Modello in vivo per la prova Effetto dell'ipossia sul tumore metastasi

Riepilogo

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

Abstract

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm³. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

Introduzione

Sarcoma di Ewing (ES) è un tumore maligno aggressivo che colpisce i bambini e gli adolescenti. ¹ I tumori si sviluppano nei tessuti molli e ossa, comunemente nelle arti. Mentre la presenza di metastasi è il più potente fattore prognostico sfavorevole unico dei pazienti ES, i meccanismi alla base del loro sviluppo rimangono poco chiari. ² tumore ipossia è uno dei pochi fattori implicati nella progressione ES. Nei pazienti ES, la presenza di aree non perfuso nel tessuto tumorale è associata a prognosi infausta. ³ In vitro, ipossia aumenta l'invasività delle cellule ES e attiva l'espressione di geni pro-metastatico. ^4-6 Tuttavia, nonostante queste linee di evidenza, nessuna prova diretta per ES indotta da ipossia progressione e diffusione esiste. Inoltre, i meccanismi attraverso i quali l'ipossia esercita tali effetti sono, al momento, sconosciute. Quindi, abbiamo creato un modello in vivo per colmare il divario tra esistente I dati in vitro e clinica osservazioni. Questo sistema modello consente verifica diretta degli effetti dell'ipossia sui tumori che si verificano nel loro ambiente naturale, mediante risonanza magnetica (MRI) per seguire la progressione tumorale e metastasi in vivo in combinazione con analisi ex vivo patologiche e molecolari (Figura 1).

Dal momento che nessun modello transgenico stabilito di ES è attualmente disponibile, gli studi in vivo sulle proprietà metastatiche di questi tumori si basano su iniezioni di cellule umane in topi immunocompromessi. Mentre l'uso di animali immunologicamente deteriorate può sottovalutare l'impatto del sistema immunitario sulla progressione della malattia, la possibilità di utilizzare cellule umane aumenta traducibilità di tali studi. Tra i diversi modelli di xenotrapianto, iniezioni sistemiche in vena della coda sono le più facili da eseguire, ma omettono le fasi iniziali di intravasation delle cellule tumorali e la fuga dal sito primario della crescita. ^7-12 D'altra parte, orthoto pic xenotrapianto, che coinvolge le iniezioni di cellule tumorali nelle ossa (femore, costola) o ai muscoli, è più tecnicamente impegnativo, ma anche più biologicamente rilevanti per il cancro umano. ^13-16 eutanasia animale Tuttavia, in passato, l'elevata morbilità associata con la rapida crescita di tumori primari è spesso richiesto prima dello sviluppo di metastasi. In questo studio, abbiamo impiegato un modello precostituito di iniezioni di cellule nel muscolo gastrocnemio seguita da escissione del tumore primitivo risultante in combinazione con il monitoraggio longitudinale della progressione metastatica dalla risonanza magnetica. ^17,18 Tali iniezioni nel muscolo gastrocnemio in prossimità della tibia consentire la crescita del tumore in due ES ambienti naturali - muscoli e le ossa - e provocano metastasi a distanza in località tipicamente colpite negli esseri umani. ¹⁸ In tal modo, questo modello riassume con precisione i processi metastatici che si verificano in pazienti ES durante la progressione della malattia.

tenda "> La localizzazione dei tumori primari nel arti posteriori più bassa facilita anche il controllo preciso del afflusso di sangue al tessuto tumorale. femorale legatura (FAL) è una tecnica consolidata utilizzati nella ricerca angiogenesi per bloccare il flusso di sangue alle regioni distali la gamba e indagare la vascolarizzazione dei tessuti in risposta ad ischemia. ^19,20 è importante sottolineare che il calo iniziale del flusso sanguigno è seguito da apertura nave garanzia e riperfusione del tessuto osservato circa 3 giorni dopo FAL. ²⁰ Così, quando eseguito in un arto tumore cuscinetto, questo modello ricrea eventi ipossia / riperfusione che si trovano naturalmente nei tumori in rapida crescita e permette la fuga delle cellule tumorali metastatiche a causa di restauro della perfusione al arti posteriori inferiori tramite vasi collaterali di nuova apertura. ²¹ è importante sottolineare che questa procedura deve essere eseguita quando la dimensione del tumore è abbastanza piccolo per prevenire ipossia eccessivo in tumori di controllo (tipicamente il tumore-cuscinetto vitello volUme di 150-250 mm ^3), assicurando significative differenze nei livelli di ipossia tumorale tra controllo e gruppi FAL-trattati.

