Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Modell von Neugeborenen Stroke in P10 Ratten

Zusammenfassung

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Zusammenfassung

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

Einleitung

Schlaganfall während der Neugeborenenperiode ist eine wesentliche Ursache für Tod und Behinderung, in so viele wie 1 in 2300 Lebendgeburten ¹ auftreten. Dies führt zu veränderten Zentralnervensystementwicklung und erhöhte Morbidität langfristige, einschließlich einer erhöhten Inzidenz von Epilepsie, Zerebralparese, geistige Retardierung, und andere Arten von Motor oder kognitiver Dysfunktion. Die lebenslangen Auswirkungen des frühen Schlaganfalls machen translationale Tiermodelle wesentlich für die Mechanismen der Schädigung und Reparatur in dieser Population untersuchen, einschließlich den Strategien für das verletzte Gehirn zu schützen oder Reparatur zu verbessern.

Verschiedene Ischämie Modelle wurden zu studieren Hirnverletzungen bei erwachsenen Tieren verwendet, und während die Reis-Vannucci (Modified Levine) ² - Verfahren üblicherweise verwendet wird , hypoxischischämischer Verletzungen in das sich entwickelnde Gehirn, fokale Ischämie-Reperfusion ist eine deutliche Mechanismus der Schädigung zu studieren Brenn Verletzungen verursachen, mit einem verletzten Kern und penumbra und unversehrtes entfernt liegendes Gewebe. Die Koizumi ³ und ⁴ Longa Modelle wurden in erwachsenen Ratten entwickelt , um transiente Okklusion der Arteria cerebri media über die Arteria carotis communis (CCA) und Arteria carotis externa (ECA) zu erreichen, respectively. In beiden Modellen permanent Ligatur und Kauterisation der Arterie Zweige sind wichtige Blutungen zu minimieren und das chirurgische Verfahren zu straffen, die auch negative Auswirkungen auf das Tier die Fähigkeit, nach einer Verletzung zu füttern und zu Gewichtszunahme führt. Darüber hinaus gibt es verschiedene Verletzungsmechanismen im unreifen Gehirn und spezifische Muster von Verletzungen als Folge gesehen.

Mehr photothrombotic Schlaganfall (Rose-Bengal - Methode) ⁵ und permanente MCA Ligation ⁶ wurden zu studieren Neugeborenen und Erwachsenen Schlaganfall vor kurzem verwendet. Sowohl photothrombotic Schlaganfall und MCA Ligation schaffen dauerhafte Veränderungen der Hirndurchblutung, die in einem Mangel an reperfus führenIon. Reperfusion ist eine kritische Komponente der Entwicklung und Progression von fokaler Verletzung, mit erhöhter Exzitotoxizität, die Bildung freier Radikale, und die Produktion von Stickoxide zu verzögerten Zelltod führt , die Kaskaden beinhaltet Signalisierung , die ⁷ von der ischämischen Phase verschieden sind. Hypoxie-Ischämie beinhaltet permanente Ligatur einseitige Karotis durch globalen Hypoxie gefolgt, die auch beim Menschen von der Ursache für hypoxische-ischämische Verletzung unterscheidet und keine konsistenten fokale Verletzungsmuster verursachen, so dass Untersuchung des verletzten Kerns und Penumbra schwieriger.

Wir haben zuvor eine nicht-hämorrhagische Ischämie-Reperfusion Hubmodell in unreifen Ratten unter Verwendung von transienter Okklusion der Arteria cerebri media (MCAO) ^{8, 9, 10} beschrieben. Dies ist eine weniger invasive Methode, die Zugriffe und verschliesst die MCA durch die Arteria carotis interna ohne permanenten ligatiauf oder Kauterisation. Dies stellt ein Modell der Verletzung ähnlich die häufigste Ursache für einen Schlaganfall in der perinatalen Periode ^{11, 12.} Dieses Ischämie-Reperfusion-Modell der Schädigung führt zu Schäden an den ipsilateralen Striatum und parieto-temporale Kortex. Dieses Modell der tMCAO ermöglicht auch die Kontrolle über die Schwere der Verletzung durch die Dauer der Okklusion variiert. Die Untersuchung von Signalwegen und histologischen Veränderungen in den verletzten Kern und Penumbra und in der unversehrten ipsilateralen und kontralateralen Gewebe können die Mechanismen der Schädigung und Reparatur im unreifen Gehirn aufzuklären. Diese Studie wird diese wichtige Verletzungsmodell für das sich entwickelnde Gehirn nachweisen.

