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要約

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

要約

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 °C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

概要

CFは、上皮陰イオンチャネルをコードする嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）遺伝子の変異によって引き起こされます。 CFは、全世界で約85,000人1に影響を与えます 。 2,000 CFTR変異が同定されている（ www.genet.sickkids.on.ca ）。この多様性は、部分的に観察された疾患表現型（広範囲の説明www.CFTR2.org ）2、3。 CFTR突然変異の6つのクラスは、CFTRタンパク質の発現と機能に及ぼす影響に基づいて定義されている：（I）NO合成、（II）損なわれ、人身売買、（III）、不良チャネル開閉、（IV）変更されたコンダクタンス、通常の（V）減少したレベルCFTRの機能、および（VI）損なわれ、細胞表面安定4。臨床状態と共通のCFTR突然変異がよく研究されていますが、CFTR機能と関係poorl残りますyは特に希少な「孤児」変異（の大規模なグループのために、個々のレベルで理解www.CFTR2.org ）1、3。

最近では、薬物は、突然変異特異的にCFTRタンパク質を標的と開発されています。 CFTRタンパク質を標的とする2つのクラスの薬物は、現在臨床で使用され、異なる作用様式を有します。このようなVX-770などの増強、頂端局在変異CFTRのオープン確率を高め、セル5への添加時に直接作用します。このようなVX-809のような補正器は、小胞体局在ミスフォールドCFTRの人身売買を復元し、効果は6観察される前に、細胞とのプレインキュベーションを必要とします。 CFTR増強、VX-770は、同様に他の8の場合と同様に、G551D変異7、8の被験者のために登録されていますCFTRは、S1251N 9を含む、変異をゲーティング。一緒に、これらの変異は、すべてのCF科目の5パーセントによって運ばれています。他の臨床試験では、VX-770、補正VX-809と組み合わせたが、肺機能にはまだかなりの影響を制限していることが示された患者10の百分の45から50によって運ばF508del突然変異についてホモ接合性の被験者における増悪率の減少を引き起こすしています11。

CF患者の残りの50％以内の薬物応答性被験体を同定するために、従来の臨床試験では、コストと時間がかかり、非常にまれなCFTR遺伝子型を持つ個人のために実行可能ではありません。小説、費用対効果の高い、パーソナライズされた方法は、CFTR突然変異のいずれかのタイプを運ぶ個人へのCFTRモジュレーターの増加数と一致することが重要です。今までは、特定のCFTR変異を有する患者群のトライアル含めることは、hでの変異CFTR遺伝子のトランスフェクションを用いた研究によって導かれていますチャンバー5、6、12をアッシングで電気生理学的研究に続いeterologous電池システム、。適切なCFの動物モデルの不足のために、CF肺の外植片の材料から誘導される空気-液体界面分化気管支上皮細胞における薬効研究は、薬物開発の13、14、15のために使用されています。しかし、肺の外植組織や侵襲的処置の限られた利用可能性はあまり一般的CFTR突然変異の分析を妨げる末期疾患のない被験者からの気管支細胞を取得し、パーソナライズされたファッションで薬物検査を防止することができます。これらの制限を克服するために、人工多能性幹細胞から誘導される大腸オルガノイド、鼻の気道細胞、および気道の細胞のような「簡単なアクセス」組織は、現在、パーソナライズされた薬物治療のために検討されています。

以前、我々は3Dオルガノイド16、17の形で任意の胃腸器官からの培養上皮幹細胞へのプロトコルを確立しました。ヒト結腸/直腸のために、培養条件は、小分子（ニコチンアミド、A83-01と組み合わせ定義された成長因子（上皮増殖因子（EGF）、ガストリンは、Wnt-3A、Rスポンジン3（Rspo3）、及びノギン）を含みます基底膜マトリックスおよびSB202190）。これらの条件下では、単一の幹細胞または小さな組織フラグメントは、閉じた、嚢胞性に外側に向い、その基端側で高い偏上皮によって形成された3D構造を成長させます。すべての細胞型は、典型的には、それらの正常な比率と位置で表示されます。オルガノイドは、毎週の機械的破壊と再メッキにより長期間にわたって拡張することができます。それらは、遺伝的および表現型的に安定であり、長期的な拡大、バイオバンキング17を可能にする、保存することができます。彼らはに適しています2Dセルライン18のために開発された全ての標準的な細胞生物学/遺伝子操作および分析技術。

