNA, DNA ou o isolamento de proteínas. ^25,26 Para a cultura de células primárias, recolher amostras de tecido, como descrito na secção 9 abaixo.

9. Cultura de células primárias

1. Para realizar a cultura de células primárias, dissecar tecidos do membro amputado (seção 5 acima) ou durante a necropsia (seção 8 acima) em condições estéreis em uma capela de fluxo laminar.
2. Prepare a cultura de células de suporte adequado para a linha celular utilizada para injecções ortotópicos, suplementado com penicilina (200 unidades / ml),estreptomicina (200 ug / ml), fungizona (1 ug / ml), e 0,2% micoplasma antibiótico profilático. Colocar 2,5 mL de meio de cultura primária em uma placa de cultura celular de 6 cm.
3. Selecionar áreas de tecido de tumor viáveis ​​de tumores primários ou metástases, e em seguida isolar dois a três segmentos de 2-3 mm cada um usando uma tesoura esterilizada.
   NOTA: O tecido de tumor viáveis ​​é normalmente encontrada nas extremidades do tumor e podem ser discriminados a partir de necrose pela sua cor rosada ou avermelhada, brilho e aparência molhada significativa global. Em contraste, o tecido necrótico é geralmente visto no centro do tumor e apresenta-se como uma massa de cor esbranquiçada / creme com uma aparência opaca, de queijo. ²⁷
4. Transferir os segmentos isolados para uma placa de cultura celular de 6 cm contendo meio de cultura Primária descrito no passo 9.2.
5. células de cultura sob condições padrão, como descrito na seção 1 (NOTA) e 9,2. ^18,28 Verifique a cultura para crescimento celular decorrente de os pedaços de tecido, which deve ser observado no prazo de alguns dias. Uma vez que as células atingem a confluência, trypsinize e propagar-los de acordo com técnicas de cultura de células padrão.
   NOTA: A cultura de células primária pode ser utilizado subsequentemente para avaliar o crescimento e propriedades metastáticas de células derivadas de tumores de controlo e hipóxicos, bem como as suas características moleculares, tal como anteriormente descrito. ¹⁸

Resultados

Após a injecção de células ES em músculo gastrocnémio, os tumores primários são deixadas crescer até um tamanho de bezerro de 250 mm, ³ (Figura 1, 2). O tempo necessário para os tumores se atingir este volume varia tipicamente de 10 - 15 dias para TC71 para 20-25 dias para xenoenxertos SK-ES1, respectivamente. Os tumores em um volume de vitelo de 250 mm, ³ exibem um nível relativamente baixo de hipoxia endógena (cerca de 3% de tecido de ...

Discussão

O nosso modelo envolve a comparação de metástases em dois grupos experimentais - um grupo de controlo, onde os tumores podem desenvolver-se no membro posterior seguido de amputação, ao atingir um volume de vitelo de 250 mm, ^3, e um grupo exposto por hipoxia, em que o tumor- dos membros posteriores rolamento é submetido a FAL no mesmo volume, seguido por amputação 3 dias mais tarde. Embora nestas experiências os tumores tratados com FAL são amputados com um ligeiro atraso, em comparação com os tumo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells	ATCC
TC71 Human ES cells			Kindly provided from Dr. Toretsky
McCoy's 5A (modified) Medium	Gibco by Life Technologies	12330-031
RPMI-1640	ATCC	30-2001
PBS	Corning Cellgro	21-040-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500mL
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life Technologies	25200-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco by Life Technologies	15140-122
Fungizone® Antimycotic	Gibco by Life Technologies	15290-018
MycoZap™ Prophylactic	Lonza	VZA-2032
Collagen Type I Rat tail high concetration	BD Biosciences	354249
SCID/beige mice	Harlan or Charles River	250 (Charles River) or 18602F (Harlan)
1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle	BD	329424
Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP)	Hospira, INC	NDC 0409-7984-37
Digital calipers	World Precision Instruments, Inc	501601
Surgical Tools	Fine Science Tools
Rimadyl (Carprofen) Injectable	Zoetis
Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid)	HPI, Inc	HP-100mg
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg)	HPI, Inc	CCI-103F-250mg
Povidone-iodine Swabstick	PDI	S41350
Sterile alcohol prep pad	Fisher HealthCare	22-363-750
LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment)	Major Pharaceuticals	NDC 0904-5168-38
VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56617-014
Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade	Oster	078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade)
Nair Lotion with baby oil	Church & Dwight Co., Inc.
Silk 6-0	Surgical Specialties Corp	752B
Prolene (polypropylene) suture 6-0	Ethicon	8680G
Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0	Ethicon	J386H
Fisherbrand Applicators (Purified cotton)	Fisher Scientific	23-400-115
GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4	Pfizer Pharmaceutical	9039605
Autoclip Wound Clip Applier	BD	427630
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Autoclip remover	BD	427637
Aound clip	BD	427631
MRI 7 Tesla	Bruker Corporation
Paravision 5.0 software	Bruker Corporation
CO2 Euthanasia system	VetEquip
25 G 5/8 Needle (for heart-puncture)	BD	305122
0.1 ml syringe (for heart-puncture)	Terumo	SS-01T
K3-EDTA Micro tube 1.3 ml	Sarstedt	41.1395.105
10% Neutral Buttered Formalin	Fisher Scientific	SF100-4