Forskoline induite par Gonflement dans Intestinal organites: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Essai pour évaluer la réponse des médicaments dans les patients atteints de fibrose kystique

Résumé

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Résumé

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 °C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Introduction

CF est causée par des mutations dans le gène régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) qui code pour un canal anionique épithéliale. CF touche environ 85.000 personnes dans le monde ^1. Plus de 2000 mutations du gène CFTR ont été identifiées ( www.genet.sickkids.on.ca ). Cette diversité explique en partie un large spectre de phénotypes de la maladie observés ( www.CFTR2.org ) ^{2, 3.} Six classes de mutations du gène CFTR sont définies en fonction de leur effet sur l'expression et la fonction de la protéine CFTR: (I) pas de synthèse, (II) avec facultés affaiblies le trafic, (III) canal défectueux gating, (IV) conductance modifié, (V) les niveaux de normalement réduite fonctionnant CFTR et (VI) ayant une déficience cellulaire stabilité de la surface ^4. Bien que les mutations du gène CFTR communes sont bien étudiés, la fonction CFTR et relation avec l'état clinique restent poorly compris au niveau de l'individu, en particulier pour le grand groupe de rares "orphelines" mutations ( www.CFTR2.org ) ^{1, 3.}

Récemment, les médicaments ont été développés qui ciblent la protéine CFTR de manière spécifique à la mutation. Deux classes de CFTR médicaments protéiques de ciblage sont actuellement en usage clinique et ont des modes d'action distincts. Potentialisateurs, tels que le VX-770, d' améliorer l'open-probabilité de CFTR mutant apicale-localisé et agissent directement sur leur addition aux cellules ^5. Correcteurs, tels que le VX-809, restaurer le trafic de endoplasmique misfolded CFTR réticulum localisée et nécessitent une pré-incubation avec des cellules avant que les effets sont observés ^6. Le potentialisateur de CFTR, le VX-770, a été enregistrée pour les sujets atteints de la mutation G551D ^{7, 8,} ainsi que pour les huit autresCFTR gating mutations, y compris S1251N ^9; ensemble, ces mutations sont portés par 5% de tous les sujets des FC. D' autres essais cliniques ont indiqué que le VX-770, combiné avec le correcteur VX-809, a des effets limités mais significatifs sur la fonction pulmonaire et provoque une diminution des taux d'exacerbation chez les sujets homozygotes pour la mutation F508del porté par 45-50% des patients ^{10, 11.}

essais cliniques classiques pour identifier les sujets de drogue sensible dans les 50% restants des patients atteints de mucoviscidose sont coûteux et prend du temps et ne sont pas réalisables pour les personnes ayant de très rares génotypes de CFTR. Novel, méthodes personnalisées rentables sont cruciales pour correspondre au nombre croissant de modulateurs de CFTR à des individus porteurs de tout type de mutation CFTR. Jusqu'à présent, l'inclusion d'essai de groupes de patients porteurs de mutations du gène CFTR spécifique a été guidée par des études utilisant mutant transfection du gène CFTR dans hdes systèmes de cellules eterologous, suivie par des études électrophysiologiques dans des chambres d' Ussing ^{5, 6, 12.} En raison d'un manque de modèles animaux de CF adéquates, des études d'efficacité des médicaments dans les cellules épithéliales bronchiques air-liquide-interfaces différenciées dérivées de matériaux explants pulmonaires CF ont été utilisées pour le développement de médicaments ^{13, 14, 15.} Cependant, la disponibilité limitée des tissus d'explants pulmonaires et les procédures invasives pour obtenir des cellules bronchiques de sujets sans maladie en phase terminale d'entraver l'analyse des mutations du gène CFTR moins fréquentes et prévenir le dépistage des drogues d'une manière personnalisée. Pour surmonter ces limitations, les tissus «accès facile», comme organites colorectaux, les cellules des voies respiratoires nasales, et les cellules des voies respiratoires dérivées de cellules souches pluripotentes induites, sont actuellement à l'étude pour les traitements médicamenteux personnalisés.

Auparavant, nous avons établi des protocoles à des cellules souches épithéliales culture de tout organe digestif sous forme de 3D organites ^{16, 17.} facteurs de croissance pour le côlon / rectum humain, les conditions de culture impliquent définis (épithéliale Growth Factor (EGF), Gastrin, Wnt-3A, R-spondine 3 (Rspo3), et Noggin) combiné avec de petites molécules (nicotinamide, A83-01, et SB202190) dans une matrice de membrane basale. Dans ces conditions, les cellules souches individuelles ou de petits fragments de tissu développent dans fermées, kystique, des structures 3D formées par un épithélium hautement polarisé avec son côté de base orientée vers l'extérieur. Tous les types de cellules apparaissent généralement dans leurs rapports et positions normales. Organites peuvent être étendues sur de longues périodes par rupture mécanique hebdomadaire et re-placage. Ils sont génétiquement et phénotypiquement stables et peuvent être stockés, ce qui permet l' expansion à long terme et de la bio-banking ^17. Ils se prêtent àtoutes les manipulations de cellules biologiques standards / génétiques et des techniques analytiques développées pour les lignées cellulaires 2D ^18.