我々は最近、CFTRの機能を容易にフォルスコリン誘発性腫脹（FIS）アッセイ19、20に大腸オルガノイドで測定することができることを実証しました。コレラ毒素の代わりにフォルスコリン（FSK）や、にさらされたとき、オルガノイドは急速に、それらの環状アデノシン一リン酸（cAMP）のレベルを増加させるCFTRチャンネル19の開口部に回転もたらします。健康な個体から、または残存機能に関連したCFTR変異を有する被験者からのオルガノイドは、その後オルガノイドの内腔へのイオンと水輸送の結果、分泌性下痢のin vitroでの同等物として膨潤します。 CFTR-nullの個人由来オルガノイドによって示されるように大腸オルガノイドのFIS応答は以前に、完全にCFTR依存性であることが示されました特定の薬理学的CFTR阻害剤19を使用することによりND。大きな被写体固有のデータセットは、生検を取った後、数週間以内に導出することができます。

ここでは詳細に説明FISアッセイのために、オルガノイドは、どの年齢で及び限ら不快21を得ることができる直腸生検から培養されます。オルガノイドは、簡単に再密閉し、新しいオルガノイドを形成する単一の陰窩に機械的破壊によって毎週継代します。 FISアッセイを実行するために、これらの破砕少しオルガノイドの〜30-80は、96ウェルプレート19の各ウェルに播種します。アッセイの日に、オルガノイドをカルセイン緑、それがライブイメージングを容易にする、生きた細胞内に保持される蛍光細胞透過性色素で染色します。そして、細胞内cAMPを上昇させ、それによってCFTRを活性化するFSKは、オルガノイド膨潤を促進するために添加されます。頂端CFTRに作用増強を同時にワット追加されますフォルスコリンi番目、CFTRの人身売買を復元補正器に対し、FSKの添加前に24時間を追加されます。オルガノイド膨潤は、フォルスコリン添加時の各時点での全蛍光オブジェクトの合計面積の相対的増加を計算する自動画像解析によって定量化されます。

3Dオルガノイド腫れはアッシングチャンバーで2D培養気道細胞内の既存の電気生理学的CFTRの読み出しを超える利点と欠点を提供します。主な利点は、膨潤アッセイのスループットです。細胞を培養し、培養液の単一タイプを使用してアッセイであり、経験豊富な技術者は、12の患者サンプルで週当たり約1200のデータポイントを文化毎週25オルガノイドサンプルまで定量することができますしながら。私たちは、従来のプレートあたりの重複または三重測定により、単一の実験条件を入力して、三つの独立インキュベーション時点でそのような測定を繰り返します。合計で、約300〜500秒イングルオルガノイド構造は、次に限定された技術的な変動とCFTR機能の非常に正確な測定につながる実験条件、毎に測定されています。この精度は、私たちは明らかにCFTRモジュレーターに残存機能とレスポンスの違いを定義することができ、容易に同一のCFTR突然変異19、22、23、24、25を運ぶ患者間の遺伝的背景の影響をピックアップすることを可能にします。データの品質は、容易に顕微鏡画像から評価することができます。 FISは完全にCFTR依存性であるが、それはその読み出し流体輸送へのイオン輸送のカップリングによる、CFTR機能のための間接的なアウトカム指標です。これは、経上皮イオン電流26を測定アッシングチャンバーで直接CFTR機能の測定、とは対照的です。アッシングチャンバは、頂端または側底Cの選択刺激を可能にします（オルガノイドアッセイは許可されません）ompartments。側底膜を透過性にすることにより、頂端CFTR依存性アニオン分泌を選択的に27で測定することができます。

プロトコル

本明細書に記載されたヒト組織を用いたすべての実験は、大学医療センターユトレヒト（; TcBio＃14から008 UMCU）で倫理委員会によって承認されました。組織収集、生成、ストレージ、およびオルガノイドの使用のためのインフォームドコンセントをウィルヘルミナ小児病院（WKZ）-UMCUで患者から得られました。

装置 消耗品 ツール
層流フード 15、50mlのコニカルチューブツァイスLSM 800 - 画像を測定するための禅2（青版）ソフトウェア
CO 2インキュベーターマイクロチューブ Microsoft Excelのプログラム
細胞培養顕微鏡（光/光学顕微鏡） 0.22μmのフィルター
遠心血清学的ピペット
ローリング・シェイカーマイクロピペットフィルターチップ
インキュベーターのため4℃の部屋または4℃の冷蔵庫クライオバイアル
CoolCell細胞凍結コンテナ
血清学的ピペッター
Micropippette（千、200及び20μlの）
Viafloリピートピペット
（ライブセル）共焦点顕微鏡
コンピューター
液体窒素タンク
マルチチャンネル（200μL）

文化1.準備試薬

注：すべてのステップは、安全キャビネット内部で行われ、細胞培養物を操作するための標準的なガイドラインに従っています。基底膜マトリックスの素敵な液滴の形成を容易にするために、96、24の予め温めた在庫を維持し、37℃のインキュベーター中で6ウェルプレート。

