P10ラットにおける新生児脳卒中の一過性中大脳動脈閉塞モデル

要約

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

要約

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

概要

新生児期間中の脳卒中は、できるだけ多く2300で1として出生¹で発生し、死亡および障害の重要な原因です。これは、変更された中枢神経系の発達につながり、てんかんの発生率の増加、脳性麻痺、精神遅滞、およびモータや認知機能障害の他のタイプを含む、長期罹患率を増加させました。早期の脳卒中の生涯効果は負傷者の脳を保護するために、または修理を強化するための戦略を含めて、この集団に損傷および修復のメカニズムを調べるための翻訳動物モデルが不可欠にします。

別の虚血モデルは、成体動物で脳損傷を研究するために使用されている、と米・バンヌッチ（修正レヴァイン^）2手順は、一般的に脳の発達に低酸素性虚血性傷害を研究するために使用されている間、局所虚血-再灌流傷害の明確なメカニズムであります負傷したコアとpenuで、局所損傷の原因となりますmbraと無傷リモート組織。小泉³とロンガ⁴モデルはそれぞれ、総頸動脈（CCA）と外頚動脈（ECA）を経由して中大脳動脈閉塞を達成するために成体ラットに開発されました。両方のモデルでは、動脈枝の永久結紮および焼灼は、出血を最小限に抑え、また、損傷後の餌にすると重量を得るために、動物の能力に悪影響を引き起こし、外科的処置を、合理化することが重要です。また、未成熟脳における異なる損傷メカニズムと結果として見られる損傷の特定のパターンがあります。

さらに最近では、光血栓脳卒中（ローズ・ベンガル法^）5と永久MCA結紮^6は、新生児と成人のストロークを研究するために使用されています。光血栓脳卒中やMCAライゲーションの両方がreperfusの欠如につながる脳の血流の永続的な変更を作成しますイオン。再灌流が増加興奮毒性、フリーラジカル形成、及び虚血位相⁷は異なるシグナル伝達カスケードを伴う遅延細胞死をもたらす一酸化窒素産生と、焦点傷害の発症および進行の重要な成分です。低酸素性虚血はまた、ヒトにおける低酸素性虚血性傷害の原因とは異なり、怪我をコアと半影の研究はより困難作り、一貫性のある局所損傷パターンが発生することはありませんグローバル低酸素状態が続く永久一方的な頸動脈結紮を伴います。

我々は以前に中大脳動脈閉塞^{（MCAO）8、9、10を}使用して未熟ラットにおける非出血性虚血再灌流脳卒中モデルを説明してきました。これは、アクセスして永久ligatiずに内頸動脈を介してMCAを閉塞低侵襲性の方法であります上または焼灼。これは、周産期^11、12における脳卒中の最も一般的な原因に似た傷害のモデルを提供します。同側線条体と頭頂側頭皮質への損傷で傷害の結果のこの虚血再灌流モデル。 tMCAOのこのモデルはまた、閉塞の継続時間を変化させることにより、損傷の重症度を制御できます。シグナル伝達経路と、負傷したコアと半影中および無傷の同側および対側の組織における組織学的変化の検討がさらに未熟な脳に損傷および修復のメカニズムを解明することができます。この研究は、脳の発達のために、この重要な損傷モデルのデモンストレーションを行います。

プロトコル

すべての動物研究は、カリフォルニア大学、動物研究に関するサンフランシスコ委員会によって承認され、 実験動物の管理と使用に関する指針 （米国保健社会福祉省、公開番号85から23、1985に準じて行きました）。動物は密接にAAALACの認定を受けUCSF施設内動物管理使用委員会（IACUC）の獣医によってモニターしました。 8日齢のゴミの一つのメスのスプラーグ - ドーリーラット（ごみあたり10匹）を得ました。子犬は10日齢までは母と彼女の子犬は、食料と水を自由に与え、毎日の濃縮と温度および光制御の動物ケア施設に収容され、IACUCプロトコルあたりました。この手順で使用するすべての手術器具は、無菌性を確保するためにオートクレーブしました。楽器のヒントの無菌性は、手術全体を通して維持されます。