In aggiunta al monitoraggio longitudinale degli effetti dell'ipossia sulla latenza ES e la frequenza di metastasi, questo modello permette anche per la raccolta dei tessuti e lo sviluppo di nuove linee cellulari di entrambi i tumori primari e le metastasi. Importante, lavoro precedente stabilito che le linee cellulari metastasi-derivati ​​presentano maggiore potenziale metastatico dopo la reintroduzione di animali, indicando che la diffusione del tumore è associata a cambiamenti permanenti nel fenotipo delle cellule tumorali, e convalida così l'uso di queste linee cellulari di decifrare i processi metastatici. ¹⁸ Collettivamente, questi modelli possono ora essere utilizzati per le analisi genetiche e molecolari necessarie per l'identificazione di percorsi metastatici indotta da ipossia.

Come ipossia è un fattore pro-metastatico migliorare la malignità di vari tumors, il modello può essere utilizzato come una piattaforma per studiare il ruolo dell'ipossia in altri tipi di tumore che si sviluppano naturalmente in arti, come osteosarcoma e rabdomiosarcoma. ^21-23 Inoltre, un approccio simile può essere applicato a tumori maligni crescono in altre sedi anatomiche con un percorso ben definito di sangue. In definitiva, il modello può essere modificato e la sua utilità ulteriormente esteso, a seconda dei singoli esigenze di ricerca.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Georgetown University.

1. Preparazione delle cellule per ortotopico Iniezioni

1. cellule staminali embrionali umane Cultura in condizioni standard. Utilizzare circa un piatto di coltura cellulare di 15 cm non superiore al 70% di confluenza per l'iniezione di 5 topi.
   NOTA: Per questo studio, le cellule SK-ES1 sono state coltivate in terreno 5A McCoy con siero fetale bovino 15% (FBS) su piastre di collagene rivestite e cellule TC71 state coltivate in RPMI con 10% FBS e 1% 4- (2-idrossietil ) L'acido -1-piperazineethanesulfonic (HEPES). Entrambi i mezzi sono stati integrati con antibiotici - penicillina (100 unità / ml), streptomicina (100 mg / ml) e Fungizone (1 mg / ml).
2. Lavare le cellule ES con tampone fosfato salino (PBS) e trypsinize al 70% di confluenza con 0,25% tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 5 min.
3. Rimuovere le cellule staminali dalla piastra con colture cellulari media, quindi si centrifuga per 5 minuti a 200 xg a temperatura ambiente. Risospendere le cellule ES in 10 ml di PBS freddo e poi contare il numero di cellule.
4. Cellule ES centrifuga per 5 minuti a 200 xg a temperatura ambiente, e poi ri-sospendere a 10 ⁷ (TC71), le cellule per ml in PBS freddo 2 x 10 ⁷ (SK-ES1) o. Mantenere la sospensione cellulare finale sul ghiaccio durante l'esecuzione di iniezioni.