Protokoll

Alle Tierforschung wurde von der University of California, San Francisco Ausschuss für Tierforschung genehmigt und wurde in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (US Department of Health and Human Services, Veröffentlichungs - Nr 85-23, 1985 durchgeführt ). Die Tiere wurden eng von Tierärzten der UCSF Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC), akkreditiert durch AAALAC überwacht. Eine weibliche Sprague-Dawley-Ratte mit einem 8 Tage alten Wurf (10 Welpen pro Wurf) erhalten. Die Mutter und ihre Welpen wurden Nahrung und Wasser ad libitum gegeben und in einer temperatur- und lichtgesteuerte Tierstation mit täglichen Anreicherung pro IACUC Protokoll untergebracht, bis die Welpen 10 Tage alt waren. Alle chirurgischen Instrumente in diesem Verfahren verwendet wurden autoklaviert Sterilität zu gewährleisten. Sterility von Instrumentenspitzen wird während der Operation beibehalten.

1. Middle Cerebral Artery Occlusion

1. Wiegen Sie die Welpen und ensure, dass es das richtige Gewicht (19-21 g). Anesthetize den Welpen in 3% Isofluran in 100% O ₂ und stellen Sie sicher , dass es keine Antwort auf einen Fuß Prise ist. Aufrechterhaltung der Körperoberflächentemperatur zwischen 35,5 ° C und 37 ° C mit der Verwendung von einem Heizkissen unter der chirurgischen Stufe.
2. Sichern das Tier in einer Rückenlage mit Klebeband über den Schulterbereichen. Mit einem sterilen Wattestäbchen, Tupfer den vorderen Halsbereich mit Povidon-Iod-Lösung mit einem Tupfer von 70% Ethanol in Wasser bidest, zwischen jeder alternierenden Lösung für vier Tupfer insgesamt.
3. Vor Ort infiltriert 0,25% Bupivacain in die geplante Einschnittstelle. Verwendung eines Stereoskop, stellen eine Mittellinienincision 5 bis 7 mm anteriore zervikale Inzision der Arteria carotis communis (CCA) zu belichten. Platzieren 2-4 Retraktoren den Hohlraum offen ist und die Arterie freigelegt zu halten.
4. Suchen Sie die Arteria carotis interna (ICA), A. occipitalis (OA) und A. carotis externa (ECA). Bräutigam die Arterien eine klare Sicht zu bekommen. sein Autoeful nicht den Vagusnerv zu stören.
   HINWEIS: Bei scheinoperierten Welpen wird die inicision offen gelassen und die Arterien freigelegt wird, wonach der Einschnitt geschlossen wird vernäht. Die Gesamtzeit der Anästhesie ist äquivalent zu derjenigen der Okklusion Chirurgie.
5. 1,5 cm geschnitten, von 6-0 Seiden geflochtene Nähfaden. Unbraid die Naht, Einzelstränge herausziehen. Achten Sie darauf, dass die einzelnen Stränge sind ordentlich und nicht ausgefranst.
   Hinweis: Falls erforderlich, smoothe die ausgefransten Ende durch den einzelnen Strang in sterilem Wasser eintaucht und den Strang mit Pinzettenspitzen pflegen.
6. Während des Nahtstrang mit 45-Grad-Pinzette, die Zange in einer geschwungenen Bogenbewegung bewegt unter dem ICA zu gehen, so daß die Pinzettenspitzen zwischen den ICA und OA entstehen.