Nous avons récemment démontré que la fonction CFTR peut être facilement mesurée en organites colorectaux dans une enflure induite par la forskoline (FIS) dosage ^{19, 20.} Lorsqu'il est exposé à la forskoline (FSK) ou, en variante, à la toxine du choléra, organoïdes augmentent rapidement leur adénosine monophosphate cyclique (AMPc) niveaux, ce qui entraîne à son tour l'ouverture du canal CFTR ^19. Organites d'individus sains ou de sujets avec des mutations du gène CFTR associées à la fonction résiduelle, seront ensuite gonfler comme une conséquence de l' ion et le transport de l' eau à la lumière organoïdes, l'équivalent in vitro de la diarrhée sécrétoire. La réponse des organites FIS colorectales a été montré précédemment pour être entièrement dépendant de la CFTR, comme indiqué par les organites provenant d'individus CFTR-null, unnd par l'utilisation d'inhibiteurs de CFTR pharmacologiques spécifiques ^19. Les grands ensembles de données spécifiques au sujet peuvent être obtenus en quelques semaines après la prise d'une biopsie.

Pour le dosage de la FIS décrit en détail ici, organites sont cultivées à partir de biopsies rectales qui peuvent être obtenus à tout âge et avec seulement une gêne limitée ^21. Organites sont repiquées chaque semaine par une rupture mécanique dans cryptes simples qui RESEAL facilement et forment de nouveaux organites. Pour exécuter le test FIS, ~ 30-80 de ces petits organites dissociées sont étalées dans chaque puits d'une plaque à 96 puits ^19. Le jour de l'essai, les organites sont colorées avec du vert de la calcéine, un colorant fluorescent perméable aux cellules qui est retenu à l'intérieur des cellules vivantes, ce qui facilite l'imagerie en temps réel. Ensuite, FSK, ce qui augmente l'AMPc intracellulaire et active CFTR ainsi, est ajouté afin de stimuler le gonflement organoïde. Potentialisateurs qui agissent sur le CFTR apicale sont ajoutés simultanément wvec la forskoline, alors que les correcteurs qui rétablissent le trafic de CFTR sont ajoutés 24 heures avant l'addition de Fsk. Le gonflement organoide est quantifiée par une analyse d'image automatisé qui calcule l'augmentation relative de la superficie totale de tous les objets fluorescents pour chaque point de temps après l'addition de forskoline.

3D organoide gonflement fournit des avantages et des inconvénients sur les lectures CFTR électrophysiologiques existantes en 2D cellules des voies respiratoires cultivées dans des chambres de Ussing. Un avantage majeur est le débit de l'essai de gonflement. Les cellules sont cultivées et testées en utilisant un seul type de milieu de culture, et un technicien expérimenté peut culture jusqu'à 25 échantillons organoïdes sur une base hebdomadaire tout en quantifiant environ 1200 points de données par semaine dans 12 échantillons de patients. Nous tapons classiquement une seule condition expérimentale par des mesures double ou en triple par plaque et répéter ces mesures en trois points de temps d'incubation indépendants. Au total, environ 300-500 sIngle organoide structures sont ensuite mesurées par condition expérimentale, ce qui conduit à des mesures très précises de la fonction CFTR avec la variabilité technique limitée. Cette précision nous permet de définir clairement les différences de fonction résiduelle et la réponse à des modulateurs de CFTR et nous permet de prendre facilement des effets de fond génétiques entre les patients porteurs de mutations du gène CFTR identiques ^{19, 22, 23, 24, 25.} La qualité des données peut être facilement évaluée à partir d'images de microscope. Alors que la FIS est entièrement dépendant de la CFTR, il est une mesure de résultat indirect pour la fonction CFTR, son hors lecture causé par le couplage du transport d'ions pour le transport des fluides. Cela contraste avec les mesures de la fonction CFTR directe dans des chambres de Ussing, qui mesurent les courants ioniques transépithéliaux ^26. chambres Ussing permettent la stimulation de sélection de apical ou basolatéral compartments (dont le test organoide ne permet pas); par perméabilisation membranes basolatérale, la apical anion sécrétion dépendant de la CFTR peut être mesurée de manière sélective ^27.

Protocole

Toutes les expériences en utilisant des tissus humains décrits ici a été approuvé par le comité d'éthique à l'Université Medical Center Utrecht (UMCU; TcBio # 14-008). Le consentement éclairé pour la collecte des tissus, la production, le stockage et l'utilisation des organites a été obtenu à partir des patients à l'hôpital (WKZ) de -UMCU de Wilhelmina enfants.