2. iniezione ortotopico di cellule ES in muscolo gastrocnemio

1. Utilizzare 4-6 settimana femminile SCID / topi beige vecchi.
2. Per iniettare cellule ES Premere delicatamente il mouse e stabilizzare la sua gamba sinistra tra il quarto e quinto dito, esponendo il lato mediale del arti posteriori inferiore.
3. Utilizzando un ago 28 G ½, iniettare 0,1 ml di sospensione cellulare precedentemente preparato che contiene o 2 x 10 ⁶ (SK-ES1) o 10 ⁶ cellule (TC71) ES nel muscolo gastrocnemio (Figura 2A).
   NOTA: Anche se il volume massimo per inj intramuscolareriflessioni è tipicamente 0,05 ml, per questa particolare procedura l'aumento di volume di 0,1 ml è necessaria a causa del numero elevato di cellule iniettate. Questa procedura è stata approvata dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Georgetown University.
   1. Inserire l'ago nel muscolo gastrocnemio anteriormente una a circa 30 - 45 gradi nella direzione del tibiale crest / tuberosità.
   2. Leggermente ritirare l'ago una volta che tocca il tibiale stemma / tuberosità. Iniettare lentamente la soluzione sospensione cellulare, ritirando gradualmente l'ago per scaricare la pressione.
4. Monitorare i topi iniettati corso dei prossimi 24 ore per segni di sofferenza.
   NOTA: Gli investigatori con meno esperienza nella gestione degli animali dovrebbe prendere in considerazione anestetizzare topi per le iniezioni di cellule tumorali. Alcuni istituti possono richiedere l'anestesia per motivi di sicurezza.

3. Monitoraggio crescita del tumore primario

1. Monitorare la crescita dei tumori primari dAily finché le dimensioni del tumore raggiunge il volume desiderato.
   NOTA: In questo studio, un volume vitello di 250 mm ³ è stato utilizzato come punto di partenza dell'esperimento (Figura 2B). In genere, ci vogliono circa 1-2 settimane per i tumori per raggiungere queste dimensioni.
   1. Misurare la dimensione del vitello al giorno con pinze digitali tramite le sue lunghezze medio-laterale e anteriore-posteriore.
   2. Determinare il volume vitello dalla formula (D xd ^2/6) x 3,14, dove D è il diametro più lungo e d è il diametro minore del tumore-cuscinetto hindlimb inferiore.
      NOTA: La dimensione del normale vitello topo adulto è di circa 40 - 50 mm ^3. Il suo volume aumenterà a causa della crescita del tumore e alle fasi successive il vitello sarà composto principalmente da tessuto tumorale.

4. arteria femorale legatura (FAL) per indurre ipossia nel tumore-cuscinetto degli arti posteriori