   HINWEIS: Wenn die Präparation gut gemacht ist, wird dieser Schritt relativ einfach sein. Wenn die ICA und OA berühren, darauf achten, nicht die Arterien reissen, wenn die Zange mit der ICA zu isolieren. Wenn die Blutung auftritt, Druck auf die Arterie mit der Zange bisdie Blutung stoppt. Absorbiert das Blut mit einem sterilen Tupfer.
7. Ergreifen Sie das Ende des Nahtfadens, der durch die Zange gehalten wird, und ziehen Sie es so, dass das Ende leicht zugänglich ist. Lassen Sie den Strang aus der Zange und zurück , um die Zange aus unter dem ICA, Umkehren der Bewegung in Schritt 1.5 (1A).
8. Binden Sie eine temporäre Ligatur um den ICA an der Basis, in der Nähe, wo sie von der CCA trennen.
   Hinweis: Es ist wichtig, den Knoten zu binden, so dass das Ende des Stranges, der den Knoten ist lang genug, um (größer als 1 mm, weniger als 3 mm), um bequem zu greifen mit einer Pinzette zum Entfernen gezogen werden, während sichergestellt wird, dass es eine ist, geeignete Menge an Nähfadenstrang auf der anderen Seite des Knotens zum Zurückziehen.
9. einfahren sorgfältig die ICA seitlich und mit einem Clip des Stranges, um überschüssige Haut in der Nähe der Achselhöhle Bereich auf der Seite gegenüber dem Einschnitt zu befestigen. Sicherzustellen, dass dieser zurückziehenden Strang straff genug ist, den Blutfluss zu stoppen, bevor zu dem nächsten Schritt fortgefahren wird, bisdas Risiko von unkontrollierten Blutungen minimieren. Beachten Sie, dass die Arterie ist flach und blass.
   HINWEIS: Nicht über-Rückzug, da es einen teilweise oder vollständigen Riss des ICA verursachen kann. Der Rückzug kann einfach eingestellt wird, bevor die Arteriotomie zu machen, indem Sie auf der Seite gegenüber dem Clip auf den Strang ziehen.
10. Verwenden einer Pinzette 45 ° eines anderen unbraided Nähfadenstrang Schleife zu erfassen und sie unter und um das ICA, wie in Schritt 1.5. Position seitlich dieser Strang auf den Rückzug Strang (1B).
    HINWEIS: Dieser Schritt kann auch vor dem Zurückziehen erfolgen. Wenn Sie sich unsicher über die Qualität des Rückzugs, kann dieser Knoten sehr lose vor dem nächsten Schritt gebunden werden.
11. Geschnitten, um eine 0,2 mm Arteriotomie der Mitte zwischen den gebundenen und ungebundenen Ligaturen, näher an die gebundenen Ligatur irrendes.
    HINWEIS: Blut im abgebundenen Arterie verbleibenden durch die Arteriotomie entleeren kann, aber nicht mehr als 5 & mgr; l nicht überschreiten. Bei andauernden Blutungen, vorsichtig den Rückzug Strang zieht Rückzug zu erhöhen, mit Vorsicht einesLeere die Arterie vor übermäßiger Spannung zu beschädigen.
12. Verwendung eines metrischen Lineals, messen die verdeckenden Naht und schneiden die Naht mit einem zusätzlichen Freibetrag von 2-3 mm zur Entfernung des Okkluders während der Reperfusion. Halten Sie den Okkluder mit 45-Grad-Zange und gerade Zange verwenden, um eine Biegung auf die entsprechende Länge zu erstellen, die MCA zu erreichen, ein Haltepunkt für den Aufstieg Markierung.