Équipement	consommable	Outils
hotte à flux laminaire	15 et 50 ml tubes coniques	Zeiss LSM 800 - Zen 2 (édition Bleu) logiciel pour mesurer les images
Incubateur à CO2	tubes Microfuge	programme Microsoft Excel
Microscope de culture cellulaire (microscope optique / lumière)	0,22 um filtres
Centrifuger	pipettes sérologiques
Rouler Shaker	conseils de filtre Micropipette
4 ° C ambiante ou à 4 ° C pour réfrigérateur incubateur	cryotubes
CoolCell Cellule de congélation Conteneur
Pipettor sérologiques
Micropippette (1000, 200 et 20 ul)
Viaflo Répétez pipette
(Cellules vivantes) Microscope confocal
Ordinateur
réservoir d'azote liquide
Multichannel (200 pi)

1. Réactifs Préparation pour la culture

NOTE: Toutes les étapes sont effectuées à l'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique et à la suite des directives standard pour travailler avec des cultures de cellules. Afin de faciliter la formation de belles gouttes de sous-sol matrice de la membrane, maintenir un stock préchauffée de 96-, 24-, et des plaques de 6 puits dans l'incubateur à 37 ° C.

1. Basal Medium Préparation
   NOTE: medium Basal (BM) se réfère à Modified Eagle Medium avancée Dulbecco avec des éléments nutritifs du mélange de Ham F-12 (Ad-DF) additionné de 4- (2-hydroxyethil) acide -1piperazineethanesulfonic (HEPES), la glutamine et de la pénicilline / streptomycine (Pen / Strep).
   1. Dans un milieu bouteille de 500 ml Ad-DF, ajouter 5 ml de glutamine 200 mM, 5 ml de 1 M HEPES, et 5 ml de solutions / streptocoque de stylo (10.000 U / ml, 10 000 pg / ml).
   2. BM de magasin dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant au moins 4 semaines.
2. Moyen Préparation Wnt-3A-conditionné
   NOTE: moyenne Wnt-3A-conditionné est fait maison de using la lignée cellulaire L-Wnt-3A conformément aux instructions du fabricant.
   1. Pour récolter le moyen Wnt-3A-conditionné, de recueillir le milieu exposé aux cellules pendant une semaine et tourner vers le bas pendant 5 min à 450 xg pour éliminer les cellules flottantes.
   2. Filtrez le moyen Wnt-3A-conditionné à travers un filtre de 0,22 um et le diviser en aliquotes de 40 ml dans 50 ml tubes coniques. Conservez-les à 4 ° C pendant au moins 4 mois sans perte d'activité.
   3. Tester l'activité du milieu de Wnt-3A conditionné dans un dosage TOP / FOP en utilisant de rein embryonnaire humain (HEK) , les cellules transfectées avec -293 supérieure et FOP-luciférase de Renilla et TK- et mesurées avec un Renilla -luciferase kit de dosage selon la les instructions du fabricant.
      NOTE: TOP-luciférase est un plasmide rapporteur qui contient des régions de liaison TCF de type sauvage. Si le milieu Wnt-3A-conditionné est actif, la signalisation Wnt canonique est activée. Beta-caténine translocation dans le noyau d'associer l'esprith TCF / facteurs de transcription LEF et active la transcription du rapporteur de la luciférase, induisant une augmentation de l'activité relative de la luciférase lorsque le substrat est ajouté. La FOP-luciférase est utilisé comme témoin négatif parce que le TCF régions de liaison en amont du gène de la luciférase sont mutés.
3. Colon moyen Préparation
   NOTE: Préparer et diluer tous les facteurs de croissance et de réactifs selon les recommandations du fabricant. Utilisez aliquotes de petite taille un éviter les cycles de gel-dégel. facteurs de croissance fonctionnels sont essentiels pour les résultats.
   1. Préparer le milieu du côlon (CM) en complétant BM avec 1x B27, 1,25 mM N-acétylcystéine, 50 ng / ml de hEGF, 5 nM gastrine, 10 mM de nicotinamide, 300 ng / ml hRspo3, 100 ng / ml hNoggin, 500 uM A83-01 , 10 pM SB202190 et 100 pg / ml d'un anti-infectieux pour les cellules primaires.
   2. Diviser le CM en aliquotes et les congeler à -20 ° C pendant jusqu'à 4 mois. Décongeler les aliquotes pour préparer complète du côlonmoyen (FCM) en ajoutant 50% de milieu Wnt-3A-conditoned au CM. FCM magasin jusqu'à 7 jours à 4 ° C sans perte d'activité.
   3. Pour la mise en place d'une culture organoide à partir de biopsies rectales, compléter la FCM avec 50 pg / ml de vancomycine, 50 pg / ml de gentamicine, et un inhibiteur de 10 pM de rho-associé à enroulement en spirale formant la protéine sérine / thréonine kinase (RhoKi). Utilisez ce moyen, moyen d'isolation appelé (IM), seulement pour les deux à trois premiers jours de culture.
4. Solution EDTA Stock Préparation
   1. Préparer l' acide 0,5 M éthylènediaminetétraacétique (EDTA), pH 8, en ultra - pur H ₂ O, stérilisé avec un filtre de 0,22 um.
5. La manipulation de la membrane basale Matrice
   1. Préparer la matrice de la membrane basale (BMM) selon les recommandations du fabricant.
   2. Thaw BMM nuit sur la glace.
   3. Lors du transfert de la BMM de la bouteille à 15 ml tube conique, l'utilisationune pipette de 5 ml et un tube de 15 ml conique pré-refroidi à -20 ° C.
   4. Une fois décongelé, rangez le BMM dans un réfrigérateur à 4 ° C et incuber sur la glace pendant au moins 30-60 minutes avant utilisation.
      NOTE: Afin d'obtenir les meilleurs résultats, le BMM doit être froid et correctement mélangés avant l'incorporation cryptes ou organites.