1. Preparare gli strumenti chirurgici necessari per questa operazione: curved o una pinza sottile appuntito, ha sottolineato pinze, forbici chirurgiche e un porta-aghi. Sterilizzare questi strumenti prima di un intervento chirurgico mediante autoclave o uno sterilizzatore a caldo tallone. Inoltre, hanno tamponi di cotone sottili pronti per questa chirurgia.
   NOTA: Si raccomanda che gli strumenti di essere ri-sterilizzati alle punte come necessario durante la procedura.
2. Iniettare agente analgesico (Carprofen 5 mg / kg) per via sottocutanea (SQ). Per rilevare e confermare ipossia, iniettare hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 mg / kg).
   NOTA: Questa dose equivale a 1,5 mg per mouse e si ottiene iniettando 0,1 ml di soluzione di hypoxyprobe 15 mg / ml in PBS per via intraperitoneale (IP). Il hypoxyprobe è poi postmortem rilevabile nei tessuti animali di immunoistochimica.
3. Posizionare il mouse in una camera di induzione dell'anestesia contenente 3 - 5% isoflurano in 100% di ossigeno ad un flusso di 1 l / min.
4. Lasciare il mouse nella camera di induzione finché non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l'animale dalla Icamera di nduction. Posto l'animale in posizione supina su un telo sterile posto in cima ad un rilievo di riscaldamento sulla superficie operativa. Utilizzare un cono per collegarlo ad un flusso continuo di 1 - 3% isoflurano in 100% di ossigeno ad un flusso di 0,8 L / min.
   1. Applicare pomata oftalmica sterile non medicati per ciascun occhio per evitare l'essiccazione della cornea. Per depilare accuratamente l'area chirurgica, applicare la crema di rimozione dei capelli, lasciando sulla pelle per non più di 10 secondi. Poi pulire la crema di rimozione dei capelli usando un tampone di etanolo prep.
5. Estendere e fissare la arti posteriori con un pezzo di nastro adesivo circa 45 gradi dalla linea mediana del mouse. Una volta che il arti posteriori è sicuro, pulire la pelle esposta con il 10% povidone / iodio tampone / soluzione, seguita da etanolo, ripetendo due volte ciascuno. Per il resto della procedura chirurgica, utilizzare un microscopio stereo per ottenere una vista ingrandita della regione arti posteriori.
6. Con pinze a punta e forbici chirurgiche, fare un'incisione del skdi, lunga circa 1 cm, da metà coscia verso la regione inguinale. Utilizzando tamponi di cotone fine saline-inumidito, delicatamente spazzare via sottocutaneo tessuto adiposo che circonda il muscolo della coscia.
7. rivelare con attenzione l'arteria femorale sottostante via smussa attraverso il tessuto adiposo sottocutaneo. Stabilizzare la ferita e campo chirurgico per esporre la vascolarizzazione del muscolo adduttore medio-superiore.
8. Utilizzando una pinza sottile, delicatamente forare attraverso la guaina femorale membranosa per esporre il fascio neurovascolare. Utilizzando un set pulito di una pinza sottile, sezionare e separare l'arteria femorale dalla vena femorale e del nervo nella posizione prossimale vicino al inguine, distale al legamento inguinale. Usare cautela per evitare forare il muro vena femorale.
9. A seguito di dissezione, passare un filo di sutura 6-0 seta sotto l'arteria femorale e distale al ramo dell'arteria femorale circonflessa laterale (LCFA). Occludere l'arteria femorale con doppi nodi (Figura 3).
10. Chiudere l'incisione con 6-0 punti di sutura in polipropilene. Dopo aver chiuso l'incisione, iniettare SQ 0,5 ml di soluzione salina calda per la terapia di equilibrio dei fluidi. Posto l'animale in cima a un pad calda avvolta nella gabbia recupero e monitorare continuamente fino sveglio.
11. Monitorare gli animali durante prime 6 ore dopo l'intervento e iniettare l'agente analgesico (Carprofen 5 mg / kg, SQ) ogni giorno per 3 giorni. Rimuovere suture 10 giorni post-intervento chirurgico con le forbici sterili.

5. L'asportazione del tumore primario per l'amputazione della gamba

NOTA: Amputare il arti posteriori inferiori tumore-cuscinetto quando la dimensione vitello raggiunge i 250 mm ³ per il gruppo di controllo o 3 giorni dopo FAL per il gruppo ipossico.

