Inchaço na Organóides intestinal induzida por forscolina: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para a Avaliação de Medicamentos Response na Fibrose Cística Os pacientes

Resumo

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Resumo

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 °C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Introdução

FC é causada por mutações no gene da fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR), que codifica um canal de anião epitelial. CF afeta cerca de 85.000 pessoas em todo o mundo ^1. Mais de 2.000 mutações CFTR foram identificados ( www.genet.sickkids.on.ca ). Esta diversidade explica parcialmente um amplo espectro de fenótipos da doença observados ( www.CFTR2.org ) ^{2, 3.} Seis classes de mutações CFTR são definidos com base no seu efeito na expressão da proteína de CFTR e função de: (i) nenhuma síntese, (II) tráfico prejudicada, (III) gating canal defeituoso, (IV) condutância alterada, (v) níveis de normalmente reduzida CFTR funcional, e (VI) a estabilidade da superfície de células deficientes ^4. Embora as mutações CFTR comuns são bem estudadas, a função de CFTR e sua relação com o estado clínico permanecem poorlY compreendido no nível do indivíduo, em particular para a grande grupo de "órfãos" mutações raras ( www.CFTR2.org ) ^{1, 3.}

Recentemente, as drogas que têm sido desenvolvidos como alvo a proteína CFTR de um modo específico da mutação. Duas classes de CFTR drogas-alvo proteínas estão atualmente em uso clínico e têm modos distintos de ação. Potenciadores, tais como VX-770, aumentar a probabilidade, aberto de CFTR mutante apical-localizados e agir diretamente sobre sua adição às células ^5. Correctores, tais como VX-809, restaurar o tráfico de endoplasmático CFTR misfolded localizada-retículo e exigem pré-incubação com células antes que os efeitos são observados ^6. O potenciador CFTR, VX-770, foi registrado para indivíduos com a mutação G551D ^{7, 8,} bem como para outros oitoCFTR gating mutações, incluindo S1251N ^9; em conjunto, estas mutações são realizados por 5% de todos os pacientes com FC. Outros estudos clínicos indicaram que VX-770, combinado com o corrector de VX-809, tem limitado ainda efeitos significativos sobre a função pulmonar e provoca uma diminuição nas taxas de exacerbação em indivíduos homozigóticos para a mutação F508del transportadas por 45-50% dos pacientes ^{10, 11.}

ensaios clínicos convencionais para identificar temas de droga-responsivo dentro os restantes 50% de pacientes com FC são dispendiosos e consumidores de tempo e não são viáveis ​​para os indivíduos com genótipos CFTR extremamente raros. Novel,, métodos personalizados de baixo custo são cruciais para coincidir com o número crescente de moduladores de CFTR aos indivíduos portadores de qualquer tipo de mutação CFTR. Até agora, a inclusão julgamento de grupos de pacientes portadores de mutações CFTR específicas tem sido orientada por estudos utilizando mutante transfecção gene CFTR em hsistemas de células de eterologous, seguidos por estudos eletrofisiológicos em câmaras de Ussing ^{5, 6, 12.} Devido a uma falta de modelos animais adequados, CF estudos de eficácia de drogas em células epiteliais brônquicas ar-líquido da interface diferenciadas derivadas de materiais de explante pulmonar FQ têm sido utilizados para o desenvolvimento de fármacos ^{13, 14, 15.} No entanto, a disponibilidade limitada de tecidos de explantes pulmonares e os procedimentos invasivos para obter células brônquicas de indivíduos sem a doença em fase terminal dificultar a análise de mutações CFTR menos comuns e impedir que o teste de drogas de forma personalizada. Para superar essas limitações, tecidos "fácil acesso", como Organóides colorretais, células das vias aéreas nasais e células das vias respiratórias derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas, estão actualmente a ser exploradas para tratamentos com medicamentos personalizados.

Anteriormente, estabelecemos protocolos para a cultura de células estaminais epiteliais de qualquer órgão gastrointestinal na forma de 3D Organóides ^{16, 17.} factores de crescimento para o cólon / recto humana, definidos envolvem as condições de cultura (Factor de Crescimento Epitelial (EGF), gastrina, Wnt-3A, R-espondina 3 (Rspo3), e Noggin) combinado com pequenas moléculas (nicotinamida, A83-01, e SB202190) numa matriz de membrana basal. Sob estas condições, as células estaminais individuais ou pequenos fragmentos de tecido crescer até formarem cística, estruturas 3D fechado formado por epitélio altamente polarizada com o lado basal orientada para o exterior. Todos os tipos de células normalmente aparecem em suas proporções normais e posições. Organóides pode ser expandida ao longo de períodos longos por ruptura mecânica semanal e re-plaqueamento. Eles são geneticamente e fenotipicamente estáveis e podem ser armazenados, permitindo a expansão de longo prazo e bio-banking ^17. Eles são passíveis detodas as manipulações de células-biológico padrão / genéticos e técnicas de análise desenvolvido para linhas celulares 2D ^18.