2. L'établissement organites Colon à partir d'une biopsie des patients CF

REMARQUE: après la collecte des tissus, il est important de maintenir l'échantillon sur de la glace dans une solution saline, une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans Ca ²⁺ et Mg ²⁺ (DPBS) ou BM. Le traitement rapide des biopsies est recommandé, mais il est avéré possible d'établir des cultures organoïdes à partir de biopsies stockées sur la glace pendant jusqu'à 7 jours.

1. Que les biopsies se déposent au fond d'un tube conique de 15 ml et éliminer le surnageant.
2. Ajouter 10 ml de DPBS pour les biopsies et la pipette vers le haut et vers le bas 10-20 fois en utilisant une pipette de 10 ml.
   REMARQUE: La pipette doit être pré-humidifiée avec BM avant pipetage la biopsie.
3. Que les biopsies se déposent au fond et enlever le surnageant.
4. Répétez les étapes 2.2 et 2.3 4-5 fois jusqu'à ce que le surnageant soit clair.
5. Ajouter 10 ml de DBP et 200 ul d'EDTA (0,5 M) aux biopsies et placer le tube sur une plate-forme de tube à bascule pour 60-120 min à 4 ° C.
   NOTE: Le temps d'incubation peut varier par patient. Si cryptes sont libérés, DPBS devient trouble. EDTA incubation peut être finalisé lorsque cryptes peuvent être observées au microscope.
6. Permettre aux cryptes de se déposer. Jeter le surnageant.
7. Prenez 2 ml de BM et l'ajouter à un nouveau tube de 15 ml conique. Agiter ce nouveau tube manuellement d'une manière telle que la face intérieure est recouverte de BM.
8. En utilisant une pipette de pré-humidifiée avec BM, ajouter 2 ml de DPBS dans le tube contenant les biopsies et la pipette vers le haut et vers le bas 10-20 fois.
9. Autoriser les biopsies à établir et à transférer les DPBS avec les cryptes à la nouvelletube contenant 2 ml de BM qui a été préparé à l'étape 2.7.
10. Répétez les étapes 2.8 et 2.9 jusqu'à ce qu'aucune cryptes sont libérés.
11. Faites tourner les cryptes vers le bas à 130 xg pendant 5 min à 8 ° C.
12. En attendant, le transfert IM à l'armoire de sécurité à la température ambiante (RT).
13. Jeter le surnageant et ajouter 10 ml de BM à la crypte culot et répétez l'étape 2.11.
14. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de BM. Prenez 5-10 pl et compter le nombre de cryptes par oeil sous un microscope.
15. Faites tourner les cryptes vers le bas à 130 xg pendant 5 min à 8 ° C.
16. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 55% BMM (v BMM à v IM).
    NOTE: Les cryptes sont remises en suspension dans le volume correspondant de 55% BMM à 1 crypte par ul. S'il n'y a pas assez cryptes, le volume minimum de BMM est de 40 pi.
17. Pour le semis, pipette 35 ul par puits (dans une plaque de 24 puits). Divisez les 35 pi de BMM dans 3-5 gouttes séparément afin d'améliorer la diffusion de growth facteurs dans le BMM. Ne pas créer de bulles.
18. Placer et laisser la plaque à l'envers dans l'incubateur à 37 ° C pendant au moins 20 min pour la BMM se solidifier.
19. Ajouter 500 ul de IM par puits et le maintenir dans l'incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2.
20. Actualiser le moyen tous les 2-3 jours. Retirer l'ancien milieu par aspiration avec une pipette P1000, en laissant tomber BMM intacte. Ajouter délicatement la FCM par pipetage dans le côté du puits, et non pas directement sur le BMM tombe.
    REMARQUE: Si aucun cryptes sont libérés dans le protocole d'isolement, centrifuger le surnageant, laver le culot 2-3 fois avec BM, et resuspendre dans BMM. Prenez le tissu des restes et le couper en petits morceaux avec un rasoir. Recueillir ces derniers dans un tube conique de 15 ml, centrifuger, et les remettre en suspension dans le même BMM. Si des cellules souches épithéliales sont présents, ceux-ci seront également générer des organites.

3. repiquage des organites Colon pour la maintenance, de congélation, et pourskolin induite par Gonflement Assay (FIS)

NOTE: Chaque culture organoide a son propre temps de doublement. Normalement, organites des FC colorectaux peuvent être étendues 1: 3-1: 5 fois tous les 7-10 jours. Il est un bon signe si les structures en herbe sont observées. Organites Colorectal CF sont moins kystique (Figure 2A - 2C) que organites normales colorectaux (Figure 2D). Pour l'établissement et la maintenance, organites sont cultivées dans des plaques à 24 puits; pour la congélation, dans des plaques à 6 puits; et pour le dosage de ski, dans patés de 96 puits.