    HINWEIS: Eine 10 mm Länge von dem Okklusion Silikonspitzenende der Biegung für P10 Sprague Dawley oder Long-Evans-Ratten-Jungtiere in diesem Gewichtsbereich verwendet.
13. Unter Verwendung einer Pinzette 45 °, speisen die silikonbeschichteten Nylon Okklusion Naht in die Arteriotomie und bewegen sich die Naht an die Biegung, die den vorher festgelegten Abstand zu der MCA (1C) markiert. Stellen Sie sicher, dass Fortschritt fühlt sich glatt; sofort stoppen Fortschritt, wenn ein Widerstand zu spüren ist. Während des Vorschiebens zielt die Naht in eine Richtung, die die CC / ECA parallel ist, in Richtung des Kopfes.
    HINWEIS: Wenn die Naht vorgerückt vom Rücken her, in Richtungdes Tieres Wirbelsäule, kann es in die Pterygopalatinarterie (PTA) laufen. Wenn der Widerstand nach 3-5 mm des Vorschubs zu spüren ist, hat die Naht den PTA-Übergang getroffen. Zurück, um den Okkluder aus der Arterie, bis der Silikonkopf in der Nähe der Arteriotomie ist die Vorschubrichtung vor dem Einstellen. Es ist nicht notwendig, um vollständig den Okkluder aus der Arteriotomie zu entfernen.
14. Sichern den Okkluder durch eine temporäre Ligatur Binden, mit dem Strang aus Schritt 1,10 (1D).
15. Entfernen Sie den Aufroller Clip. Schneiden Sie die Stränge sowohl der temporären Ligatur, so daß der Strang der Knoten, der gezogen wird, um den Knoten zu entfernen, ist leicht mit geraden Zange greifen und ist länger als der Strang, der gezogen wird, um den Knoten zu.
    HINWEIS: Die Stränge kurz genug sein müssen, damit sie in dem Hohlraum nach dem Schließen nicht Gewirr.
16. Entfernen Sie die Retraktoren und schließen Sie den Hohlraum mit 6-0 geflochtener Seide drei vor vier unterbrochenen Nähten zu erstellen.
17. Entfernen Sie den Welpen ausAnästhesie und legen Sie es auf einem Heizkissen in der Raumluft. Überwachen Sie den Welpen, bis sie genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedererlangt hat und sicherzustellen, dass sie vollständig, bevor es an den Damm erholt zurück. Stellen Sie sicher, dass die Welpen einen Körperoberflächentemperatur zwischen 35,5 ° C und 37 ° C hält.
18. Während der Okklusion, diffusionsgewichtete Magnetresonanztomographie (DW-MRI) unter Isofluran-Narkose kann verwendet werden, um die geeignete Induktion der Verletzung zu überprüfen. Abbildung 2 zeigt laufende ischämische Schädigung nachgewiesen durch DW-MRT während tMCAO ^9.
    HINWEIS: Diffusion-gewichteten Spin-Echo-Planar-Bildgebung 10-15 min vor der Reperfusion durchgeführt wird. Das gesamte Gehirn wird mit seriellen 2 mm dicken koronalen Schnitten unter Verwendung der folgende Impulsfolge Einstellungen abgebildet: TR / TE = 5,000 / 60 ms, 4 Mittelwert, Sichtfeld = 35 mm, Datenmatrix = 128x128, Diffusionsgradienten Dauer = 20 ms, 29,7 ms = Trennung, Amplitude = 70mt / m, und B-Faktor = 1,045 s / mm ^2.Tiere einen Mangel an kortikaler Beteiligung oder atypischer ischämischer Verletzung aufweisen, wie im Hirnstamm, sind ausgeschlossen.

