傾斜孔サイズを有するポリ（乳酸）スキャフォールドを製造するために簡便かつ環境に優しいルート

要約

In this work, poly(lactic acid)/polyethylene glycol (PLA/PEG) scaffolds were prepared by using a combination of melt mixing and selective leaching. The method herein discussed permitted to develop three-layer scaffolds by highly controlling both porosity and pore size. The mechanical properties were also evaluated in a physiological environment.

要約

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of this new field of biomaterials research is due to the necessity to develop implants capable of mimicking the complex functionality of the various tissues, including a continuous change from one structure or composition to another. In this latter context, one topic of main interest concerns the design of appropriate scaffolds for bone-cartilage interface tissue. In this study, three-layered scaffolds with graded pore size were achieved by melt mixing poly(lactic acid) (PLA), sodium chloride (NaCl) and polyethylene glycol (PEG). Pore size distributions were controlled by NaCl granulometry and PEG solvation. Scaffolds were characterized from a morphological and mechanical point of view. A correlation between the preparation method, the pore architecture and compressive mechanical behavior was found. The interface adhesion strength was quantitatively evaluated by using a custom-designed interfacial strength test. Furthermore, in order to imitate the human physiology, mechanical tests were also performed in phosphate buffered saline (PBS) solution at 37 °C. The method herein presented provides a high control of porosity, pore size distribution and mechanical performance, thus offering the possibility to fabricate three-layered scaffolds with tailored properties by following a simple and eco-friendly route.

概要

The interest in biodegradable polymers has grown in importance during the last years both in academia and in the industry, due to the rising concerns regarding plastic waste and the reduction in using non-renewable sources^1-7. In particular, biocompatible and biodegradable synthetic polymers are widespread in several biomedical application fields, such as drug controlled release^8,9, absorbable suture threads^8,10, bioprocess intensification¹¹ and tissue engineering¹².

Tissue engineering focuses on the development of devices capable to restore and maintain normal function in diseased or injured tissues. Most of the native tissues are composed by different types of cells and extracellular matrices (ECMs) in specific spatial hierarchies. For example, articular cartilage (AC) consists of different zones with varying types and orientations of collagen fibers and collagen-binding proteins. Moreover, cartilage and bone show significantly different hierarchical structures. In this context, the preparation of multilayer scaffolds with engineered properties in each layer could allow replacing heterogeneous tissues by taking into accounts all the local microenvironments of these complex systems^13,14.

Based on the cellular/biological and/or physical-chemical characteristics of the scaffolds, the main strategies adopted by the tissue engineering can be divided into monophasic, biphasic, and triphasic. Biphasic and triphasic approaches (BTA) use two or three different pores architectures, materials, or fillers to prepare multilayered functional devices. Furthermore, a single material can be used to achieve biphasic or triphasic devices, as long as it is possible to create a gradient in its physical properties¹².

Cell migration plays a key-role in the morphogenesis, inflammation, wound healing and tumor metastasis. Cell movement is encouraged by the presence of a gradient of chemical-physical properties from the surface to the core of the device. Therefore, biomaterials fulfilling the above discussed requirements can be helpful in studying cell migration. In addition to chemical gradients that trigger cells migration (chemotaxis), mechanical properties of cells culture substrate can also lead to cell movement (mechanotaxis)¹⁵.

The multilayer structure can also provide the tunable release of specific drugs incorporated within the polymer matrix, by changing the specific area of the layer or the amount of loaded drugs.

Over the past decade, in order to develop scaffolds possessing a discrete or continuous gradient of morphological properties, such as porosity or pore size, several approaches have been presented^16-31. The most recent papers focused on the preparation of BTA by adopting: particle leaching ^12,28,32, gas foaming technique¹⁶, electrospinning^17-19, layer by layer casting technique²⁰, rapid prototyping^21,22, thermally induced phase separation (TIPS)²², centrifugation freeze drying^24,25, triply periodic minimal surfaces (TPMS)²⁶, freeze casting^27-30.