  1. 基礎培地の準備
    注：基本培地（BM）は、ハムの栄養混合物F-12（AD-DF）とアドバンストダルベッコ改変イーグル培地を意味し、4-（2-hydroxyethil）-1piperazineethanesulfonic酸（HEPES）、グルタミン、およびペニシリン/ストレプトマイシン（ペンを補っ/連鎖球菌）。
    1. 500ミリリットルのAd-DF培地ボトルでは、5〜200 mMグルタミンのミリリットル、1 M HEPESの5ミリリットル、およびペニシリン/ストレプトマイシン溶液の5ミリリットル（10,000 U / mlの、万/ mlの）を追加します。
    2. 少なくとも4週間、4℃の冷蔵庫で保管してくださいBM。
  2. Wnt-3A条件培地の準備
    注：のWnt-3A条件培地が行われ、社内usinG細胞株L-のWnt-3Aを製造業者の指示に従って。
    1. Wnt-3A条件培地を収穫するために、1週間の細胞に曝露培地を収集し、浮遊細胞を除去するために、450×gで5分間スピンダウン。
    2. 0.22μmのフィルターを介してのWnt-3A条件培地を濾過し、50mlコニカルチューブに40ミリリットルのアリコートに分割します。活動の損失なしに少なくとも4ヶ月間、4℃で保管してください。
    3. ヒト胚腎臓（HEK）を使用して、TOP / FOPアッセイにウミシイタケとTOP-とFOP-ルシフェラーゼおよびTK- ウミシイタケをトランスフェクトし、測定-293細胞をWntシグナル-3A条件培地の活性を試験することによるアッセイキットを-ルシフェラーゼ製造業者の説明書。
      注：TOP-ルシフェラーゼは野生型TCF結合領域を含むレポータープラスミドです。 Wnt-3A条件培地がアクティブである場合、標準的なWntシグナル伝達が活性化されます。 β-カテニンは、ウィットを関連付けるために核に移行します時間TCF / LEF転写因子および基質を添加した場合の相対的なルシフェラーゼ活性の増加を誘導する、ルシフェラーゼレポーターの転写を活性化します。 TCFが変異している、ルシフェラーゼ遺伝子の上流領域に結合するため、FOPルシフェラーゼを陰性対照として使用します。
  3. コロンミディアム準備
    注：製造元の推奨に従って、すべての成長因子および試薬を準備し、希釈します。避け凍結融解サイクル小型のアリコートを使用してください。機能的な成長因子は、結果を得るために不可欠です。
    1. 1×B27、1.25 mMのN-アセチルシステインとBMを補完することにより、大腸培地（CM）を準備し、50 ngの/ mlののhEGF、5 nMのガストリン、10mMのニコチンアミド、300 ngの/ mlのhRspo3、100ng / mlのhNoggin、500μMA83-01 、初代細胞用抗菌10μMのSB202190、および100μg/ mlです。
    2. アリコートにCMを分割し、最大4ヶ月間-20℃でそれらを凍結。完全なコロンを準備するためにアリコートを解凍CMに50％のWnt-3A-conditoned培地を添加することにより培地（FCM）。活動の損失なしに4℃で7日間まで保存FCM。
    3. 直腸生検からオルガノイド文化の確立のために、50μg/ mlのバンコマイシン、50μg/ mlのゲンタマイシンをFCMを補完し、10μMのRho関連コイルドコイル形成タンパク質セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤（RhoKi）。唯一の文化の中で最初の2〜3日間、分離培地（IM）と呼ばれるこの培地を、使用してください。
  4. EDTAストック溶液の調製
    1. 0.22μmのフィルターで滅菌超純H 2 Oに、0.5Mのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、pHが8を準備します。
  5. 基底膜マトリックスの操作
    1. 製造業者の推奨に従って基底膜マトリックス（BMM）を準備します。
    2. 一晩氷上で解凍BMM。
    3. 15ミリリットルコニカルチューブにボトルからBMMを転送する、使用する場合5ミリリットルピペットと15ミリリットルコニカルチューブ-20℃で予冷。
    4. 解凍後、4℃で冷蔵庫にBMMを格納し、使用前に少なくとも30〜60分間氷上でインキュベートします。
      注：最良の結果を得るためには、BMMは陰窩またはオルガノイドを埋め込む前に、寒さと適切に混合されなければなりません。

2. CF患者の生検から大腸オルガノイドの確立

注：組織収集した後、それは生理食塩水に氷上でサンプルを維持することが重要である、のCa 2+およびMg 2+（DPBS）、またはBMのないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水。生検の迅速な処理が推奨されていますが、7日間まで氷上で保存生検からオルガノイド培養を確立することが可能であることが証明されました。