1. Radere i capelli dal arto tumore-cuscinetto dalla tibia distale alla regione pelvica con tosatrici mentre delicatamente tenendo l'animale. Iniettare l'agente analgesico (Carprofen 5 mg / kg, SQ) prima della procedura.
2. Posizionare il mouse in una ch induzione dell'anestesiaambra contenente 3 - 5% isoflurano in 100% di ossigeno ad un flusso di 1 l / min. Lasciare il mouse nella camera di induzione finché non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l'animale dalla camera di induzione.
3. Posto l'animale in posizione di decubito laterale destro su un telo sterile posto su un tappetino di riscaldamento sulla superficie operativa. Utilizzare un cono per collegarlo ad un flusso continuo di isoflurano 1 - 3% in 100% di ossigeno ad un flusso di 0,8 L / min. Applicare pomata oftalmica sterile non medicati per ciascun occhio per evitare l'essiccazione della cornea
4. Preparare il sito chirurgico utilizzando 10% povidone / iodio tampone / soluzione, seguita da etanolo, ripetendo 3 volte. Applicare una garza sterile (ad esempio, telo chirurgico) sopra il mouse per ottenere un campo chirurgico sterile.
5. Fare un mezzo femorale incisione cutanea circonferenziale, seguita da dissezione e la scomparsa della pelle prossimale. Esporre mediale peduncolo neurovascolare femorale sul lato mediana della gamba, e poi legarevicino al legamento inguinale utilizzando 4-0 rivestito (Polyglactin 910) materiale di sutura assorbibile.
6. Eseguire un mid-femorale transection dei gruppi muscolari con le forbici, seguita da dissezione dei tessuti molli al coxofemorale. Utilizzando un cutter osso, eseguire una osteotomia mid-femorale. Usando un batuffolo di cotone fine sterile o una spugna di gelatina riassorbibile, premere delicatamente il sito osteotomia per minimizzare e prevenire le emorragie.
7. Chiudere la pelle sovrastante mediante clip della ferita chirurgica e iniettare 0,5 ml di soluzione salina calda SQ per la terapia di equilibrio dei fluidi. Posto l'animale in cima a un pad calda avvolta nella gabbia recupero e monitorare continuamente fino sveglio.
8. Al momento l'intervento chirurgico, raccogliere campioni di tessuto da tumori primari per l'RNA, DNA o isolamento delle proteine, scatto congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Per colture cellulari primarie, raccogliere campioni di tessuto in questa fase, come descritto nella sezione 9 di seguito. Fissare il tessuto arto rimasto in formalina neutra tamponata al 10% per l'istologia e immunochemisprovare, tra cui hypoxyprobe-1 di rilevamento.
9. Monitorare gli animali di locomozione, il dolore e il consumo di cibo durante le prime 6 ore dopo l'intervento, poi ogni giorno per 3 giorni. Iniettare l'agente analgesico (Carprofen 5 mg / kg, SQ) al giorno per 3 giorni. Rimuovere le clip ferita 10 giorni dopo l'amputazione utilizzando un dispositivo di rimozione della clip ferita.

6. I topi di monitoraggio per la presenza di metastasi

1. Osservare i topi quotidiana e valutarli per segni clinici di metastasi, almeno due volte a settimana.
   1. Osservare gli animali per la presenza di macrometastasi presentano come masse che si sviluppano in varie località, tipicamente spalle, gambe controlaterale e mascelle. A tal fine, palpare con cura la testa, il collo e le regioni ascellari, e degli arti posteriori controlaterale. Verificare la presenza di metastasi degli organi interni tramite distensione addominale insieme con scansione MRI.
   2. Controllare la presenza di metastasi polmonari premendo il processo xifoideo (l'estremità inferiore dello sterno) con index dito. ²⁴
      NOTA: Questa pressione diminuisce la capacità di respirazione diaframmatica. I topi con metastasi polmonari avanzate mostrano segni di difficoltà respiratoria si manifesta con la respirazione laboriosa.
   3. Osservare gli animali per i sintomi neurologici, come la paralisi delle gambe e l'atassia suggerendo metastasi al sistema nervoso centrale.
   4. Monitorare il mouse almeno una volta a settimana per la perdita di peso, come un'indicazione della progressione della malattia potenziale. perdita di peso corporeo superiore al 15% del peso pre-procedurale è considerato un endpoint umana.