Recentemente, demonstramos que a função CFTR pode ser facilmente medido em Organóides colorretais em um ensaio de edema induzido por forscolina (FIS) ^{19, 20.} Quando exposto a forscolina (FSK) ou, alternativamente, a toxina da cólera, Organóides aumentar rapidamente a sua monofosfato de adenosina cíclico níveis (cAMP), que por sua vez, resulta na abertura do canal CFTR ^19. Organóides de indivíduos saudáveis, ou a partir de indivíduos com mutações de CFTR associado com função residual, vai inchar subsequentemente como uma consequência de iões e de transporte de água para o lúmen, organ�de o equivalente in vitro de diarreia secretora. A resposta de FIS Organóides colorrectais foi mostrado previamente para ser totalmente CFTR-dependente, tal como indicado por Organóides derivadas de indivíduos CFTR-null, umnd pela utilização de inibidores de CFTR farmacológicas específicas ^19. Grandes conjuntos de dados específicos de um assunto pode ser derivada dentro de várias semanas depois de tomar uma biópsia.

Para o ensaio de FIS descrito em detalhe aqui, Organóides são cultivadas a partir de biópsias rectais que podem ser obtidos em qualquer idade e com apenas desconforto limitada ^21. Organóides são passadas semanalmente por perturbação mecânica em criptas de solteiro que facilmente fechado hermético e formar novos Organóides. Para a execução do ensaio de FIS, ~ 30-80 destes Organóides pequenos rompidas foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços ^19. No dia do ensaio, as Organóides são coradas com verde calceína, um corante fluorescente de células-permeável que é mantido dentro de células vivas, facilitando imagens ao vivo. Em seguida, Fsk, o que aumenta o AMPc intracelular e deste modo activa CFTR, é adicionado a fim de estimular o inchaço organ�de. Potenciadores que atuam sobre CFTR apical são adicionados simultaneamente wom o forskolin, enquanto corretores que restauram tráfico CFTR são adicionados 24 horas antes da adição de Fsk. O inchaço organ�de é quantificada pela análise de imagem automatizado que calcula o aumento relativo da área total de todos os objectos fluorescentes para cada ponto de tempo após a adição de forscolina.

3D organ�de inchaço oferece vantagens e desvantagens sobre leituras CFTR eletrofisiológicos existentes nas células das vias aéreas cultivadas em 2D em Ussing câmaras. Uma grande vantagem é a capacidade do ensaio de inchamento. As células são cultivadas e analisadas utilizando um único tipo de meio de cultura, e um técnico experiente pode cultura até 25 amostras organ�de numa base semanal, enquanto quantificando cerca de 1.200 pontos de dados por semana em 12 amostras de pacientes. Nós convencionalmente digitar uma única condição experimental por meio de medições em duplicado ou triplicado por placa e repetir tais medições em três momentos de incubação independentes. No total, cerca de 300-500 single organ�de estruturas são então medidos por condição experimental, o que leva a medições muito precisas da função CFTR com variabilidade técnica limitada. Esta precisão permite-nos definir claramente diferenças na função residual e resposta para moduladores de CFTR e nos permite escolher facilmente se os efeitos genéticos fundo entre os pacientes portadores de mutações CFTR idênticos ^{19, 22, 23, 24, 25.} A qualidade dos dados pode ser facilmente avaliada a partir de imagens de microscópio. Enquanto FIS é totalmente CFTR-dependente, é uma medida de resultado indirecto para a função CFTR, o seu fora de leitura causada pelo acoplamento de transporte de íons para o transporte de fluidos. Isto contrasta com medições da função CFTR diretos em câmaras Ussing, que medem transepiteliais correntes iônicas ^26. câmaras de Ussing permitir a estimulação seleccionado de apical ou basolateral Compartments (que o ensaio organ�de não permite); por permeabilização de membranas basolaterais, a secreção dependente de anião CFTR apical pode ser medido selectivamente ^27.

Protocolo

Todos os experimentos usando tecidos humanos aqui descritos foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade Medical Center Utrecht (UMCU; TcBio # 14-008). O consentimento informado para a recolha de tecidos, geração, armazenamento e uso dos Organóides foram obtidas junto aos pacientes do Hospital (WKZ) -UMCU de Wilhelmina Children.