  1. 生検を15 mLコニカルチューブの底に沈降し、上清を除去しましょう。
  2. 10ミリリットルピペットを用いて生検およびピペット上下10〜20倍にDPBSの10ミリリットルを追加します。
    注：ピペットは、生検をピペットする前に、BMで予め湿らせする必要があります。
  3. 生検が底に沈降し、上清を除去してみましょう。
  4. 上清が透明になるまで繰り返し、2.2と2.3 4-5回繰り返します。
  5. 生検にDBPSの10ミリリットルと200μlのEDTA（0.5 M）を加え、4℃で60から120分間、ロッキングチューブプラットフォームにチューブを配置します。
    注：インキュベーション時間は患者ごとに異なる場合があります。陰窩がリリースされている場合、DPBSは濁ります。陰窩を顕微鏡下で観察することができる場合EDTAインキュベーションを確定することができます。
  6. 陰窩が安定することを可能にします。上清を捨てます。
  7. BMの2ミリリットルを取り、新しい15ミリリットルコニカルチューブに追加します。内部はBMで覆われているように、手動でこの新しいチューブを振ります。
  8. ピペットBMで予め濡らしを使用して、生検およびピペット上下10-20回を含むチューブにDPBSの2ミリリットルを追加します。
  9. 生検が新しいに陰窩とDPBSを解決し、転送することができステップ2.7で調製したBMの2ミリリットルを含むチューブ。
  10. これ以上陰窩が放出されなくなるまで繰り返し、2.8と2.9を繰り返します。
  11. 8°Cで5分間、130×gで陰窩をスピンダウン。
  12. 一方、室温（RT）で安全キャビネットにIMを転送します。
  13. 上清を捨て、陰窩ペレットを繰り返しステップ2.11にBMの10ミリリットルを追加します。
  14. BMの1ミリリットル中にペレットを再懸濁。 5-10μLを取り、顕微鏡下で目によって陰窩の数を数えます。
  15. 8°Cで5分間、130×gで陰窩をスピンダウン。
  16. 上清を除去し、55％BMMにペレットを再懸濁（BMM V IM Vへ）。
    注：陰窩は、1μl当たり1地下室で55％BMMの対応するボリュームに再懸濁されています。十分な陰窩がない場合は、BMMの最小体積は40μlです。
  17. 播種のために、ウェルあたりピペット35μL（24ウェルプレート中）。 3-5にBMM35μlのを分割することはGROの拡散を向上させるために、別々に下がりますBMMへの要因WTH。泡を作成しないでください。
  18. BMMが固化するため、少なくとも20分間、37℃のインキュベーター内で上下逆さまにプレートを配置しておきます。
  19. ウェルあたりIMの500μlを添加して、37℃のインキュベーター中でそれを維持し、5％のCO 2。
  20. 2〜3日毎に培地を更新します。 BMMそのまま降下を残して、P1000ピペットを用いてピペッティングすることにより、古いメディアを削除します。慎重に直接ではなくBMMが低下する上、井戸の側でそれをピペットでFCMを追加します。
    注記：陰窩を単離プロトコールでリリースされていない場合は、上清を遠心分離、BMでペレットを2〜3回洗浄し、BMMでそれを再懸濁します。残りの組織を取り、カミソリと小さな断片にカット。 15ミリリットルコニカルチューブにこれらを収集し、それらを遠心分離し、同じBMMで再懸濁します。任意の上皮幹細胞が存在する場合、これらはまた、オルガノイドを生成します。

3.メンテナンスのための大腸オルガノイドの継代、凍結、およびについてskolin誘発性の膨潤アッセイ（FIS）

注：すべてのオルガノイド文化は独自の倍加時間を持っています。通常、大腸のCFオルガノイドは1拡張することができます：3-1：5回ごとに7〜10日。出芽構造が観察されている場合、それは良い兆候です。大腸正常オルガノイド（ 図2D）より-大腸CFのオルガノイドは少ない嚢胞（2C 図2A）です。確立および維持のために、オルガノイドは、24ウェルプレートで培養します。凍結のため、6ウェルプレート中で、そして、FISアッセイのため、96ウェルパテインチ