1. Repiquage des organites
   1. Gardez le BMM sur la glace pendant au moins 30-60 minutes avant de l'utiliser.
   2. Gardez la FCM à la température ambiante pendant au moins 1 heure avant de l'utiliser.
   3. Etiqueter le tube un 15 ml conique avec le nom de l'échantillon et un autre tube comme «lavé».
   4. Aspirer soigneusement le milieu des puits en utilisant une pipette P1000 sans perturber le BMM tombe.
   5. Ajouter 1 ml de BM à 1 puits et bReak la BMM gouttes à l'aide d'une pipette P1000. Transférez ce 1 ml dans le tube de 15 ml conique avec le nom de l'échantillon.
   6. Laver les puits avec encore 1 ml de BM et la transfère dans le même tube de 15 ml.
   7. Répétez les étapes 3.1.5 et 3.1.6 avec 5 puits plus (jusqu'à 6 puits d'une plaque de 24 puits seront lavés dans un 15 ml tube conique).
   8. Remplir le tube jusqu'à 12 ml avec BM. Pipette de haut en bas à l'aide d'une pipette ml pré-humidifié 5.
   9. Spin à 85 xg pendant 5 min à 8 ° C.
   10. Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de BM au culot. Avec la même pointe P1000 de pipette, prendre jusqu'à une pointe de P10 sans filtre, et la pipette de haut en bas 20 fois. Jeter les deux P1000 et des conseils de P10.
   11. Ajouter 4 ml de BM avec une pipette de 5 ml et maintenir le tube incliné à environ 70 ° par rapport à la verticale d'un côté. Mouillez un nouvel embout de P1000 et mélanger vigoureusement 2-3 fois avec le P1000 (volume 1 ml).
   12. Comptez jusqu'à 10 tout en restant dans la position inclinée, recueillir soigneusement la couche supérieure wvec la pipette P1000, et le transfert 4 x 1 ml dans le tube étiqueté comme «lavé».
   13. Observer les organites de décantation vers le bas dans le tube incliné; organites sans perturbation et de plus gros morceaux vont tomber au fond. Centrifuger les 15 ml "lavé" tube pendant 5 minutes à 85 xg et 8 ° C.
   14. Jeter le surnageant et ajouter la quantité de milieu nécessaire et BMM à la pastille organoïde à une concentration finale de 55% BMM. Mélanger par pipetage de haut en bas sans créer de bulles (figure 3B).
       NOTE: Une bonne densité est obtenue par ensemencement 25-30 organites dans 10 pi de BMM.
   15. Suivez les étapes de 2,17 à 2,19.
2. Repiquage pour congélation
   1. Gardez la BM dans la glace pendant au moins 30-60 minutes avant utilisation. Gardez la FCM à la température ambiante pendant au moins 1 h avant de l'utiliser.
   2. Préparer FCM supplémenté avec RhoKi (étape 1.3.3).
   3. Prenez trypsine du réfrigérateur et le laisser à température ambiante pendant au moins 30 min avant utilisation.
   4. Suivez les étapes 3.1.5-3.1.10.
   5. Retirez autant que possible surnageant, ajouter 4 ml de trypsine, et vortex pendant 30 sec.
   6. Placer le tube dans un bain d'eau chaude à 37 ° C pendant 1 min et vortex vigoureusement pendant 30 sec.
   7. Inspecter la solution dans le tube. Si organites intacts sont encore visibles sous le microscope, répétez l'étape 3.2.7.
   8. Lorsque les organites sont perturbés, ajouter 8 ml de BM pour neutraliser la trypsine et la pipette 10 fois.
   9. Spin pendant 3 min à 450 xg à 8 ° C.
   10. Jeter le surnageant et ajouter la quantité requise de moyen et BMM aux organites pour parvenir à une solution BMM 55%. Mélanger par pipetage de haut en bas sans créer de bulles.
       NOTE: Pour la congélation, organites doivent être ensemencées dans un rapport 1: 1 après trypsinisation.
   11. Graine de 250 pi dans un seul puits d'une plaque à 6 puits de culture de tissu pré-chauffé, produisant de minuscules gouttelettes séparées de ~ 10 pi. Placer la plaque à l'envers dans l'incubateur à 37 ° C et laisser leBMM se solidifier pendant 20-30 min.
   12. Ajouter 2,5 ml de FCM fraîche + RhoKi dans chaque plaque de 6 puits puits et transférer la plaque dans l'incubateur (figure 3C).
3. Repiquage organites pour le dosage de la FIS
   NOTE: Selon le nombre et la taille des organites, entre 4 et 6 puits d'une plaque de 24 puits sont suffisamment pour l'ensemencement de 27 puits d'une plaque de 96 puits.
   1. Traiter les organites comme décrit des étapes 3.1-3.1.13.
   2. Reprendre le culot dans 120 ul de 50% BMM.
   3. Confirmer le nombre d'organites (30-50) dans un 3 pl BMM goutte sous le microscope.
   4. Plate les organites en utilisant une seule goutte de 3 ul placés au milieu de chaque puits d'un pâté de 96 puits.
   5. Placer la plaque dans l'incubateur à 37 ° C pendant 15 min pour le BMM se solidifier; d'autres étapes sont décrites dans l'étape 6.1.1.