Equipamento	consumível	Ferramentas
câmara de fluxo laminar	15 e 50 ml de tubos cónicos	Zeiss LSM 800 - Zen 2 (edição azul) software para medir imagens
Incubadora de CO 2	tubos de microcentrífuga	programa Microsoft Excel
Microscópio de cultura de células (luz microscópio óptico /)	0,22 filtros
centrifugador	pipetas serológicos
rolamento Shaker	pontas com filtro micropipeta
Sala C 4 ° ou 4 ° C frigorífico para incubadora	criotubos
CoolCell celular Freezing Container
Pipetadora sorológica
Micropippette (1000, 200 e 20 ul)
Viaflo Repita pipeta
(Células vivas) Confocal Microscópio
Computador
tanque de nitrogênio líquido
Multicanal (200 ul)

1. Reagentes preparando para Cultura

NOTA: Todas as etapas são executadas dentro de uma cabine de segurança biológica e seguindo diretrizes padrão para trabalhar com culturas de células. A fim de facilitar a formação de gotas de agradáveis ​​matriz da membrana basal, manter um material pré-aquecido de 96-, 24-, e placas de 6 poços na incubadora a 37 ° C.

1. Meio Basal Preparação
   NOTA: meio basal (BM) refere-se a Avançado do Dulbecco Modified Eagle Médium com Mistura de Ham Nutriente F-12 (Ad-DF) suplementado com 4- (2-hydroxyethil) ácido -1piperazineethanesulfonic (HEPES), glutamina, e penicilina / estreptomicina (Pen / Strep).
   1. Numa forma frasco de 500 ml Ad-DF, adicionar 5 ml de glutamina 200 mM, 5 mL de HEPES 1 M, e 5 ml de soluções de pen / estrep (10.000 U / ml, 10000 ug / ml).
   2. BM guarde na geladeira a 4 ° C durante pelo menos 4 semanas.
2. -Wnt-3A Preparação de meio condicionado
   NOTA: medium Wnt-3A-condicionado é feito in-house using a linha celular de Wnt-L-3A de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Para colher o meio condicionado de Wnt-3A, recolher a forma exposto às células durante uma semana e girá-lo para baixo durante 5 minutos a 450 xg para remover as células flutuantes.
   2. Filtra-se o meio de Wnt-3a-condicionado através de um filtro de 0,22 um e dividi-lo em alíquotas de 40 ml em tubos de 50 mL cónicos. Armazená-los a 4 ° C durante pelo menos 4 meses sem perda de actividade.
   3. Testar a actividade do meio condicionado de Wnt-3A num ensaio de TOP / FOP utilizando rim embrionário humano (HEK) -293 células transfectadas com o topo e FOP-luciferase de Renilla e TK- e medidos com um estojo de ensaio de Renilla -luciferase segundo as instruções do fabricante.
      NOTA: TOP-luciferase é um plasmídeo repórter que contém regiões de ligação TCF de tipo selvagem. Se o meio de Wnt-3A-condicionado está ativa, a sinalização Wnt canônica é ativado. Beta-catenina transloca-se para o núcleo para associar with TCF / LEF factores de transcrição e activa a transcrição do repórter de luciferase, induzindo um aumento na actividade de luciferase relativa quando o substrato é adicionado. A FOP-luciferase é usado como um controlo negativo porque o TCF regiões de ligação a montante do gene de luciferase são mutados.
3. Colon Médio Preparação
   Nota: Preparar e diluir todos os fatores de crescimento e reagentes de acordo com as recomendações dos fabricantes. Use alíquotas de pequeno porte uma Evitar ciclos de congelamento e descongelamento. factores de crescimento funcionais são essenciais para os resultados.
   1. Prepare a forma do cólon (CM), completando com 1x BM B27, 1,25 mM de N-acetilcisteína, 50 ng / ml de hEGF, 5 nM de gastrina, nicotinamida a 10 mM, 300 ng / ml hRspo3, 100 ng / ml hNoggin, 500 uM A83-01 , 10 uM SB202190, e 100 ug / ml de um agente antimicrobiano para as células primárias.
   2. Dividir o CM em alíquotas e congelá-las a -20 ° C durante até 4 meses. Descongelar as alíquotas para preparar cólon completomédia (FCM) por adição de 50% de meio de Wnt-3a-conditoned para a CM. Loja FCM até 7 dias a 4 ° C sem perda de actividade.
   3. Para o estabelecimento de uma cultura de biópsias organ�de rectais, complementar FCM com 50 ug / ml de vancomicina, 50 ug / ml de gentamicina, e 10 uM associada a Rho proteína serina / treonina quinase inibidor coiled-coil-forming (RhoKi). Usar este meio, chamado de meio de isolamento (IM), para os primeiros dois ou três dias em cultura.
4. EDTA da Preparação de Solução
   1. Prepare M de ácido 0,5 etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 8, em ultrapura _H2O, esterilizadas com um filtro de 0,22 um.
5. Manipulação da membrana basal Matrix
   1. Prepare a matriz da membrana basal (BMM) de acordo com a recomendação do fabricante.
   2. Thaw BMM noite no gelo.
   3. Ao transferir o BMM do frasco para um tubo cónico de 15 ml, a utilizaçãouma pipeta de 5 ml e um tubo de 15 ml pré-arrefecido a -20 ° C.
   4. Uma vez descongelado, o BMM armazenar no frigorífico a 4 ° C e incubar em gelo durante pelo menos 30-60 minutos antes da utilização.
      NOTA: Para obter os melhores resultados, o BMM deve ser frio e devidamente misturados antes incorporação criptas ou Organóides.