  1. オルガノイドの継代
    1. それを使用する前に、少なくとも30〜60分間氷上にBMMを保管してください。
    2. それを使用する前に少なくとも1時間、室温でFCMを保管してください。
    3. サンプル名やなどの別のチューブに1 15ミリリットルコニカルチューブにラベルを付け、「洗浄しました。」
    4. 慎重BMMが低下乱すことなく、P1000ピペットを用いてウェルから培地を吸引除去します。
    5. ウェル1およびbにBMの1ミリリットルを追加します。アップreak BMMは、P1000ピペットを使用することによって低下します。サンプル名で15ミリリットルコニカルチューブにこの1ミリリットルを転送します。
    6. BMの別の1ミリリットルでよく洗浄し、同じ15ミリリットルチューブに移します。
    7. 繰り返しは、（1 15ミリリットルコニカルチューブに洗浄され、24ウェルプレートの6ウエルまで）5以上のウェルと3.1.5と3.1.6を繰り返します。
    8. BMと12ミリリットルにチューブを上に記入してください。ピペットアップおよび予め湿らせた5ミリリットルピペットを用いてダウン。
    9. 8℃で5分間、85×gでスピン。
    10. 上清を捨て、ペレットにBMの1ミリリットルを追加します。同じP1000ピペットチップを使用すると、フィルタなしP10チップを取り、ピペットアップおよび20倍のダウン。 P1000およびP10のヒントの両方を破棄します。
    11. 5ミリリットルピペットでBMの4ミリリットルを追加し、一方の側に垂直線から約70°に傾斜チューブを保持します。新しいP1000チップをプリウェットとP1000（1ミリリットル容量）と激しく2-3回混ぜます。
    12. 傾斜位置のまま10まで数え、最上層を収集慎重ワットラベルチューブにP1000ピペット、および転送4×1ミリリットルi番目の "洗浄"。
    13. 傾斜チューブ内底に沈降オルガノイドを観察し、未破砕オルガノイドと大きな塊が底に沈んでしまいます。遠心15mlを85×gで8℃で5分間チューブを「洗浄しました」。
    14. 上清を捨て、55％BMMの最終濃度にオルガノイドペレットに培地とBMMの必要量を追加します。泡（ 図3B）を作成することなく、ピペッティングにより混和します。
      注：良い密度がBMM10μlに25-30オルガノイドを播種することによって達成されます。
    15. フォローは2.17から2.19までを繰り返します。
  2. 凍結のための継代
    1. 使用前に少なくとも30〜60分間氷中でBMを保管してください。使用前に少なくとも1時間、室温でFCMを保管してください。
    2. RhoKi（ステップ1.3.3）を補充したFCMを準備します。
    3. 冷蔵庫からトリプシンを取り、使用前に少なくとも30分間、室温でそのままにしておきます。
    4. 手順に従ってください3.1.5-3.1.10。
    5. 、できるだけ多くの上清を除去し、トリプシンの4ミリリットルを追加し、30秒間ボルテックス。
    6. 30秒間激しく1分間、ボルテックス、37℃の温水浴中にチューブを入れてください。
    7. チューブ内の溶液を点検してください。無傷のオルガノイドは、顕微鏡下で観察される場合、ステップ3.2.7を繰り返します。
    8. オルガノイドが破壊される場合には、トリプシンおよびピペット10倍を中和するためにBMの8ミリリットルを追加します。
    9. 8℃で450×gで3分間回転。
    10. 上清を捨て、55％BMMのソリューションに到達するためにオルガノイドに培地とBMMの必要量を追加します。泡を作成せずにピペッティングすることによって、およびミックスダウン。
      注：トリプシン処理した後、1：1の比率の凍結について、オルガノイドは1に播種する必要があります。
    11. シード〜10μlに小さな、分離液滴を生成する予熱した6ウェル組織培養プレートの1ウェル中の250μlの、。 37℃のインキュベーター内で上下逆さまにプレートを置き、残します20〜30分間凝固するBMM。
    12. 各ウェル6ウェルプレートに新鮮なFCM + RhoKiの2.5ミリリットルを加え、インキュベーター（ 図3C）にプレートを転送します。
  3. FISアッセイのためのオルガノイドを継代
    注：オルガノイドの数とサイズに応じて、24ウェルプレートの4と6ウェル間を96ウェルプレートの27ウェルを播種するために十分です。
    1. ステップ3.1-3.1.13から説明されているようにオルガノイドを処理します。
    2. 50％BMMの120μlのペレットを再懸濁。
    3. 顕微鏡下で3μlのBMMドロップでオルガノイドの数（30-50）を確認してください。
    4. プレート96ウェルパテの各ウェルの中央に配置された3μlの一滴を使用してオルガノイド。
    5. BMMが固化するための15分間の37℃のインキュベーターでプレートを置き、さらなるステップは、ステップ6.1.1に記載されています。