4. Colon congélation organites CF

NOTE: Organoids sont prêts à être congelés jusqu'à 1-2 jours après trypsinisation et la culture, de sorte que organites sera toujours faible, ce qui augmente l'efficacité de la survie après décongélation.

1. Ajouter 1 ml de BM et briser la BMM gouttes à l'aide d'une pipette P1000. Transférer dans un tube conique de 15 ml.
2. Laver le bien avec un autre 1 ml de BM et le transfert vers le même tube de 15 ml.
3. Répétez les étapes 4.1 et 4.2 avec tous les puits.
   NOTE: Pour éviter l'excès de BMM, 3 puits d'une plaque à 6 puits sont regroupés dans un tube de 15 ml.
4. Remplir le tube de 15 ml contenant les organites avec 12 ml de BM à froid et la pipette de haut en bas avec une pipette de 5 ml. Laisser le tube sur la glace pendant 5 min.
5. Spin pendant 3 min à 450 xg et 8 ° C et retirer le surnageant.
6. Dissoudre le culot de organites avec un milieu de congélation et la pipette de haut en bas pour remettre en suspension correctement les organites.
   NOTE: 500 pi de milieu de congélation est utilisé pour chaque 100 pi de BMM.
7. L'utilisation d'un 5 ml pipette, transférer 0,5 ml deorganites remises en suspension dans milieu de congélation à stériles flacons cryogéniques.
8. Transférer les flacons dans un récipient de congélation de cellules et de le mettre à -80 ° C.
9. Après 24 h, transférer les flacons pour le stockage dans de l'azote liquide.

5. Mise en place des cultures de Frozen organites

NOTE: Décongeler le BMM sur la glace et le garder sur la glace. Laissez le BM atteindre RT, et réchauffer une aliquote de 10 ml à 37 ° C avant de commencer la procédure de décongélation d'un cryovial.

1. Décongeler le flacon rapidement par agitation dans un bain d'eau C 37 ° jusqu'à ce qu'il reste un peu de matériel congelé.
2. Transférer les organites décongelé dans un tube conique de 15 ml à l'aide d'une pipette P1000.
3. Immédiatement après, ajouter 1 ml de chute de BM chaude à goutte tout en agitant le fond du tube. Une fois les 1 ml de milieu est ajouté, mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas plusieurs fois pour diluer le milieu de congélation.
4. Lentement (goutte à goutte) ajouter 9 ml de chaud BM à la conta de tube coniqueIning les organites. Inversez quelques fois.
5. Faites tourner la suspension cellulaire pendant 3 min à 85 xg et 8 ° C.
6. Jeter soigneusement le surnageant sans perturber le culot. Reprendre le organoide dans 90 pi de FCM complété avec RhoKi (étape 1.3.3). Ensuite, ajouter 110 pi de BMM.
7. Ajouter 35 ul à chaque puits d'une plaque de 24 puits pré-chauffé, faisant de minuscules gouttelettes séparées.
8. Transférer la plaque à l'étuve 37 ° C, en laissant la plaque de tête en bas pendant 20 à 30 min.
9. Ajouter 500 pi de la FCM avec RhoKi à chaque puits et transférer la plaque arrière à l'incubateur (figure 4A - 4C).
10. Une fois organites ont récupéré correctement à partir de la décongélation, diluer plus BMM de sorte que chaque 10 pi de BMM contient 25-30 organites. Cette procédure peut être effectuée 2-3 jours après la décongélation (figure 4D - 4G) et assure la bonne croissance du organoïde.

6. forskoline induite par Gonflement Commedire (FIS)

NOTE: Fsk titration permet la mesure de la fonction résiduelle CFTR. CFTR pour la modulation, organites sont exposés à un correcteur donné (par exemple, VX-809) et / ou de potentialisation (par exemple, VX-770), selon le génotype. En général, le VX-809 est ajouté 18 à 24 h avant la mesure, tandis que le VX-770 et FSK sont ajoutés juste avant le début des mesures. Soyez conscient que certains modulateurs (Correcteurs / potentialisateurs) peuvent se lier à la surface en plastique de la plaque d'essai.