Within the frame of this work, we present a fast and simple route to achieve PLA-based three-layer porous scaffolds (TLS), by combining melt mixing, compression molding and salt leaching. Differently from most of the technologies commonly used for scaffold production, the strategy herein adopted can be considered fully eco-friendly, since it does not require any toxic solvent potentially dangerous for environment and for living cells and tissues³². The basic processing-structure-property relationships established in this study by analyzing both morphological features and mechanical behavior of fabricated devices provide guidance to future advances in designing multifunctional graded scaffolds with specific target properties.

プロトコル

1.足場製作

1. 20分間実験室ブレンダー中のNaClを粉砕し、100℃のヒーターでそれを乾燥させます。
2. 共振で発生することなく、利用可能な最高周波数で30分間ふるい機で乾燥させたNaClを（一度に45グラム）を入れてください。 500ミクロン〜1000ミクロン（M 500）に至るまで、6塩画分を収集します。 300ミクロンから500ミクロン（M 300）へ。 100μmから200μmの（M 100）。 90ミクロンから100（M 90）へ。 図1に図式のような塩の粒子と45ミクロン〜65ミクロン（M 45）から、最終的にM 10は、45ミクロンよりも小さいサイズ。
3. 真空は、処理中に加水分解切断を回避するために、一晩、すべての材料を乾燥させます。ガラス転移 - ポリマーの場合に - 各材料については、克服することなく、乾燥の程度を最大化するために温度を選択します。したがって、PEGのためのPLAのためのT = 90℃、T = 25°C、T = NaClを105℃を選択します。
4. フィード通常、約後、次にそれぞれ20/5/75の重量パーセント組成を有するPLA、PEGおよびNaCl、T = 190°Cで動作するバッチミキサーおよびN = 60回転数とトルクの一定値を達成するまで、それらを処理し、 10分。その後、急速に得られた材料を集めます。
5. 10ミリメートルの直径と3ミリメートルの高さと適切な円筒状の金型でブレンドを入れて、周囲圧力で60秒、3分の180バーでのためにそれらを保つため、210℃で動作する実験用プレスを用いて、単層を準備します。その後、180バールの圧力を維持し、室温でブレンドを冷却します。
6. 圧縮成形を介した三層の組立
   1. 10mmの直径および1mmの高さを有する同一（1.5）に記載されているような方法が異なる金型を用いて、すなわち、各単層を調製します。最後に、6つのディスクは、6つの異なる粒子サイズを含む、10mmの直径および1mmの高さを有し得る：M 500、M 300、M 100、
   2. フォーR 3層足場A（TLS A）を組み立て、M 500、M 300を積み上げるとM 100、円筒状金型内および周囲圧力で60秒間、210℃で動作する実験用プレスでそれらを圧縮成形し、3分でその後、180バーとは、180バールの圧力を維持し、室温で冷却しました。
      注：相互M 90上に積層してTSL Bを準備M 45とM 10と同じ金型及びTLS Aに用いたのと同じ手順に従って、圧縮成形作業を行います
7. 円筒型からディスクを削除し、攪拌せずに、沸騰脱塩水浴に入れます。 3時間後、浴から得られた多孔質構造体を除去し、化学フード中、室温で12時間のためにそれらが乾燥してみましょう。

2.形態素解析

1. 走査型電子顕微鏡により、足場の形態を評価します。
   1. 取り付け後、液体窒素下で試料を分解し、接着剤カーボンテープを使用したアルミニウムスタブ上のサンプル。最後に、スパッタcoateを金で撮影前にアルゴン雰囲気下で90秒間の試験中に静電放電を回避するために。

3.足場孔径

1. 足場の孔径分布を認識することができる画像処理ソフトウェアを用いてSEM分析によって得られた画像を精巧。
   注：この研究では、細孔径分布分析は、MATLABベースのソフトウェアを用いて行った以前^33に記載