2. Estabelecer Organóides cólon a partir de uma biópsia do paciente CF

NOTA: Após a recolha de tecido, é importante para manter a amostra em gelo em solução salina, fosfato de Dulbecco tamponado salino sem Ca ²⁺ e Mg ²⁺ (DPBS), ou BM. o processamento rápido das biópsias é recomendável, mas provou possível para estabelecer culturas organ�de a partir de biópsias armazenados em gelo durante um máximo de 7 dias.

1. Deixe as biópsias assentar no fundo de um tubo cónico de 15 ml e remover o sobrenadante.
2. Adicionar 10 ml de DPBS para as biópsias e pipeta cima e para baixo 10-20 vezes utilizando uma pipeta de 10 mL.
   NOTA: A pipeta tem de ser pré-humedecido com BM antes de pipetar a biópsia.
3. Deixe que as biópsias se depositam no fundo e remover o sobrenadante.
4. Repita os passos 2.2 e 2.3 4-5 vezes até que o sobrenadante é clara.
5. Adicionar 10 ml de DBPS e 200 ul de EDTA (0,5 M) para as biopsias e colocar o tubo no tubo de uma plataforma de balanço durante 60-120 min a 4 ° C.
   NOTA: O tempo de incubação pode variar de paciente. Se criptas são liberados, DPBS torna-se turva. incubação EDTA pode ser finalizado quando criptas pode ser observado sob um microscópio.
6. Permitir que as criptas para resolver. Descartar o sobrenadante.
7. Tome-se 2 ml de BM e adicioná-lo para um novo tubo de 15 ml. Agitar este novo tubo manualmente, de tal maneira que o interior é coberto com a BM.
8. Usando uma pipeta de pré-humedecidas com a BM, adicionar 2 ml de DPBS para o tubo contendo as biópsias e pipeta-se para baixo e 10-20 vezes.
9. Permitir que as biópsias para liquidar e transferir os DPBS com as criptas para o novotubo contendo os 2 ml de BM que foi preparado no passo 2.7.
10. Repita os passos 2.8 e 2.9 até que não mais criptas são liberados.
11. Rodar as criptas para baixo a 130 xg durante 5 min a 8 ° C.
12. Nesse meio tempo, transferir IM para o gabinete de segurança, à temperatura ambiente (RT).
13. Descartar o sobrenadante e adicionar 10 ml de BM ao sedimento cripta e repita o passo 2.11.
14. Ressuspender o sedimento em 1 ml de BM. Leve 5-10 ul e contar o número de criptas por olho sob um microscópio.
15. Rodar as criptas para baixo a 130 xg durante 5 min a 8 ° C.
16. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 55% BMM (BMM v para v IM).
    NOTA: As criptas são ressuspensas no volume correspondente de 55% a 1 BMM cripta por ul. Se não houver criptas suficientes, o volume mínimo de BMM é de 40 mL.
17. Para a semeadura, pipeta 35 ul por cavidade (em uma placa de 24 poços). Dividir os 35 ul de BMM em 3-5 gotas separadamente, a fim de melhorar a difusão de growth fatores para a BMM. Não crie bolhas.
18. Coloque e deixar a placa de cabeça para baixo na incubadora a 37 ° C durante pelo menos 20 min para o BMM para solidificar.
19. Adicionar 500 ul de IM por poço e mantê-lo na incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
20. Refrescar o meio cada 2-3 dias. Remover o meio antigo por pipetagem para fora com uma pipeta P1000, deixando o BMM gotas intacta. Cuidadosamente adicionar FCM pipetando-o ao lado do poço, não directamente sobre o BMM gotas.
    NOTA: Se não criptas são liberados no protocolo de isolamento, centrifugar o sobrenadante, lavar o pellet 2-3 vezes com a BM, e ressuspender-lo em BMM. Tome o tecido de sobra e corte-o em pequenos pedaços com uma navalha. Recolha estes para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar para clarificação, e ressuspender-los na mesma BMM. Se as células-tronco epiteliais estão presentes, estes também irá gerar Organóides.

3. Passaging de Organóides cólon para Manutenção, congelamento e Paraskolin induzida Inchaço Assay (FIS)

NOTA: Cada cultura organ�de tem seu próprio tempo de duplicação. Normalmente, Organóides CF colorrectal pode ser expandido 1: 3-1: 5 vezes cada 7-10 dias. É um bom sinal se são observadas estruturas de brotamento. Organóides colorrectal CF são menos cística (Figura 2A - 2C) de Organóides colorrectais normais (Figura 2D). Para o estabelecimento e manutenção, Organóides são cultivadas em placas de 24 poços; por congelamento, em placas de 6 poços; e para o ensaio de FIS, em patês de 96 poços.