1. Placage pour le dosage
   NOTE: VX-809 stocks sont aliquotées à 20 mM et conservées à -80 ° C. Lors de la décongélation, laisser à la température ambiante et de protéger de la lumière.
   1. Traiter les organites comme décrit dans la section 3.3.
   2. Si le test du correcteur VX-809, préparer une courbe dose-réponse en triple exemplaire avec les concentrations suivantes: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 et 30 uM. Préparer les dilutions dans la FCM.
   3. Pour la plaque de 96 puits, ajouter soit 100 μ; L de la FCM avec les VX-809 de concentration ou de 100 ul respectives de la FCM seulement et incuber la plaque.
2. Mesurer le dosage
   NOTE: VX-770 stocks sont aliquotées à 20 mM, tandis que Fsk est à 10 mM; les deux sont conservés à -80 ° C. Lors de la décongélation, laisser à température ambiante et protéger de la lumière.
   1. Prenez un flacon de calcéine et de DMSO et de laisser à température ambiante pendant 15 min.
   2. Ajouter 5,1 ul de DMSO à la fiole lorsque la calcéine est fourni sous forme de poudre, suivant l'achat. Sinon, utilisez un flacon de calcéine déjà remis en suspension contenant 2,5 pi de calcéine.
   3. Ajouter 2,5 ul de calcéine à 580 pl de PR dans un tube de 1,5 ml et étiqueter.
   4. Ajouter 10 pi de cette solution de colorant (BM + calcéine) dans chaque puits en utilisant une pipette à répétition.
   5. Remettre en suspension une fois avec un multi-canaux pour garantir que le colorant est bien mélangé.
   6. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min.
   7. Au cours de l'incubation de la calcéine, commencer à préparer le Fsket des solutions VX-770, si nécessaire.
   8. Si l'on utilise un potentialisateur VX-770, préparer une courbe dose-réponse en triple exemplaire avec les concentrations suivantes: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 et 30 uM. Dans le cas d'un titrage Fsk, les concentrations sont les suivantes: 0, 0,008, 0,02, 0,05, 0,12, 0,32, 0,8, 2,0 et 5,0 uM. Préparer les dilutions dans BM.
      NOTE: Pour Fsk, VX-770, ou tout autre médicament ajouté le deuxième jour, les dilutions doivent être préparées à une concentration finale 2x, puisque 100 pi de Fsk solution / de titration de médicament sera ajouté à chaque puits, qui contiennent déjà 100 pi de la FCM.
   9. Transférez le Fsk et VX-770 solutions, une pipette P200, et des conseils pour la salle de microscope.
   10. Pour l' imagerie du test FIS, utiliser une imagerie cellulaire microscope confocal en direct équipé d'une étape automatisée, une chambre chauffée, et flux de CO _2.
       REMARQUE: Les étapes suivantes se réfèrent à un microscope spécifique. Différentes configurations doivent appliquer à d'autres microscopes suivant fabricantinstructions.
   11. Mettez la plaque de 96 puits dans le support de plaque.
   12. Entrez les paramètres confocale pour l'imagerie.
       1. Preset l'outil d'imagerie en direct à 37 ° C et 5% de CO ₂ et de laisser la chambre pré-incuber pendant un minimum de 30 minutes avant la mesure.
       2. Utilisez l'option "Smart Setup" pour sélectionner la piste Alexa Fluor-488.
       3. Placez l'objectif 5X et la zone de numérisation à 0.6X pour rétrécir et capturer l'ensemble du bien.
       4. Adapter la sensibilité de la puissance du laser et du détecteur pour permettre la détection optimale des organites marqués calcéine-vert sur le fond. Le sténopé peut être augmentée à 130 um et l'image de la moyenne peut être réglée à 2.
       5. Régler la profondeur de bits à 8 et la taille de l'image à 512 x 512.
       6. Utilisez l'option de séries chronologiques pour définir les mesures à temps, la fréquence et les intervalles.
          NOTE: suggérée pour des mesures régulières: 1 h avec 10 min d'intervalle: cycles = 7 (cycle 1 est T = 0). Pour les mesures de gonflement réduite, organoïdes peuvent être imagées jusqu'à 3 heures.
       7. Utilisez l'option de tuiles pour déterminer manuellement les positions de puits individuels.
   13. Ajouter 100 ul de la Fsk et / ou VX-770 des solutions aux puits correspondants, en suivant le même ordre que celui de la mesure. Commencer à ajouter les solutions dans le premier imagées bien et continuer avec l'ordre d'imagerie.
   14. Démarrez la mesure.
   15. Après l'expérience est terminée, enregistrez le fichier.
3. Analyse des données FIS Assay
   1. Créer une macro "analyse organoide" pour l'analyse des données de l'essai de la FIS en utilisant l'outil d'analyse dans un logiciel d'analyse d'image qui reconnaît toutes les structures imagées par la piste Alexa-488 et remplit les structures identifiées pour calculer l'augmentation de la superficie organoide total sur la différents points de temps.
   2. Ouvrez le fichier de données avec les images acquises dans le programme d'analyse d'image.
   3. Sélectionnez la macro pour l'analyse organoide.
   4. Définir le seuil d'équilibrer le rapport signal-bruit dans un puits à 1 point de temps et de veiller à ce que toutes les structures organoïdes sont reconnus et remplis.
      1. Arrivée 4-6 puits pour voir si toutes les structures sont également reconnues au point 7. de temps légèrement modifier le seuil pour veiller à ce que les signaux de fond au point 7 de temps ne sont pas reconnus comme des structures (le seuil spécifique peut changer quelque peu entre les expériences).
   5. Définissez les critères de taille de zone minimale d'objets reconnus à 1000 um ^2.
   6. Appuyez sur "analyser" pour démarrer. L'analyse prend environ 3 min, en fonction du logiciel utilisé.
   7. Lorsque le logiciel est terminé, allez à «créer la table" et sélectionnez les données suivantes: bien numéros (tableau devrait augmenter dans cet ordre), des points de temps, et la superficie totale par puits.
   8. Enregistrer le fichier en tant .xlm à exporter vers un tableur.
   9. Dans ce programme, calculer l'augmentation relative de la surface par well en définissant la superficie de 1 point de temps à 100%. Calculer l'aire sous la courbe (AUC) à partir de points de temps 1-7 par condition; la limite inférieure de la zone (valeur Y) est fixé à 100%. FSK ou de drogue titrages (axe X) sont tracées en fonction de l'ASC (axe Y).