7. risonanza magnetica (MRI) per la rilevazione di metastasi

1. Eseguire la risonanza magnetica per rilevare metastasi in momenti desiderati. ¹⁸
   NOTA: Nel corso di studio, uno spettrometro orizzontale 7 Tesla è stato utilizzato. MRI è stata effettuata a giorni 15 e 35 di post-amputazione per le cellule SK-ES1 e al giorno 15 per TC71 cellule.
2. Posizionare il mouse in un Chambe induzione dell'anestesiar contenente 1 - 3% isoflurano in una miscela gassosa di 30% di ossigeno e protossido di azoto 70%.
3. Lasciare il mouse nella camera di induzione finché non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l'animale dalla camera di induzione.
4. Trasferire il mouse anestetizzato su un supporto stereotassica con la respirazione e la temperatura monitorization con la somministrazione continua di 1,5% isoflurano e protossido di azoto del 30%. Applicare pomata oftalmica sterile non medicati per ciascun occhio per prevenire la secchezza della cornea. Immagine l'animale sia in 40 o 23 millimetri Bruker bobina di volume del mouse per tutto il corpo o imaging cerebrale, rispettivamente.
5. Utilizzare un bidimensionale, T2-weighted sequenza RARE: TR = 3.000 msec, TE = 24 msec, matrice = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, spessore dello strato = 0,5 mm fattore RARE = 4 e medie = 4. ¹⁸
6. Posto l'animale in una gabbia di recupero caldo e monitorare continuamente fino a quando sveglio.
   NOTA: I topi si riprenderà rapidamente da quando si utilizza un piano superficiale di anestesia.
7. Monitorare gli animali durante le prime 6 ore dopo l'imaging per assicurarsi che non vi siano effetti negativi della anestesia.

8. L'eutanasia e Necropsy

1. Euthanize i topi una volta gli animali presenti con metastasi rilevabili dalla risonanza magnetica e / o sintomi clinici di progressione della malattia.
   NOTA: Nel corso di studio, i topi sono stati sacrificati a giorni 50 e 25 di post-amputazione per gli animali che portano SK-ES1 e TC71 xenotrapianti, rispettivamente. In alcuni casi, prima dell'eutanasia era necessario a causa di un elevato carico metastasi.
2. Euthanize i topi da esposizione a CO ₂ a 1,5 L / min (CO ₂ a 10 - 30% della camera dell'eutanasia vol / min). Per garantire la morte degli animali, eseguire dislocazione cervicale dopo l'esposizione di CO _2.
3. Spruzzare l'intero mouse con 70% etanolo e posizionarlo nella cappa a flusso laminare. Raccogliere il sangue mediante puntura cardiaca utilizzando un ago da 25 G ½ con una siringa da 1 ml e il trasferimento ad un prelievo di sangue tuessere contenente 2 mg di EDTA.
4. Raccogliere i seguenti tessuti: milza, ghiandole surrenali, ovaie, reni, fegato, polmoni, cervello, gamba destra, del midollo osseo sia da omeri e della colonna vertebrale, così come metastasi macroscopiche presenti in altri luoghi. ^25,26
5. Fissare la metà di ogni tessuto in formalina neutra tamponata al 10% per l'istologia e immunochimica, tra cui hypoxyprobe-1 di rilevamento. Snap congelare l'altra metà in azoto liquido, quindi memorizzare a -80 C per RNA, DNA o isolamento delle proteine. ^25,26 per colture cellulari primarie, raccogliere campioni di tessuto come descritto nella sezione 9 di seguito.

9. coltura cellulare primaria

1. Per eseguire colture cellulari primarie, sezionare i tessuti dal arto amputato (precedente punto 5) o durante la necroscopia (precedente punto 8) in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare.
2. Preparare coltura cellulare di supporto appropriato per la linea cellulare utilizzato per le iniezioni ortotopico, integrato con la penicillina (200 unità / ml),streptomicina (200 mcg / ml), fungizone (1 ug / ml), e 0,2% micoplasma profilassi antibiotica. Collocare 2,5 ml del terreno di coltura primaria in una piastra di coltura cellulare 6-cm.
3. Selezionare aree di tessuto tumorale vitali da tumori primari o metastasi, e quindi isolare due o tre segmenti a 2-3 mm ciascuno con le forbici sterili.
   NOTA: tessuto tumorale valida si trova di solito sui bordi del tumore e può essere discriminata dalla necrosi dal suo colore rosa o rossastro, lucentezza significativa e l'aspetto bagnato complessivo. Al contrario, il tessuto necrotico è comunemente visto nel centro del tumore e presenta come / massa biancastra colore crema con un ottuso, aspetto scadente. ²⁷
4. Trasferire i segmenti isolati ad una piastra di coltura cellulare di 6 cm contenente terreno di coltura primaria descritto al punto 9.2.
5. cellule di coltura in condizioni standard, come descritto nella sezione 1 (NOTA) e 9.2. ^18,28 Controllare la cultura per escrescenza cellulare derivante dai pezzi di tessuto, which deve rilevare nel giro di pochi giorni. Una volta che le cellule raggiungono confluenza, trypsinize e propagare loro secondo le tecniche di coltura cellulare standard.
   NOTA: La coltura cellulare primaria può essere successivamente utilizzato per valutare la crescita e le proprietà metastatiche delle cellule derivate da controllo e ipossiche tumori, così come le loro caratteristiche molecolari, come precedentemente descritto. ¹⁸