1. Passaging de Organóides
   1. Manter o BMM em gelo durante pelo menos 30-60 minutos antes de o utilizar.
   2. Manter a FCM à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hr antes de o utilizar.
   3. Rotular um tubo de 15 ml cônico com o nome da amostra e um outro tubo como "lavado".
   4. Aspirar cuidadosamente o meio dos poços usando uma pipeta P1000 sem perturbar o BMM gotas.
   5. Adicionar 1 ml de BM para um bem e break o BMM cai usando uma pipeta P1000. Transferir este 1 ml para o tubo de 15 ml com o nome da amostra.
   6. Lava-se a bem com mais 1 ml de BM e transferi-lo para o mesmo tubo de 15 ml.
   7. Repita os passos 3.1.5 e 3.1.6 com mais 5 poços (até 6 poços de uma placa de 24 poços serão lavadas em um tubo de 15 ml).
   8. Encha o tubo até 12 ml com o BM. Pipeta cima e para baixo usando um pré-humedecido 5 ml pipeta.
   9. Centrifugação a 85 xg durante 5 min a 8 ° C.
   10. Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de MF à pelete. Com a mesma ponta P1000 pipeta, levanta uma ponta P10 sem um filtro, e pipeta cima e para baixo 20 vezes. Descarte P1000 e dicas P10.
   11. Adicionar 4 ml de BM com uma pipeta de 5 mL e segurar o tubo inclinado em cerca de 70 ° em relação à vertical para um lado. Pré-molhar uma nova ponta P1000 e misture vigorosamente 2-3 vezes com o P1000 (volume 1 ml).
   12. Conte até 10, permanecendo na posição inclinada, recolher a camada superior com cuidado wom a pipeta P1000, e transferência de 4 x 1 ml para dentro do tubo rotulado como "lavado".
   13. Observe as Organóides de sedimentação para o fundo no tubo inclinado; Organóides ininterrupto e pedaços maiores vai afundar até o fundo. Centrífuga de 15 ml "lavada" tubo por 5 min a 85 xg e 8 ° C.
   14. Descartar o sobrenadante e adicionar a quantidade necessária de meio de BMM e ao sedimento organ�de para uma concentração final de 55% de BMM. Misturar por pipetagem cima e para baixo sem criar bolhas (Figura 3B).
       NOTA: Uma boa densidade é conseguida por sementeira 25-30 Organóides em 10 ul de BMM.
   15. Siga os passos de 2,17-2,19.
2. Passaging para congelamento
   1. Mantenha o BM no gelo por pelo menos 30-60 min antes do uso. Manter a FCM à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hora antes da utilização.
   2. Prepare FCM suplementado com RhoKi (Passo 1.3.3).
   3. Aqui tripsina do frigorífico e deixá-la à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min antes da utilização.
   4. Siga os passos 3.1.5-3.1.10.
   5. Remover tanto sobrenadante quanto possível, adicionar 4 ml de tripsina, e agitar com vortex durante 30 seg.
   6. Colocar o tubo num banho de água quente a 37 ° C durante 1 min e agitar vigorosamente em vórtice durante 30 seg.
   7. Inspeccionar a solução no tubo. Se Organóides intactas ainda são visíveis ao microscópio, repita o passo 3.2.7.
   8. Quando os Organóides são interrompidas, adicionar 8 mL de BM para neutralizar a tripsina e a pipeta de 10 vezes.
   9. Rotação durante 3 min a 450 xg, a 8 ° C.
   10. Descartar o sobrenadante e adicionar a quantidade necessária de meio de BMM e aos Organóides para chegar a uma solução de BMM de 55%. Misturar por pipetagem cima e para baixo sem criar bolhas.
       NOTA: Para o congelamento, Organóides devem ser inoculadas numa proporção de 1: 1 após tripsinização.
   11. Semente de 250 ul de um único poço de uma placa de 6 poços de cultura de tecidos pré-aquecido, que produzem gotículas separadas, de ~ 10 mL. Colocar a placa de cabeça para baixo na incubadora a 37 ° C e deixar aBMM para solidificar por 20-30 min.
   12. Adicionar 2,5 ml de FCM fresco + RhoKi em cada placa de 6 poços e assim transferir a placa para a incubadora (Figura 3C).
3. Passaging Organóides para o Ensaio FIS
   NOTA: Dependendo do número e tamanho dos Organóides, entre 4 e 6 cavidades de uma placa de 24 poços são suficientes para semear 27 cavidades de uma placa de 96 poços.
   1. Processar os Organóides como descrito a partir das etapas 3.1-3.1.13.
   2. Ressuspender o sedimento em 120 ul de 50% de BMM.
   3. Confirmar o número de Organóides (30-50) na proporção de 3 ul de BMM gota sob o microscópio.
   4. Placa os Organóides utilizando uma única gota de 3 ul colocados no meio de cada poço de uma pasta de 96 poços.
   5. Colocar a placa na incubadora a 37 ° C durante 15 min para a BMM a solidificar; outros passos estão descritos no passo 6.1.1.