4.凍結コロンCFオルガノイド

注：オルガンOIDは1-2日トリプシン処理し、培養後凍結しする準備ができているので、オルガノイドはまだ解凍後の生存の効率を増加させる、小さいであろう。

  1. BMの1ミリリットルを追加し、BMMは、P1000ピペットを使用してドロップし別れます。 15ミリリットルコニカルチューブに移します。
  2. 同じ15ミリリットルチューブにBMと転送の別の1ミリリットルとよく洗います。
  3. 繰り返して、すべてのウェルで4.1と4.2を繰り返します。
    注：過剰BMMを回避するためには、6ウェルプレートの3ウェルは、1つの15mlチューブにプールされています。
  4. 12冷たいBM mlのピペット上下5ミリリットルピペットでとオルガノイドを含む15mlチューブを埋めます。 5分間氷上でチューブを残します。
  5. 450×gで3分と8°Cのためにスピンして上清を除去します。
  6. 適切オルガノイドを再懸濁し、上下の媒体やピペットを凍結してオルガノイドのペレットを溶解します。
    注：凍結培地500μlがBMMの各100μlのために使用されています。
  7. 5mLのピペットを使用して、0.5mlのを転送します凍結培地に再懸濁オルガノイドは、極低温バイアルを無菌にします。
  8. 細胞凍結容器にバイアルを移し、-80℃でそれを置きます。
  9. 24時間後、液体窒素中に保存のためにバイアルを移します。

5.冷凍オルガノイドから文化の確立

注：氷の上BMMを解凍し、氷上で保管してください。 BMは、RTに到達し、解凍1クライオバイアルの手順を開始する前に、37℃に10ミリリットルのアリコートを温めましょう。

  1. まだ少し凍結材料があるまで37℃の水浴中で撹拌することによって急速にバイアルを解凍します。
  2. P1000ピペットを用いて15ミリリットルコニカルチューブに解凍したオルガノイドを転送します。
  3. チューブの底を振とうしながら直後、ドロップによって暖かいBM降下の1ミリリットルを追加します。培地の1ミリリットルが追加されると、凍結培地を希釈するためにピペッティングすることにより、数回上下慎重に混ぜます。
  4. ゆっくりと（一滴ずつ）コニカルチューブのコンタに暖かいBMの9ミリリットルを追加オルガノイドining。数回反転します。
  5. 85 XGと8℃で3分間、細胞懸濁液をスピン。
  6. ペレットを乱すことなく、慎重に上清を捨てます。 RhoKi（ステップ1.3.3）を補充したFCMの90μlのオルガノイドを再懸濁します。そして、BMMの110μlを添加します。
  7. 小さな、分離液滴を作り、予め温めておいた24ウェルプレートの各ウェルに35μlのを追加します。
  8. 逆さまに20-30分間プレートを残して、37℃のインキュベーターにプレートを転送します。
  9. 各ウェルにRhoKiとFCMの500μlを添加して、バックインキュベーター（ 図4A - 4C）にプレートを転送します。
  10. オルガノイドは、解凍から正常に回復した後は、そうBMMの各10μlを25-30オルガノイドが含まれ、よりBMMに希釈しました。オルガノイドの適切な成長を確保する-この手順では、2〜3日（4G 図4D）を解凍した後に行うことができます。

6.フォルスコリン誘発性の腫脹（FIS）と言います

注：FSK滴定は、CFTR残存機能の測定を可能にします。 CFTR変調のために、オルガノイドは、遺伝子型に応じて、指定された補正（ 例えば、VX-809）および/または増強（ 例えば、VX-770）にさらされています。 VX-770およびFSKは、右の測定を開始する前に追加されている間通常、VX-809は、測定前に18〜24時間を追加されます。いくつかの変調器（補正器/増強）をアッセイプレートのプラスチック表面に結合できることに注意してください。