2. Reperfusion

HINWEIS: Occlusion wird 3 h ausgeführt, um eine moderate bis schwere Menge von Verletzungen verursachen die Striatum und Kortex beteiligt sind.

1. Bei ca. 2 h und 50 min nach Verschluss der MCA, betäubt die Welpen in 3% Isofluran in 100% O _2. Pflege eine Körperoberflächentemperatur zwischen 35,5 ° C und 37 ° C mit der Verwendung von einem Heizkissen unter der chirurgischen Stufe.
2. Entfernen Sie die unterbrochenen Nähte aus Schritt 1.16 und suchen Sie die Kreuzung, die durch die beiden Ligaturen und das hintere Ende des verdeckenden Naht markiert.
   HINWEIS: Sham-operierten Tieren induziert und für eine entsprechende Zeitperiode an die okkludierte Tieren unter Narkose bleiben. Der Schnitt wird wieder geöffnet und geschlossen vernäht. Für scheinoperierten Tiere, gehen 2,11 zu treten.
3. sorgfältig untiedie seitlichen Knoten zuvor in Schritt 1.14 durch Ziehen des längeren Stranges gebunden.
   HINWEIS: Wenn es Widerstand ist, den Knoten in ungebundenen, um sicherzustellen, zu stoppen, dass der richtigen Strang des Knotens gezogen wird. Wenn der Widerstand weiter erhöht Vergrößerung für eine bessere Sicht. Seien Sie vorsichtig, wenn Aufhebung der Bindung, wie es möglich ist, die Arterie während dieses Schrittes zu beschädigen.
4. Entfernen Sie den Nahtmaterialstrang aus dem Hohlraum.
5. aus der Arterie bei genau 3 Stunden nach MCA-Okklusion, langsam die verdeckende Naht zurück. Es wird kein Widerstand.
   HINWEIS: In den meisten Fällen wird es keine Blutungen. Wenn eine kleine Menge von Blutungen auftritt, Druck auf die Arterie an der Arteriotomiestelle.
6. Verwenden einer Pinzette Druck auf die Arteriotomie anzuwenden, da der nächste Schritt für Reperfusion ICA Blutfluß wieder herstellt.
7. Sorgfältig löst die mediale knot 2.3 das gleiche Verfahren wie in Schritt verwendet wird.
8. Entfernen Sie den Nähfadenstrang aus dem Körper und gelten Blutungen ein Hämostatikum auf die Arteriotomie zu stoppen.
9. Stellen Sie sicher, dass die Blutung zum Stillstand gekommen ist.
   HINWEIS: Die Rückkehr der ursprünglichen Form und roter Farbe der Arterie bestätigt, dass ICA Blutfluss wieder hergestellt ist.
10. Entfernen Sie die Retraktoren und schließen Sie den Hohlraum mit drei vor vier Nähten von 6-0 geflochtenen Seide.
11. Entfernen Sie die Welpen aus der Narkose und legen Sie es auf einem Heizkissen in der Raumluft. Überwachen Sie es, bis es war ausreichend wieder zu Bewusstsein zu Brustlage zu halten und vollständige Genesung sicherzustellen, bevor sie an den Damm zurück. Stellen Sie sicher, dass die Welpen einen Körperoberflächentemperatur zwischen 35,5 ° C und 37 ° C hält.
12. Überprüfen Sie die Welpen täglich für 5 Tage. die Inzisionsstellen eng für eine angemessene Heilung Recprd ihre Gewichte und inspizieren. Entfernen Sie die Nähte nach 7-14 Tagen. Post-tMCAO Verletzung kann mit MRI abgebildet werden, wenn ⁹ gewünscht.
    HINWEIS: Die Tiere können bis zu 1 g Gewicht am ersten Tag verlieren, sondern wird in der Regel das Gewicht ohne Eingriff wieder sein und sich in einer ähnlichen wiegent Bereich zu Kontrollen von Tagen 4-5. In seltenen Fällen kann ein Welpe übermäßiges Gewicht verlieren oder Schwierigkeiten Fütterung hat, orale Gabe erfordert 2-3 Tage für Feeds.
13. Bei P21 können Verletzungen zuverlässig mit sensomotorische Verhaltenstests, wie RotaRod oder Zylinderhaltung beurteilt werden. Kognitive Tests können bereits 4-6 Wochen alt durchgeführt werden Einschätzungen wie neuartige Objekterkennung oder das Morris - Wasserlabyrinth ^13.
14. Euthanize die Ratten durch intraperitoneale Injektion von Euthasol (50 mg / kg) für Hirn Ernte ^{11, 12.}
15. Histologische Analyse Verletzungs Volumen oder Reaktion auf Interventionen beurteilen können mit Kresylviolett oder H & E - Färbung (Abbildung 3) ¹⁰ durchgeführt werden.