4. Colon Congelamento CF Organóides

NOTA: Organoids está pronto para ser congelada até 1-2 dias após tripsinização e de cultura, de modo Organóides ainda será pequeno, o que aumenta a eficiência de sobrevivência após a descongelação.

1. Adicionar 1 ml da BM e quebrar a BMM gotas com uma pipeta P1000. Transfira para um tubo de 15 ml.
2. Lave o poço com mais 1 ml de BM e transferência para o mesmo tubo de 15 ml.
3. Repita os passos 4.1 e 4.2 com todos os poços.
   NOTA: Para evitar o excesso de BMM, 3 poços de uma placa de 6 poços são reunidas em um tubo de 15 ml.
4. Encha o tubo de 15 ml contendo os Organóides com 12 ml de BM frio e pipeta cima e para baixo com uma pipeta de 5 ml. Deixar o tubo em gelo durante 5 min.
5. Girar durante 3 min a 450 xg e 8 ° C e remover o sobrenadante.
6. Dissolver o sedimento de Organóides com meio de congelamento e pipeta cima e para baixo para voltar a suspender adequadamente os Organóides.
   NOTA: 500 ul de meio de congelação é utilizado para cada 100 mL de BMM.
7. Usando uma pipeta de 5 ml, 0,5 ml de transferirOrganóides novamente suspensas em meio de congelamento de estéreis frascos criogênicos.
8. Transferir os frascos para um recipiente de congelação de células e colocá-lo a -80 ° C.
9. Após 24 h, transferem os frascos para armazenamento em azoto líquido.

5. Estabelecer culturas de Organóides congelados

NOTA: Descongelar o BMM no gelo e mantê-lo em gelo. Deixe o BM atingir a TA, e aquecer a 10 ml de aliquota a 37 ° C antes de iniciar o procedimento de descongelação um criotubo.

1. Descongelar o frasco rapidamente por agitação em um banho de água a 37 ° C até que não é ainda um pouco material congelado.
2. Transferir os Organóides descongeladas para um tubo cónico de 15 ml usando uma pipeta P1000.
3. Imediatamente depois, adicionar 1 ml de gota a gota BM quente, agitando o fundo do tubo. Uma vez que os 1 ml de meio é adicionado, mistura-se cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo algumas vezes para diluir o meio de congelamento.
4. Lentamente (gota a gota) adicionar 9 ml de BM quente para a Conta tubo cônicoining os Organóides. Inverta algumas vezes.
5. Girar a suspensão de células durante 3 min a 85 xg e 8 ° C.
6. Descartar o sobrenadante cuidadosamente, sem perturbar o sedimento. Ressuspender o organóide em 90 ul de FCM suplementadas com RhoKi (passo 1.3.3). Em seguida, adicione 110 mL de BMM.
7. Adicionar 35 ul a cada poço de uma placa de 24 poços pré-aquecido, fazendo pequenas gotículas, separadas.
8. Transferir a placa à temperatura de 37 ° C incubadora, deixando a placa de cabeça para baixo durante 20-30 min.
9. Adicionar 500 ul de FCM com RhoKi a cada poço e transferir a placa de novo na incubadora (Figura 4A - 4C).
10. Uma vez Organóides ter recuperado corretamente de descongelamento, diluir em mais BMM assim cada 10 mL de BMM contém 25-30 Organóides. Este procedimento pode ser feito de 2-3 dias após a descongelação (Figura 4D - 4G) e garante o bom crescimento do organ�de.

6. induzida Forskolin-inchaço,dizer (FIS)

NOTA: FSK titulação permite a medição da função residual CFTR. Por modulação de CFTR, Organóides são expostos a uma dada corrector (por exemplo, VX-809) e / ou potenciador (por exemplo, VX-770), dependendo do genótipo. Normalmente, VX-809 é adicionado 18-24 h antes da medição, enquanto que VX-770 e FSK, são adicionados imediatamente antes de iniciar as medições. Estar ciente de que alguns moduladores (correctores / potenciadores) pode ligar-se à superfície de plástico da placa de ensaio.