1.中大脳動脈閉塞

1. 子犬とensurを計量それは、適切な量（19〜21グラム）であり、E。 100％O ₂中の3％イソフルランで子犬を麻酔し、足のピンチに応答がないことを確認してください。外科段階下の加熱パッドを用いて、35.5℃から37℃の間の体表面温度を維持します。
2. ショルダー領域にわたるテープで仰臥位で動物を固定します。滅菌綿棒を用いて、計4つのスワブ各溶液間で交互に、二重蒸留水中の70％エタノールのスワブ続いポビドンヨード溶液で前頸部領域をスワブ。
3. ローカル計画切開部位に0.25％ブピバカインに潜入。ステレオスコープを使用して、総頸動脈（CCA）を露出するために5〜7ミリ、前頸部切開を正中線を作ります。オープン露出した動脈空洞を保つために2-4リトラクターを配置します。
4. 内頸動脈（ICA）、後頭動脈（OA）、および外頸動脈（ECA）を見つけます。クリアな視界を得るために動脈をグルーミング。車のことeful迷走神経を邪魔しないように。
   注：偽手術の仔については、切開部が閉じられた縫合された後、inicisionが開いたままにして、動脈が露出されています。全身麻酔時間は閉塞手術と同等です。
5. 6-0絹編組縫合糸1.5センチカットします。一本鎖を引き出し、縫合糸をUnbraid。単一ストランドが擦り切れきちんとしていないことを確認してください。
   注：必要に応じて、滅菌水で一本鎖を浸漬し、鉗子の先端を有するストランドをグルーミングすることによりほつれ端をsmoothe。
6. 45度の鉗子で縫合糸を保持しながら、鉗子先端がICAとOAとの間に出てくるようにICAの下に行くことを掃引円弧運動に鉗子を移動させます。
   注：解剖がよく行われている場合は、このステップは比較的容易になります。 ICAとOAが接触している場合は、ICAを隔離するために鉗子を使用しているときの動脈を破裂しないように注意してください。出血が発生した場合は、まで、鉗子で動脈に圧力をかけます出血が停止します。滅菌綿棒で血液を吸収します。
7. 鉗子によって保持された縫合糸の終わりをつかみ、最後はアクセスしやすいように、それを引きます。鉗子からストランドを解放し、ステップ1.5（ 図1A）の動きを逆に、ICAの下から鉗子バック。
8. ベース、それはCCAから離れた場所に最も近いでICAの周りに一時的な合字を接続します。
   注：があることを確保しつつ、結び目を除去するためにプルされるストランドの端部は、容易に鉗子で把持する（1mm以上、3mm未満）十分な長さであるので、結び目を作ることが重要です後退のための結び目の反対側の縫合糸の適切な量。
9. 注意深く横ICAを撤回し、切開部と反対側の腋窩領域付近の過剰皮膚にストランドを固定するためのクリップを使用します。に、この後退ストランドは、次のステップに進む前に、血液の流れを止めるのに十分なピンと張った状態であることを確認してください制御不能な出血のリスクを最小限に抑えます。動脈が平坦淡であることを確認します。
   注：それはICAの部分的または完全な涙の原因となりますので、上の後退ではないですか。後退は単にクリップの反対側のストランドを引っ張ることにより、動脈切開を行う前に調整することができます。
10. ステップ1.5のように、ICAの下や周りの他の非編組縫合糸とループ、それを把握するために45°の鉗子を使用してください。位置後退鎖（ 図1B）に横このストランド。
    注：このステップはまた、後退する前に行うことができます。後退の品質について不明な場合は、この結び目は非常に緩く、次のステップの前に接続することができます。