Ergebnisse

Die Schwere der durch tMCAO verursachten Schädigung ist stark abhängig sowohl von der Okklusion Zeit und der Erfahrung des Chirurgen. Eine 90-min Okklusion erzeugt oft ein leichtes Verletzungsmuster zu moderieren, während 3 h eine moderaten bis schweren Verletzungen erzeugt. Schwere der Verletzung kann durch eine Vielzahl von Methoden, einschließlich MRT, Histologie, oder kurz- oder langfristigen Verhaltensanalysen bewertet werden. Abbildung 2 zeigt eine Beispiel für die DW-MRI durchgeführt 75 min in eine 90-min Okklusion, ischämischer Verletzung der Bestätigung der ipsilateralen Hemisphäre beteiligt sind . Diffusionsgewichtete Bildgebung Diffusion in dem ipsilateralen Striatum und die Mehrheit der ipsilateralen Kortex, ohne kontralateralen Veränderungen erhöht demonstriert, während der akuten ischämischen Phase. Dies korreliert mit einem moderaten Niveau der langfristigen Schädigung sowohl die Rinde und die tiefe graue Substanz beteiligt ist.

Occlusion der MCA Ergebnisse inZelltod, die für weniger schwere Verletzungen im Striatum beginnt und entwickelt kortikalen und hippokampalen Verletzung für längere Verschlusszeiten und schwere Verletzungen Verschlechterung. Bei der Optimierung der OP - Technik, wie die Naht Einbaulänge zu bestimmen, wird MRI sehr zu empfehlen, da es für die Bestätigung der richtigen Nahtplatzierung und Visualisierung von Ödemen und Verletzungen Progression während der Okklusion ^{14 erlaubt, 15, 16.} Wenn MRT nicht verfügbar ist, H & E oder Kresylviolett Färbung sind einfach und zuverlässig histologische Methoden Verletzungen Morphologie zu bestimmen und kann sowohl in frühen und späten Zeitpunkt verwendet werden, nachdem der tMCAO. Abbildung 3 zeigt ein moderaten bis schweren Verletzungen Muster auf histopathologische Untersuchung nach einer 3 h Okklusion, Zystenbildung demonstriert und Volumen im ipsilateralen Striatum und Kortex.

Unvoreingenommene stereo Quantifizierung von cresyl-violett-gefärbten Schnitten das Verhältnis von ipsilateral zur kontralateralen hemisphärische Volumen zu berechnen bestätigt ipsilaterale ischämische Reperfusionsschäden. Insbesondere wird, nachdem das Tier mit Euthasol Anästhesierung wurde das Gehirn durch transkardiale Perfusion in 0,1 M PBS mit 4% Paraformaldehyd geerntet. Folgende über Nacht Nachfixierung und Äquilibrierung in 30% Saccharose wurde das gesamte Gehirn auf 50 & mgr; m Intervallen geschnitten und jeder zwölfte Abschnitt ausgewählt wurde, montiert ist , und mit Cresylviolett gefärbt ^10.

Selbst bei leichten Verletzungen, Bewegungsänderungen, wie Kreise und Hemiparese, wird während der Okklusion Zeit zur Kenntnis genommen. Mit schweren Verletzungen, werden diese Änderungen nach der Reperfusion bestehen bleiben. Zusätzliche Verhaltenstests können die Schwere der Verletzung zu beurteilen verwendet werden, einschließlich RotaRod oder Zylinderaufzuchttests für Sensomotorik und das Morris-Wasserlabyrinth fürkognitive Funktion ^13.