1. Chapeamento para o Ensaio
   NOTA: VX-809 existências são aliquotadas a 20 mM e armazenado a -80 ° C. Ao descongelar, deixe à temperatura ambiente e proteger da luz.
   1. Processar os Organóides como descrito na seção 3.3.
   2. Se o teste de corrector de VX-809, preparar uma curva de dose-resposta em triplicado com as seguintes concentrações: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0, e 30 fiM. Prepare as diluições em FCM.
   3. Para a placa de 96 poços, quer adicionar 100 μ; L de FCM com as respectivas concentrações ou 100 pi de VX-809 FCM única e incubar a placa.
2. Medindo o Ensaio
   NOTA: VX-770 existências são aliquotadas a 20 mM, enquanto Fsk é a 10 mM; ambos são armazenadas a -80 ° C. Ao descongelar, deixe à temperatura ambiente e proteger da luz.
   1. Tomar um frasco de calceína e DMSO e deixar à temperatura ambiente durante 15 min.
   2. Adicionar 5,1 mL de DMSO para o frasco onde a calceina é fornecido como um pó, se fechada. Caso contrário, utilizar um frasco de calceína já ressuspensas contendo 2,5 ul de calceína.
   3. Adicionar 2,5 ul de calceína com 580 ul de BM em um tubo de 1,5 ml e rotulá-la.
   4. Adicionar 10 ul desta solução corante (BM + calceína) para cada poço utilizando uma pipeta de repetição.
   5. Ressuspender uma vez com uma multicanal para garantir que o corante é bem misturado.
   6. Incubar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 30 min.
   7. Durante a incubação calceína, começar a preparar a Fske soluções de VX-770, se necessário.
   8. Se usar um potenciador de VX-770, preparar uma curva de dose-resposta, em triplicado, com as seguintes concentrações: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0, e 30 fiM. No caso de uma titulação Fsk, as concentrações são: 0, 0,008, 0,02, 0,05, 0,12, 0,32, 0,8, 2,0, e 5,0 uM. Preparar diluições em BM.
      NOTA: FSK, VX-770, ou qualquer outro fármaco adicionado no segundo dia, as diluições devem ser preparados numa concentração final de 2 x, uma vez que 100 ul de Fsk solução / titulação da droga serão adicionados a cada poço, os quais já contêm 100 ul da FCM.
   9. Transfira a Fsk e VX-770 soluções, uma pipeta p200, e dicas para a sala de microscópio.
   10. Para imagiologia do ensaio de FIS, usar um microscópio confocal de imagens de células vivo equipado com um estágio automatizado, uma câmara aquecida, e o fluxo de CO _2.
       NOTA: Os passos seguintes referem-se a um microscópio específico. Diferentes configurações devem ser aplicadas a outros microscópios seguinte fabricanteinstruções.
   11. Colocar a placa de 96 poços no suporte da placa.
   12. Insira as configurações confocal para a imagem latente.
       1. Predefinir a ferramenta de imagem ao vivo para 37 ° C e 5% de CO ₂ e deixar a câmara de pré-incubar durante um mínimo de 30 minutos antes da medição.
       2. Use a opção "setup inteligente" para selecionar a faixa Alexa fluor-488.
       3. Ajuste a lente 5X e área de digitalização para 0,6x para diminuir o zoom e capturar todo o bem.
       4. Adaptar a sensibilidade potência do laser e um detector para permitir a detecção ideal de Organóides rotulados calce�a-verde sobre o fundo. O orifício pode ser aumentada para 130 um e a média da imagem pode ser fixado em duas.
       5. Defina a profundidade de bits de 8 e o tamanho do quadro de 512 x 512.
       6. Use a opção de séries temporais para definir a medição do tempo, frequência e intervalos.
          NOTA: Sugerido para medições regulares: 1 hora com 10 min de intervalo: ciclos = 7 (ciclo 1 é T = 0). Para as medições do inchaço reduzida, Organoids podem ser visualizados por até 3 horas.
       7. Use a opção de telha para determinar manualmente as posições bem individuais.
   13. Adicionar 100 ul da Fsk e / ou VX-770 soluções para os poços correspondentes, seguindo o mesmo fim como a medição. Começar a adicionar as soluções na primeira fotografada bem e continuar com a ordem de imagem.
   14. Inicie a medição.
   15. Após o experimento for concluído, salve o arquivo.
3. Análise do FIS Ensaio de Dados
   1. Criar uma macro "análise organ�de" para a análise dos dados do ensaio de FIS usando a ferramenta de análise em um software de análise de imagem que reconhece todas as estruturas fotografadas através da faixa de Alexa-488 e preenche as estruturas identificadas para calcular o aumento da área total organ�de através da diferentes pontos de tempo.
   2. Abra o arquivo de dados com as imagens adquiridas no programa de análise de imagem.
   3. Seleccione a macro para análise organ�de.
   4. Definir o limiar para equilibrar a relação sinal-ruído de um poço no ponto 1 hora e assegurar que todas as estruturas organ�de são reconhecidos e preenchido.
      1. Verifique em 4-6 poços para ver se todas as estruturas também são reconhecidos no ponto 7. tempo de modificar ligeiramente o limiar para garantir que os sinais de fundo no ponto 7 do tempo não são reconhecidos como estruturas (o limite específico pode variar um pouco entre os experimentos).
   5. Defina os critérios de tamanho dos objetos reconhecidos mínima área a 1.000 mm ^2.
   6. Pressione o botão "Analisar" para iniciar. A análise leva aproximadamente 3 minutos, dependendo do software utilizado.
   7. Quando o software estiver concluída, vá para "criar a tabela" e selecione os seguintes dados: bem os números (tabela deve aumentar nesta ordem), os pontos de tempo e área total por poço.
   8. Salve o arquivo como um .xlm para exportar para um programa de planilha.
   9. Neste programa, calcular o aumento relativo na área por well, definindo a área de ponto de 1 hora a 100%. Calcula-se a área sob a curva (AUC) a partir de 1-7 pontos de tempo por condição; o limite inferior da zona (Y-valor) é fixado em 100%. FSK ou drogas titulações (eixo X) são representados graficamente contra a AUC (eixo Y).