11. 結ば結紮に近い誤る、結ばと解け結紮の間に0.2ミリメートルの動脈切開を途中で切断します。
    注：縛らオフ動脈内に残っている血液は、動脈切開を介して空にすることができるが、5μLを超えるべきではありません。出血が続く場合は、慎重に注意して、後退を高めるために後退鎖を引っ張ります過度の緊張から動脈を損傷無効。
12. メトリック定規を使用して、閉塞縫合糸を測定し、再灌流の間オクルーダの除去2-3ミリの余分な余裕を有する縫合糸を切断します。 45度の鉗子でオクルーダを保持し、MCAに到達するために適切な長さで曲げを作成する直線ピンセットを使用して、前進のための停止点をマークします。
    注：曲げに対するシリコーン先端から10mm閉塞長さは、この体重範囲のP10のスプラーグドーリーまたはロングエバンスラット仔のために使用されます。
13. 45°の鉗子を使用して、動脈切開にシリコーンでコーティングされたナイロン閉塞縫合糸を供給し、MCA（ 図1C）に所定の距離をマーク屈曲に縫合糸を進めます。進歩がスムーズに感じていることを確認してください。抵抗が感じられる場合は、直ちに進歩を止めます。前進中、ヘッドに向かって、CC / ECAに平行な方向に縫合糸を目的としています。
    注：縫合糸は、高度な背側である場合、に向けて動物の背骨、それは翼口蓋動脈（PTA）に遭遇することがあります。抵抗が前進3〜5ミリメートル後に感じられた場合、縫合糸は、PTA接合を襲っています。シリコーンヘッドが進行方向を調整する前に、動脈切開の近くにあるまで、動脈のうち、閉塞器をバックアップ。完全に動脈から閉塞器を取り外す必要はありません。
14. ステップ1.10（ 図1D）からストランドを使用して、一時的な結紮を結ぶことにより、オクルーダを固定します。
15. リトラクタークリップを取り外します。結び目を取り除くために引っ張られ結び目の鎖がストレートピンセットでつかみやすいですし、結び目を締め引かれるストランドよりも長くなるように、一時的な合字の両方の鎖をトリム。
    注：彼らは閉鎖後の空洞にもつれないように、ストランドは十分に短くなければなりません。
16. リトラクターを削除し、3〜4結節縫合を作成するために、6-0編組シルクを使用して空洞を閉じます。
17. から子犬を削除麻酔は、室内の空気中の加熱パッド上に置きます。それは胸骨横臥を維持し、それは完全にダムに戻す前に回復したことを確認するために十分な意識を取り戻したまで子犬を監視します。子犬が35.5°Cと37°Cの間の体表面温度を維持することを確認してください。
18. 閉塞時には、イソフルラン麻酔下で拡散強調磁気共鳴画像（DW-MRI）を傷害の適切な誘導を確認するために使用することができます。 図2は、tMCAO ⁹時のDW-MRIによって検出された現在進行中の虚血性傷害を示しています。
    注：拡散強調スピンエコープラナーイメージングは​​、前の再灌流に10〜15分を行っています。脳全体は、以下のパルスシーケンスの設定を使用してシリアル2 mm厚の冠状切片で撮像された：TR / TE = 5000/60ミリ秒、4回の平均、視野の= 35 mmで、データマトリックス= 128×128、拡散勾配時間= 20 MS、分離= 29.7ミリ秒、振幅= 70mT / mであり、B因子= 1,045秒/ mm ²です。このよう脳幹のような皮質の関与または非定型虚血性傷害、性の欠如を示す動物は、除外されています。