Abbildung 1: Live - OP - Bilder des tMCAO Verfahrens. (A) Der erste Nähfadenstrang ist um die ICA geschlungen, wie in Schritt 1.6 beschrieben. (B) Die erste temporäre Ligatur abgebunden und die ICA zurückgezogen wird. Der zweite Nähfadenstrang ist um den ICA geschleift, lateral den ersten Nahtfaden, wie in Schritt 1.9 beschrieben. (C) Das mit Silikon beschichtete Naht Okklusion wird in die Arteriotomie Stelle zugeführt, wie in Schritt 1.12 beschrieben. (D) Die zweite temporäre Ligatur wird bindet die Okkluder in Position zu sichern, wie in Schritt 1.14 beschrieben. Maßstabsbalken = 1 mm.

Abbildung 2: MRT Während OCCLusion Demonstriert die entsprechende Einseitige Verletzung. Von vorne nach hinten, koronalen Bildscheiben des DW-MRI, während einer 90 min Okklusion durchgeführt wird, zeigen erhöhte Diffusion den ipsilateralen Hemisphäre (Pfeile) beteiligt, die mit dem laufenden ischämische Verletzung in der akuten Phase konsistent ist. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Stroke ^11. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Einseitige Verletzung des Striatum und Cortex bei 4 Wochen nach tMCAO Einbeziehung. Posterior nach anterior, Cresyl-Violett-gefärbten koronalen Hirnschnitten (jeweils 50 & mgr; m) von P38 Tieren geerntet ziemlich schwere Verletzungen zeigen (die Pfeile zeigen ipsilateral Zystenbildung und reduzierte kortikalen undstriatalen Volumen) nach einer 3 h tMCAO bei P10. Das runde Loch auf der linken Seite repräsentiert eine kontralateralen Hemisphäre Kennung. Maßstabsbalken = 5 mm. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Neurobiologie der Krankheit ^12. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls

Erstens ist es wichtig , Normothermie von der Einleitung der Narkose bis zum vollständigen Genesung zu halten, da es Auswirkungen sowohl Hypothermie ¹⁷ und Hyperthermie ¹⁸ auf dem Fortschreiten der Hirnschädigung in beiden unreifen und reifen Tieren bekannt sind. Zweitens, während das Tier zu sichern und Zurückziehen des Einschnitt, optimale Positionierung Atmung zu überwachen und sicherzustellen, dass die Luftröhre frei von Kompression ist unerlässlich. Drittens vermeiden Quetschen oder die Vagusnerv-Stretching, wie diese Veränderungen der Herzfrequenz mit Vagusstimulierung verursachen kann. Viertens, weil das Zurückziehen des ICA notwendig ist, Blutungen während der Arteriotomie zu steuern, muss die Aufmerksamkeit auf den Grad der Spannung während des Rückzugs bezahlt werden, um die Arterie zu beschädigen. Wenn die Arterie von Rückzug reißt, oder wenn es eine schlechte Arteriotomie Einschnitt ist, sollte das Tier von der Analyse des Risiko aufgrund ausgeschlossen werdenvon Blutungen und schlechter Reperfusion.

Technische Änderungen und Fehlersuche

Mit MRT als Leitfaden kann die Fadenlänge optimiert werden, um sicherzustellen, dass die Silikonspitze richtig die MCA verschliesst die fokale Ischämie zu erstellen. Wenn MRT nicht verfügbar ist, können Welpen vor der Reperfusion eingeschläfert werden für die Präparation der Platzierung der Naht sichtbar zu machen. Stellen Sie die Fadenlänge nach Bedarf. Das Pup Gewicht korreliert stark mit den verschließenden Fadenlänge Anforderungen. Die Okklusionszeit kann modifiziert werden, um den Grad der Verletzungsschwere anzupassen.