Resultados

A Figura 1A mostra um isolamento fresco representante da criptas incorporados em BMM. As criptas são a partir de uma biópsia de um sujeito colorrectal CF. Normalmente, um organ�de é gerado a partir de cada cripta (Figura 1A - C). Devido à disfunção da CFTR, a maioria dos Organóides cólon CF não são cística, mas sim são compactos e com projecções e brotos (Figura 2A - 2B). No entanto, a...

Discussão

Aqui, nós fornecemos um protocolo completo para a geração, a expansão, o congelamento e descongelamento das Organóides colorectal humanos. Enquanto nós estabelecemos culturas organ�de humanos há algum tempo atrás ^17, tem por vezes sido difícil para estabelecer a tecnologia em outros laboratórios, sem treinamento prático. Prevemos que esses protocolos irá substituir essa formação.

-Wnt-3A meio condicionado é um dos reagentes mais importantes para te...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#12634	stored at 4 °C
GlutaMax	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#35050	stored at 4 °C
Hepes	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	# 15630-056	stored at 4 °C
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#15140-122	stored at -20 °C
96 well culture plate	Cellstar	#655180
24 well culture plate	Cellstar	#662160
6 well culture plate	Cellstar	#657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)	Life Technologies: Gibco	#14190-094	stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#31966-021	For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Bovogen	#SFBS LOT#11113	For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell line	ATCC	#CRL-2647	For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmids	Millipore	#17-285	For measuring Wnt activity
pTK-Renilla	Promega	#E2241	For measuring Wnt activity
HEK-293	ATCC	#CRL-1573	For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	#E1910	For measuring Wnt activity
Zeocin	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#R250-01	For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#17504-044	stored at -20 °C
N-Acetylcysteine	Sigma Aldrich	#A9165-5G	stored at -20 °C
Nicotinamide	Sigma Aldrich	#N0636	stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)	PrepoTech	#AF-100-15	stored at -20 °C
Gastrin	Sigma Aldrich	#G9145	stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)	Tocris	#2939	stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)	Selleckchem	#S1049	stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)	Sigma Aldrich	#S7067	stored at -20 °C
Primocin	InvivoGen	#ant-pm-1	stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin)	PrepoTech	#120-10C	stored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3)	R&D Systems	#3500-RS/CF	stored at -20 °C
Vancomycin	Sigma Aldrich	#861987- 250mg	stored at -20 °C
Gentamycin	Life Technologies: Gibco	#15710-049	stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	#431788	Stored at 4 °C
Matrigel	Corning	#354230	stored at -80 °C
TryplE Express	Life Technologies: Gibco	#12605-010	for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies: Gibco	#12648010	for freezing
Calcein	Life Technologies: Gibco	#C3100MP	stored at -20 °C
Forskolin	R&D Systems	#1099-50 mg	stored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809)	Selleckchem	#s1565	stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770)	Selleckchem	#s1144	stored at -80 °C
Name of Reagents/Material	Solvent	Stock Concentration	Final Concentration
GlutaMax		200 mM	2 mM
Hepes		1 M	10 mM
Penicillin/Streptomycin		10K U/ml 10K µg/ml	100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin		100 mg/ml	125 µg/ml
B27 supplement		100x	1x
N-Acetylcysteine	MiliQ H2O	500 mM
Nicotinamide	DPBS	1 M	10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)	DPBS 0.1% BSA	0.5 mg/ml	50 ng/ml
Gastrin	DPBS	100 µM	10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)	DMSO	5 mM	500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)	DMSO	10 mM	10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)	DMSO	30 mM	10 µM
Primocin		50 mg/ml	100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin)	DPBS 0.1%BSA	100 µg/ml	100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3)		varies per lot	300 ng/ml
Vancomycin		10 mg/ml	50 µg/ml
Gentamycin		10 mg/ml	50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	MiliQ H2O	0.5 M	2 mM
Calcein	DMSO	10 µg/ml	3.3 ng/ml
Forskolin	DMSO	10 mM	variable
Lumacaftor (VX-809)	DMSO	20 mM	variable
Ivacaftor (VX-770)	DMSO	20 mM	variable