  1. アッセイのためのメッキ
    注：VX-809ストックを20mMに等分し、-80℃で保存します。解凍すると、RTで残し、光から保護します。
    1. 3.3節で説明したようにオルガノイドを処理します。
    2. 0.0003、0.003、0.03、0.3、3.0、および30μM：VX-809補正をテストする場合は、以下の濃度と三重での用量反応曲線を準備します。 FCMでの希釈液を調製します。
    3. 96ウェルプレートに、いずれかの100μを追加; FCMのそれぞれのVX-809の濃度または100μlのとFCMのリットルは、プレートをインキュベートします。
  2. アッセイを測定します
    注：FSKは10mMでありながら、VX-770銘柄は、20 mMので等分しています。両方を-80℃で保存します。解凍すると、室温でのままにし、光から保護します。
    1. カルセインとDMSOのバイアルを取り、室温で15分間おきます。
    2. 未開封の場合、カルセインを粉末として提供されているバイアルにDMSOの5.1μlを添加します。それ以外の場合は、カルセインの2.5μLを含む既に再懸濁カルセインバイアルを使用します。
    3. 1.5ミリリットルチューブ内のBMの580μlにカルセインの2.5μlを添加して、それをラベル。
    4. 各ウェルリピートピペットを使用して、この染料溶液（BM +カルセイン）の10μLを加えます。
    5. 染料が十分に混合されることを確実にするために、マルチチャンネルで一度再懸濁。
    6. 30分間37℃のインキュベーター内でプレートをインキュベートします。
    7. カルセインインキュベーションの間、FSKの準備を開始およびVX-770のソリューション、必要に応じて。
    8. 0.0003、0.003、0.03、0.3、3.0、および30μM：VX-770の増強を使用している場合は、以下の濃度で三連の用量反応曲線を準備します。 FSK滴定の場合には、濃度は以下のとおりです。0、0.008、0.02、0.05、0.12、0.32、0.8、2.0、および5.0μM。 BM中の希釈液を調製します。
      注：FSK /薬物滴定溶液100μlがすでに100μLを含有する各ウェルに追加されますので、FSK、VX-770、または第二日目に添加される任意の他の薬物について、希釈液は、2×最終濃度で調製しなければなりませんFCMの。
    9. 顕微鏡室にFSKおよびVX-770のソリューション、P200ピペット、とヒントを転送します。
    10. FISアッセイを画像化するために、自動化された段階、加熱室、およびCO 2の流れを搭載したライブセルイメージング共焦点顕微鏡を使用しています。
      注：以下の手順は、特定の顕微鏡を参照してください。異なるセットアップは、メーカーの他に、次のような顕微鏡に適用されるべきです指示。
    11. プレートホルダーに、96ウェルプレートを置きます。
    12. イメージングのための共焦点設定を入力します。
      1. 37℃にライブイメージングツールをプリセットし、5％CO 2及び室は、測定前に最低30分間プレインキュベートしましょう。
      2. アレクサフルオロ-488トラックを選択し、「スマートセットアップ」オプションを使用します。
      3. ズームアウトとウェル全体をキャプチャする0.6Xに5Xレンズとスキャンエリアを設定します。
      4. バックグラウンドを超えるカルセイングリーンラベルされたオルガノイドの最適な検出を可能にするためにレーザパワーと検出器の感度を調整します。ピンホールは、130ミクロンに増加することができ、画像の平均化は、2に設定することができます。
      5. 8のビット深度と512×512のフレームサイズを設定します。
      6. 測定時間、周波数、および間隔を設定するには、時系列のオプションを使用します。
        注：定期的な測定のために推奨：10分間隔で1時間：サイクル= 7（サイクル1は、T = 0です）。減少した腫脹の測定では、orgaがノイドは、最大3時間画像化することができます。
      7. 手動で個々のウェルの位置を決定するために、タイルオプションを使用します。
    13. 測定と同じ順序に従って、対応するウェルにFSKおよび/またはVX-770の溶液100μLを加えます。よく撮像された最初のソリューションの追加を開始し、撮影オーダを続行します。
    14. 測定を開始します。
    15. 実験が終了した後、ファイルを保存します。
  3. FISアッセイデータの解析
    1. アレクサ-488トラックを介して撮像されたすべての構造を認識し、全面的オルガノイド面積の増加を計算するために識別された構造を埋める画像解析ソフトで解析ツールを使用して、FISアッセイのデータ解析のための「オルガノイド分析 "マクロを作成します。異なる時点。
    2. 画像解析プログラムで取得した画像を使用してデータファイルを開きます。
    3. オルガノイド分析のためのマクロを選択します。
      4. <李>は時点1での1つのウェル中の信号対雑音比のバランスをとり、すべてのオルガノイド構造が認識され、満たされていることを確認するために、しきい値を設定します。
      1. すべての構造はまた、時刻7で認識されている場合は少し時間点7でのバックグラウンドシグナルは、（特定の閾値は実験間で多少変更する場合があります）構造として認識されないことを保証するために、しきい値を変更見に4-6ウェルで確認してください。
    4. 千μmの2に認識されたオブジェクトの最小面積の大きさの基準を設定します。
    5. 押して開始するには、「分析」。分析は、使用するソフトウェアに応じて、約3分かかります。
    6. よく数字（表は、この順に増加するはずである）、時点、およびウェル当たりの総面積：ソフトウェアが終了すると、「テーブルを作成」​​し、次のデータを選択してください。
    7. スプレッドシートプログラムにエクスポートする.xlmとしてファイルを保存します。
    8. このプログラムでは、WEL当たりの面積の相対的増加を計算100％の時点1の領域を設定することにより、L。時点条件当たり1~7からの曲線下面積（AUC）を計算します。領域（Y値）の下限値を100％に設定されています。 FSKまたは薬物滴定（X軸）は、AUC（Y軸）に対してプロットされています。

結果

図1Aは、BMMに埋め込まれた陰窩の代表新鮮な分離を示しています。陰窩は、CF対象の大腸生検からのものです。通常、オルガノイドは、それぞれのcrypt（ - C 図1A）から生成されます。 CFTRの機能不全に、大腸のCFオルガノイドのほとんどは、嚢胞性ではなく、むしろコンパクト突起とbuddings（ 図2A - 2B）で?...