4.気孔率

1. 浸出の前にサンプルを秤量し、次式により理論的な多孔性を評価します：
   
   注_：NaClを 、 メートル_PEGおよびm _PLAを M、均質なブレンドを仮定することにより、それぞれのNaCl、PEG、およびPLAの理論上の質量です。 T彼は（ρ）のNaCl、PEG及びPLAのは、それぞれ2,16グラム/ cm ³であり、1,12グラム/ cm ³の電子1,24グラム/ cm ³である密度。
2. 試料（ρ _骨格 ）の見掛け密度を評価するために浸出し、乾燥後の試料を秤量し、次に足場の見掛け密度との比とすることにより、非多孔質PLAの濃度の逆数として実際の多孔性を評価します式（2）を使用。
   注：これは、足場の空のボリュームと（空+フル）足場のフルボリュームとの間の比率を表しています。
   

5.機械的性質

1. 1 kNのロードセルを装備した引張機を使用して、圧縮モードでサンプルをテストします。分^-1 1mmの一定の歪み速度を設定します。
2. 生理学的環境におけるサンプルの機械的性能を調べるために、dynamometeを装備37℃で含有する浴（PBS）、（でpH = 7.4）とrと点5.1で説明したものと同じ設定でテストを行います。
   1. 湿潤環境内の各測定の前に、PBSは、全ての孔を埋めるようにするために5分間の真空フラスコ中で、PBSでサンプルを浸します。その後、足場は設定点温度に到達するために15分間37℃でPBS中に残存することを可能にします。
3. 文献^32,34に記載の方法以下の機械的試験機に接続されたカスタムデザインの界面強度試験装置を用いてTL AとTL Bの層の間の界面接着強度（IAS）を決定します。
   1. リグ上の足場を修正して、マシンのロードセルとベースプラテンとの正確な位置合わせを確保します。高粘度の接着剤を用いてアルミニウム試験スタブに足場サンプルを取り付け、テストのための機器に入れます。
   2. 湿潤状態の試験では、1時間のpri PBS中のサンプルを水和または試験へ。分^-1 1mmのひずみ速度で適用される引張荷重の下で、1 kNのロードセルを使用してください。
      注：障害がいずれかの層の一つの極限引張強さでため、または界面での剥離の発生する可能性があることを考慮してください。応力 - ひずみ曲線の最大強度としてIASを評価します。

結果

足場の孔のアーキテクチャ上のNaCl粒子サイズの影響は、それぞれ、試料の形態を調査し、画像解析により細孔サイズ分布を計算することによって定性的および定量的に評価した図2a - 。fは 、得られた単層足場のSEM顕微鏡写真を示します別のNaCl粒子サイズを含む材料の塩浸出から。

より詳細には?...

ディスカッション

最初の重要なステップは、効率を篩い分けの最適化です。 NaClの粒径の高い制御は、所望の細孔サイズ分布を有する足場を調製するための基本です。もう一つの重要なステップは、金型からサンプル抽出の際に薄いPLA単層の破壊を回避されています。画像処理解析は、装置全体の代表ではないかもしれません。

引張試験中、サンプルは機器から離れて引き裂くことができ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(lactic acid)	NatureWorks	PLA 2002D
Poly(ethylene glycol)	Sigma	83797-1KG-F
Sodium Cloride	Sigma	793566-5KG-D
Phosfate Buffer Solution	Sigma	P5368-10PAK
Laboratory Mixer	Brabender	PLE 330 - Plasticorder
Laboratory Press	Carver
Scanning Electron Microscopy	Phenom-world	ProX
Universal Testing Machine	Instron	3365 (UK)
BioPuls Bath	Instron, Norwood
Sieving Machine	Endecotts	E.V.F.1.
Vacuum Oven	ISCO	NSV9035
Precision Balance	Sartorius	AX224