2.再灌流

注：閉塞が線条体と皮質を含む傷害の中等度から重度の量を引き起こすために3時間行われます。

1. MCAの閉塞後約2時間と50分で、100％O ₂中の3％イソフルランで子犬を麻酔。外科段階下の加熱パッドを用いて、35.5℃から37℃の間の体表面温度を維持します。
2. ステップ1.16から中断された縫合糸を外し、2合字や閉塞縫合糸の末尾でマークされた接合を、見つけます。
   注：偽手術動物を誘発し、閉塞した動物に相当の期間のために麻酔下で残っています。切開は再び開閉縫合します。偽手術動物の場合は、2.11に進みます。
3. 慎重にUNTIEほとんどの横結び目は、以前に長い鎖を引いて、ステップ1.14で結ば。
   注：結び目をほどくの抵抗がある場合は、結び目の正しい鎖が引かれていることを保証するために停止します。抵抗が続く場合は、より良いビュー倍率を上げます。このステップの間に動脈を損傷することが可能であるとして、ほどくときは注意してください。
4. 空洞から縫合糸を外します。
5. MCA閉塞後、正確に3時間で、ゆっくりと動脈の閉塞から縫合糸をバックアップ。何の抵抗はありません。
   注：ほとんどの場合、出血はありません。出血の少量が発生した場合、動脈切開サイトでの動脈に圧力をかけます。
6. 次のステップは、再灌流のためのICAの血流を復元するように、動脈切開に圧力を適用するために鉗子を使用します。
7. 慎重にステップ2.3と同様の方法を使用して、内側結び目をほどきます。
8. 身体から縫合糸を外し、出血を止めるために動脈切開に止血剤を適用します。
9. 出血が止まったことを確認してください。
   注：動脈の元の形状と赤色のリターンは、ICAの血流が回復されたことを確認します。
10. 開創器を取り外し、6-0編んだシルクの3〜4結節縫合して空洞を閉じます。
11. 麻酔から子犬を取り外し、室内空気中の加熱パッド上に置きます。それは胸骨横臥を維持し、ダムに戻す前に、完全な回復を確実にするために十分な意識を取り戻したまでそれを監視します。子犬が35.5°Cと37°Cの間の体表面温度を維持することを確認してください。
12. 5日間毎日子犬を点検。その重みをRecprdし、適切な治癒のために密接に切開部位を検査します。 7-14日後に縫合糸を外します。 ⁹必要に応じて、ポストtMCAOの損傷は、MRIで撮像することができます。
    注：動物は、最初の日に体重1グラムまで失うかもしれませんが、一般的に重量を量る介入なしに体重を取り戻すと同様の範囲内となります日4-5によってコントロールにトンの範囲。まれに、子犬は、経口栄養を必要とすると、2〜3日間フィード、過度の重量を失うしないか、難易度の給餌を有することができます。
13. P21で、損傷は確実に、このようなロータロッドやシリンダーの飼育などの感覚行動試験、と評価することができます。認知試験は、早ければ、このような新規物体認識またはモリス水迷路¹³として評価を用いて生後4〜6週間として行うことができます。
14. 脳収穫^11、12 Euthasolの腹腔内注射（50ミリグラム/キログラム）によってラットを安楽死させます。
15. 介入への損傷ボリュームまたは応答を評価するための組織学的分析は、クレシルバイオレット又はH＆E染色（ 図^3）10を用いて行うことができます。

結果

tMCAOによって引き起こされる損傷の重症度は、閉塞時間と外科医の経験の両方に大きく依存しています。 3 hは中等度から重度の傷害を生成しながら、90分間の閉塞はしばしば、損傷パターンを軽度から中等度の生成します。損傷の重症度は、MRI、組織学、または短期または長期の行動分析を含む種々の方法によって評価することができます。 図2は、DW-MRIは、同側半球を伴う虚血性傷害を確認し、90分間の閉塞に75分を行った例を示します。拡散強調イメージングは​​、急性虚血性段階中に、反対変更することなく、増加した同側線条体における拡散と同側皮質の大部分を示しています。これは、皮質と深い灰白質の両方を含む長期傷害の適度なレベルに相関します。