ディスカッション

ここでは、ヒト結腸直腸オルガノイドの発生、拡大、凍結、融解のための完全なプロトコルを提供します。我々はいくつかの時間前に17人のオルガノイド培養を確立しているが、それは時々 、ハンズオントレーニングすることなく、他の研究室で技術の確立が困難であることが判明しました。私たちは、これらのプロトコルは、このような訓練を置き換えることを期待して?...

開示事項

Hans Clevers is an inventor on patents for organoid culture and the Forskolin-induced swelling assay. Jeffrey M Beekman is an inventor on a patent for the Forskolin-induced swelling assay. Sylvia F Boj and Robert Vries are employed by the Foundation Hubrecht Organoid Technology (HUB), which holds the exclusive license to the Organoid Technology. Otherwise, the authors have nothing to disclose.

謝辞

この作品は、オランダCF財団（NCFS）、ZonMW（40-00812-98-14103）、ウィルヘルミナ小児病院研究基金とCZ、およびZilverenkruis / AchmeaのHIT-CFプログラムによってサポートされていました。我々はS. HEIDA・ミッシェル、M. Geerdink、KMデウィンター・ド・グルート、およびG. Berkers（小児呼吸器科、ウィルヘルミナこども病院、UMCユトレヒト）、及びRHJ Houwen（小児消化器科、ウィルヘルミナに感謝したいと思います患者に接近し、CFバイオバンクの生成のための生検を取得するための小児病院、UMCユトレヒト）。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen#12634stored at 4 °C
GlutaMaxThermo Fisher Scientific:  Invitrogen#35050stored at 4 °C
HepesThermo Fisher Scientific:  Invitrogen# 15630-056stored at 4 °C
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific:  Invitrogen#15140-122stored at -20 °C
96 well culture plateCellstar#655180
24 well culture plateCellstar#662160
6 well culture plateCellstar#657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)Life Technologies: Gibco#14190-094stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen#31966-021For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)Bovogen#SFBS LOT#11113For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell lineATCC#CRL-2647For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmidsMillipore #17-285For measuring Wnt activity
pTK-RenillaPromega #E2241For measuring Wnt activity
HEK-293ATCC#CRL-1573For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromega #E1910For measuring Wnt activity
Zeocin Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen#R250-01For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen#17504-044stored at -20 °C
N-AcetylcysteineSigma Aldrich#A9165-5Gstored at -20 °C
NicotinamideSigma Aldrich#N0636stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)PrepoTech#AF-100-15stored at -20 °C
GastrinSigma Aldrich#G9145stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) Tocris#2939stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)Selleckchem#S1049stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)Sigma Aldrich#S7067stored at -20 °C
PrimocinInvivoGen#ant-pm-1stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin)PrepoTech#120-10Cstored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3)R&D Systems#3500-RS/CFstored at -20 °C
VancomycinSigma Aldrich#861987- 250mgstored at -20 °C
GentamycinLife Technologies: Gibco#15710-049stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)Sigma Aldrich#431788Stored at 4 °C
MatrigelCorning#354230stored at -80 °C
TryplE Express Life Technologies: Gibco#12605-010for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing MediumLife Technologies: Gibco#12648010for freezing
CalceinLife Technologies: Gibco#C3100MPstored at -20 °C
ForskolinR&D Systems#1099-50 mgstored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809)Selleckchem#s1565stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770)Selleckchem#s1144stored at -80 °C
Name of Reagents/MaterialSolventStock ConcentrationFinal Concentration
GlutaMax200 mM2 mM
Hepes1 M10 mM
Penicillin/Streptomycin10K U/ml 10K µg/ml100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin 100 mg/ml 125 µg/ml
B27 supplement 100x1x
N-AcetylcysteineMiliQ H2O500 mM
NicotinamideDPBS1 M10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)DPBS 0.1% BSA0.5 mg/ml50 ng/ml
GastrinDPBS100 µM10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) DMSO5 mM500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)DMSO10 mM10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)DMSO30 mM10 µM
Primocin50 mg/ml 100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin)DPBS 0.1%BSA100 µg/ml100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3)varies per lot300 ng/ml
Vancomycin10 mg/ml50 µg/ml
Gentamycin10 mg/ml50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)MiliQ H2O0.5 M2 mM
CalceinDMSO10 µg/ml3.3 ng/ml
ForskolinDMSO10 mMvariable
Lumacaftor (VX-809)DMSO20 mMvariable
Ivacaftor (VX-770)DMSO20 mMvariable

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