Résultats

La figure 1A montre un isolement frais représentatif de cryptes embarqués sur BMM. Les cryptes sont d'une biopsie du côlon d'un sujet CF. Habituellement, un organoïde est généré à partir de chaque crypte (figure 1A - C). En raison du dysfonctionnement du CFTR, la plupart des organites colon des FC ne sont pas kystique, mais sont compacts et avec des projections et des bourgeonnements (Figure 2A - ...

Discussion

Ici, nous fournissons un protocole complet pour la génération, l'expansion, la congélation et la décongélation des organites colorectales humaines. Alors que nous avons établi des cultures de organoïdes humains il y a quelque temps ^17, il a parfois avéré difficile d'établir la technologie dans d' autres laboratoires sans formation pratique. Nous prévoyons que ces protocoles remplaceront une telle formation.

Wnt-3A-milieu conditionné est l'u...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#12634	stored at 4 °C
GlutaMax	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#35050	stored at 4 °C
Hepes	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	# 15630-056	stored at 4 °C
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#15140-122	stored at -20 °C
96 well culture plate	Cellstar	#655180
24 well culture plate	Cellstar	#662160
6 well culture plate	Cellstar	#657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)	Life Technologies: Gibco	#14190-094	stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#31966-021	For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Bovogen	#SFBS LOT#11113	For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell line	ATCC	#CRL-2647	For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmids	Millipore	#17-285	For measuring Wnt activity
pTK-Renilla	Promega	#E2241	For measuring Wnt activity
HEK-293	ATCC	#CRL-1573	For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	#E1910	For measuring Wnt activity
Zeocin	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#R250-01	For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#17504-044	stored at -20 °C
N-Acetylcysteine	Sigma Aldrich	#A9165-5G	stored at -20 °C
Nicotinamide	Sigma Aldrich	#N0636	stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)	PrepoTech	#AF-100-15	stored at -20 °C
Gastrin	Sigma Aldrich	#G9145	stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)	Tocris	#2939	stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)	Selleckchem	#S1049	stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)	Sigma Aldrich	#S7067	stored at -20 °C
Primocin	InvivoGen	#ant-pm-1	stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin)	PrepoTech	#120-10C	stored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3)	R&D Systems	#3500-RS/CF	stored at -20 °C
Vancomycin	Sigma Aldrich	#861987- 250mg	stored at -20 °C
Gentamycin	Life Technologies: Gibco	#15710-049	stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	#431788	Stored at 4 °C
Matrigel	Corning	#354230	stored at -80 °C
TryplE Express	Life Technologies: Gibco	#12605-010	for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies: Gibco	#12648010	for freezing
Calcein	Life Technologies: Gibco	#C3100MP	stored at -20 °C
Forskolin	R&D Systems	#1099-50 mg	stored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809)	Selleckchem	#s1565	stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770)	Selleckchem	#s1144	stored at -80 °C
Name of Reagents/Material	Solvent	Stock Concentration	Final Concentration
GlutaMax		200 mM	2 mM
Hepes		1 M	10 mM
Penicillin/Streptomycin		10K U/ml 10K µg/ml	100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin		100 mg/ml	125 µg/ml
B27 supplement		100x	1x
N-Acetylcysteine	MiliQ H2O	500 mM
Nicotinamide	DPBS	1 M	10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)	DPBS 0.1% BSA	0.5 mg/ml	50 ng/ml
Gastrin	DPBS	100 µM	10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)	DMSO	5 mM	500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)	DMSO	10 mM	10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)	DMSO	30 mM	10 µM
Primocin		50 mg/ml	100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin)	DPBS 0.1%BSA	100 µg/ml	100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3)		varies per lot	300 ng/ml
Vancomycin		10 mg/ml	50 µg/ml
Gentamycin		10 mg/ml	50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	MiliQ H2O	0.5 M	2 mM
Calcein	DMSO	10 µg/ml	3.3 ng/ml
Forskolin	DMSO	10 mM	variable
Lumacaftor (VX-809)	DMSO	20 mM	variable
Ivacaftor (VX-770)	DMSO	20 mM	variable