MCA結果の閉塞でそれほど重傷のための線条体で始まり、長い閉塞時間とより深刻な怪我のために皮質と海馬の負傷を悪化開発された細胞死。それは閉塞^14、15、16の間に適切な縫合糸の配置および浮腫および損傷の進行の視覚化の確認を可能にするように外科技術の最適化中に、そのような糸挿入長さを決定するように、MRIは非常に推奨されています。 MRIが使用できない場合は、H＆Eまたはクレシルバイオレット染色は、傷害の形態を決定するために、シンプルで信頼性の高い組織学的方法であり、tMCAO後の初期および後期の時点の両方で使用することができます。 図3は、同側線条体と皮質における嚢胞形成やボリュームを実証し、3時間閉塞後病理組織学的検査で中等度から重度の損傷パターンを示しています。

対側半球体積に対する同側の比率を計算するためにクレシルバイオレット染色切片の不偏立体定量は、同側の虚血 - 再灌流傷害を確認します。具体的には、Euthasolで動物を麻酔した後、脳を4％パラホルムアルデヒドで0.1 M PBSで経心臓灌流によって回収しました。 30％スクロース中で一晩postfixationと平衡化した後、脳全体を50μmの間隔で切断し、そしてすべての第十二の部分は、選択され装着され、クレシルバイオレット¹⁰で染色しました。

でも、軽度の損傷と、そのような旋回や片麻痺などの運動の変化は、閉塞期間中に記載されています。より深刻な負傷では、これらの変更は、再灌流後に持続します。追加の行動試験は、ロータロッドやシリンダー感覚機能のテストを飼育し、ためのモリス水迷路を含め、損傷の重症度を評価するために使用することができます認知機能^13。

図1：tMCAO 手順のライブ手術画像。工程1.6で詳述するように、（a）第1の縫合糸は、ICAの周りにループされます。 （B）第1の一時的結紮は結ばれ、ICAを後退させます。工程1.9で詳述したように第2の縫合糸ストランドは、第1の縫合糸ストランドの側方、ICAの周りにループされます。 （C）シリコーンコーティングされた閉塞縫合糸はステップ1.12に詳述されるように、動脈切開部位に供給されます。ステップ1.14に詳述されるように（D）は、第2の一時的結紮は、適所にオクルーダを固定するように結ばれます。スケールバー= 1ミリメートル。

図2：Occl 中にMRIusionは、適切な一方的傷害を示します。後方に前方、90分間の閉塞時に行わDW-MRIの冠状画像スライスは、急性期に進行中の虚血性損傷と一致している同側半球（矢印）を伴う増加した拡散を示します。ストローク¹¹から許可を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：tMCAO 以下の4週目に線条体と皮質を伴う片側けが。前方の後方、クレシルバイオレット染色冠状脳切片（各50μm）をP38の動物から採取し、かなり深刻な怪我を実証し（矢印は同側の嚢胞形成を示し、皮質減少し、P10で3時間tMCAO以下線条体体積）。左側の丸い穴は反対半球の識別子を表します。スケールバー= 5ミリメートル。病¹²の神経生物学からの許可を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ

両方の未熟および成熟動物における脳損傷の進行の両方に低体温¹⁷と温熱療法¹⁸の効果が知られているように、まず、完全に回復するまで、麻酔の開始から正常体温を維持することが重要です。動物を確保し、呼吸を監視し、気管が圧迫の自由であることを保証するために切開を、最適な位置を後退させながら、第二に、必要不可欠です。これは、迷走神経刺激による心拍数の変化を引き起こす可能性として第三に、迷走神経を圧迫やストレッチを避けます。 ICAの後退は、動脈切開時の出血を制御する必要があるため、第四に、注意が動脈の損傷を防ぐために、後退時の緊張の度合いに支払わなければなりません。動脈が後退から涙なければ貧しい動脈切開がある場合、または、動物によるリスクに分析から除外されなければなりません出血と貧しい再灌流の。