Risultati

Dopo l'iniezione di cellule staminali nel muscolo gastrocnemio, i tumori primari possono crescere a una dimensione vitello di 250 mm ³ (figura 1, 2). Il tempo necessario per i tumori raggiungere questo volume varia tipicamente da 10 - 15 giorni per TC71 a 20-25 giorni per eterotrapianti SK-ES1, rispettivamente. I tumori in un volume vitello 250 mm ³ mostra un livello relativamente basso di ipossia endogena (circa il 3% del tessuto tumorale), bas...

Discussione

Il nostro modello prevede il confronto delle metastasi nei due gruppi sperimentali - un gruppo di controllo, in cui i tumori possono svilupparsi nel hindlimb seguita da amputazione al raggiungimento di un volume di vitello 250 mm ^3, e un gruppo ipossia esposti, in cui il tumore- hindlimb cuscinetto è sottoposto a FAL allo stesso volume, seguita da amputazione 3 giorni più tardi. Anche se in questi esperimenti tumori FAL-trattate vengono amputati con un leggero ritardo, rispetto ai tumori di controllo, le lo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells	ATCC
TC71 Human ES cells			Kindly provided from Dr. Toretsky
McCoy's 5A (modified) Medium	Gibco by Life Technologies	12330-031
RPMI-1640	ATCC	30-2001
PBS	Corning Cellgro	21-040-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500mL
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life Technologies	25200-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco by Life Technologies	15140-122
Fungizone® Antimycotic	Gibco by Life Technologies	15290-018
MycoZap™ Prophylactic	Lonza	VZA-2032
Collagen Type I Rat tail high concetration	BD Biosciences	354249
SCID/beige mice	Harlan or Charles River	250 (Charles River) or 18602F (Harlan)
1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle	BD	329424
Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP)	Hospira, INC	NDC 0409-7984-37
Digital calipers	World Precision Instruments, Inc	501601
Surgical Tools	Fine Science Tools
Rimadyl (Carprofen) Injectable	Zoetis
Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid)	HPI, Inc	HP-100mg
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg)	HPI, Inc	CCI-103F-250mg
Povidone-iodine Swabstick	PDI	S41350
Sterile alcohol prep pad	Fisher HealthCare	22-363-750
LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment)	Major Pharaceuticals	NDC 0904-5168-38
VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56617-014
Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade	Oster	078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade)
Nair Lotion with baby oil	Church & Dwight Co., Inc.
Silk 6-0	Surgical Specialties Corp	752B
Prolene (polypropylene) suture 6-0	Ethicon	8680G
Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0	Ethicon	J386H
Fisherbrand Applicators (Purified cotton)	Fisher Scientific	23-400-115
GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4	Pfizer Pharmaceutical	9039605
Autoclip Wound Clip Applier	BD	427630
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Autoclip remover	BD	427637
Aound clip	BD	427631
MRI 7 Tesla	Bruker Corporation
Paravision 5.0 software	Bruker Corporation
CO2 Euthanasia system	VetEquip
25 G 5/8 Needle (for heart-puncture)	BD	305122
0.1 ml syringe (for heart-puncture)	Terumo	SS-01T
K3-EDTA Micro tube 1.3 ml	Sarstedt	41.1395.105
10% Neutral Buttered Formalin	Fisher Scientific	SF100-4