Darüber hinaus Nahtform und Länge sind kritisch. Für P10 Sprague-Dawley-Ratten und Long Evans mit einem Gewicht von 19-21 g, beträgt 10 mm die optimale Länge des Einsetzens in unserer Erfahrung. Ein weiteres Einsetzen des verdeckenden Naht kann in der Perforation des MCA führen. Darüber hinaus führt die Konsistenz in der Form des verdeckenden Fadens in jeder Operation in einer erhöhten Konsistenz Verletzungs pattern ^{19, 20.} Aus diesem Grund empfehlen wir professionell hergestellten Nähte für diesen Zweck verwendet wird. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Verletzungsmuster zwischen Praktikern aufgrund scheinbar winziger Unterschiede in Technik unterscheiden.

Einschränkungen der Technik

Die Durchführung dieser Technik in einem kleinen, Nagetier Entwicklung erfordert viel Erfahrung. Wenn es richtig durchgeführt wird, ist der Chirurg in der Lage, ein sehr konsistentes Verletzungsmuster über Tiere verschiedener Größen verursachen und eine Überlebensrate von mehr als 95% zu erreichen. Darüber hinaus sind geeignete chirurgische Instrumente unerlässlich. Chirurgische Instrumente müssen gut gepflegt werden, um sicherzustellen, dass alle Instrumentenspitzen richtig nähern.

Bedeutung dieser Technik in Bezug auf bestehende oder alternative Methoden

Während Hypoxie-Ischämie oder die Reis-Vannucci Modell ² , wird am häufigsten hypoxischischämischer Verletzung im sich entwickelnden Gehirn zu studieren verwendet wird, ist es wichtig, dass dieses Modell von tMCAO unterscheidet sich dadurch, dass von HALLO zu beachten Ischämie transienter fokaler ohne globale Hypoxie ist, durch eine Reperfusion Phase folgt, wenn die Hindernis entfernt wird und der Blutfluss wieder hergestellt wird. Dies bewirkt, dass eine konsistente und reproduzierbare Verletzungen und ist klinisch translationale durch eine Verletzung Muster ähnlich dem in Vollzeit Neugeborenen Schlaganfall gesehen verursacht. Dies ermöglicht die Untersuchung von fokalen Verletzungsmustern und Ausgleichsreaktionen in unversehrten Geweben.

Zukünftige Anwendungen nach dieser Technik zu meistern

Dieses Modell ist ähnlich wie die häufigste Ursache von Schlaganfällen bei menschlichen Neugeborenen, eine transiente okklusiven Thrombus , die ^{11, 21} während der perinatalen Periode auftritt. Die Ätiologie ist nicht ganz klar und ist wahrscheinlich multifaktoriell, aber es ist in den meisten Fällen t vermuteto von Embolien ergeben sich aus der Plazenta vorbei ^11. Darüber hinaus Anomalien viele Neugeborene mit vermutetem perinatalem Schlaganfall häufig vorhanden mit späterer Anfallsaktivität oder subtiler fokaler neurologischer Untersuchung ^22. Dies macht die Verwendung eines einheitlichen, translationale Verletzungsmodell entscheidende Mechanismen der Schädigung Progression und mögliche therapeutische Strategien zu identifizieren.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflourane	Henry Schein	50033	anesthetic, at 3%
Trinocular Surgioscope	World Precision Instruments	PSMT5N
Heating pad	Sunbeam	000731-500-000	low to medium setting
IR Thermometer	Extech Instruments	72-5270
Retraction kit for small animals	Fine Science Tools	18200-20
CermaCut Scissors	Fine Science Tools	14958-09
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	112522-00	2x
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	2x
B-2 Micro Clamp	Fine Science Tools	00398-02
Forcepts for Clamp Application	Fine Science Tools	00072-14
Micro Vannas Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2mm cutting edge
Occlusion Sutures	Doccol	602123PK10	701712PK5Re
Ruler	Fine Science Tools
Hemostatic Agent	Avitene	DVL1010590
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture	Ethicon	769G
Euthasol	Virbac	710101	0.22 mL/kg
Cotton Tipped Applicators	Henry Schein	100-9249
Laboratory Tape	VWR	89097-990