修正およびトラブルシューティング

ガイドとしてMRIを使用して、縫合糸の長さは、シリコーンチップが正しく局所虚血を作成するために、MCAを閉塞することを確実にするために最適化されてもよいです。 MRIが利用できない場合、切開は、縫合糸の配置を視覚化するために、子犬は、再灌流の前に安楽死させても良いです。必要に応じて縫合糸の長さを調整します。子犬の重量は非常に閉塞縫合糸長さの要件と相関します。閉塞時間は、傷害の重症度の程度を調整するように変更することができます。

加えて、縫合糸の形状及び長さが重要です。 19〜21グラムの重量を量るP10スプラーグ - ドーリーロングエバンスラットの場合は、10ミリメートルは私たちの経験では、挿入の最適な長さです。閉塞縫合糸の更なる挿入は、MCAの穿孔をもたらし得ます。また、各手術における閉塞フィラメントの形状の一貫性は、損傷pの増加一貫性をもたらすであろうattern ^19、20。このような理由から、我々は、この特定の目的のために専門的に製縫合糸を使用してお勧めします。傷害パターンは技術では、一見分違いによる実務家の間で異なる可能性があることに注意することも重要です。

技術の制限事項

小さな、開発げっ歯類ではこの手法を実行すると、豊富な経験が必要です。正しく実行した場合、外科医は、異なるサイズの動物間で非常に一貫性の傷害パターンを引き起こし、95％を上回る生存率を達成することができます。さらに、適切な外科的ツールが不可欠です。手術器具はよく、すべての楽器のヒントが正常に近づくことを保証するために維持しなければなりません。

既存または代替方法に関して、この技術の意義

低酸素虚血、またはライス・バンヌッチモデルながら² 、最も一般的に脳の発達に低酸素性虚血性傷害を研究するために使用される再灌流相に続いて世界的な低酸素のない過渡焦点虚血があるという点で、tMCAOのこのモデルはHIと区別されることに注意することが重要です障害物が除去され、血流が回復されます。これは、より一貫性と再現性の傷害を引き起こし、満期新生児脳卒中で見られるのと同様の損傷パターンを引き起こすことによって、より臨床的な翻訳です。これは、局所損傷パターンや損傷していない組織の代償反応の研究を可能にします。

この技術を習得した後、将来のアプリケーション

このモデルは、人間の新生児における脳卒中の最も一般的な原因、周産期^11、21の間に発生する過渡的な閉塞性血栓に似ています。病因は完全には明らかではないが、最も可能性の高い多因子であるが、それはほとんどの場合、トンで推定されますO胎盤¹¹から渡さ塞栓に起因します。後に発作活動や微妙な焦点神経学的検査値異常²²としばしば存在すると推測周産期脳卒中また、多くの新生児。これは、傷害の進行および重要な可能な治療戦略のメカニズムを識別するために、一貫性のある、翻訳損傷モデルを使用しています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflourane	Henry Schein	50033	anesthetic, at 3%
Trinocular Surgioscope	World Precision Instruments	PSMT5N
Heating pad	Sunbeam	000731-500-000	low to medium setting
IR Thermometer	Extech Instruments	72-5270
Retraction kit for small animals	Fine Science Tools	18200-20
CermaCut Scissors	Fine Science Tools	14958-09
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	112522-00	2x
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	2x
B-2 Micro Clamp	Fine Science Tools	00398-02
Forcepts for Clamp Application	Fine Science Tools	00072-14
Micro Vannas Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2mm cutting edge
Occlusion Sutures	Doccol	602123PK10	701712PK5Re
Ruler	Fine Science Tools
Hemostatic Agent	Avitene	DVL1010590
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture	Ethicon	769G
Euthasol	Virbac	710101	0.22 mL/kg
Cotton Tipped Applicators	Henry Schein	100-9249
Laboratory Tape	VWR	89097-990