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要約

組み合わせ前駆同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）は、アイソバリックタグのサンプル多重化機能を強化し、定量プロテオミクス戦略です。このプロトコルは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの組織へのcPILOTの適用を説明しています。

要約

病気の理解とバイオマーカー探索のために多くの生物学的サンプルを分析するための需要が高まっています。複数のサンプルの同時測定を可能に定量プロテオミクス戦略が普及し、大幅に実験的なコストと時間を削減しています。私たちの研究室では、伝統的な同位体ラベルまたはアイソバリックタグ付けアプローチのサンプル多重化を強化する同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）を組み合わせ、前駆体と呼ばれる技術を開発しました。グローバルcPILOTは、細胞、組織、体液、または生物全体に由来するサンプルに適用し、異なる試料条件を横切る相対タンパク質存在量に関する情報を提供することができます。 cPILOTは（ 材料/試薬の表を参照） を選択dimethylateペプチドのN末端に低pH緩衝液条件を使用し、2）市販のアイソバリック試薬とリジン残基の一級アミンを標識するために高pH緩衝液条件を使用して）1によって働きます。度利用可能なサンプルの多重化が使用される前駆体ラベルおよび同重体標識試薬の数に依存します。ここでは、1回の分析でのマウス組織からの12個のサンプルを分析するために六プレックスアイソバリック試薬と組み合わせ軽および重ジメチル化を使用して、12プレックス分析を提示します。強化多重化は、実験の時間とコストを削減し、より重要なことには、より少ない実験バイアスとエラーを有する多くのサンプル条件を横断比較（生物学的複製、病期、薬物治療、遺伝子型、又は長手方向時点）を可能にするために有用です。この作品では、グローバルcPILOTアプローチは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの生物学的複製を越え、脳、心臓、および肝臓組織を分析するために使用されます。グローバルcPILOTは、他の生物学的プロセスを研究するために適用され、20個の以上のサンプルにサンプル多重化を増大させるために適合させることができます。

概要

プロテオミクスは、多くの場合、より良い疾患プロセスを理解するために使用される多くのサンプルを、酵素反応速度、翻訳後修飾、環境刺激に反応し、治療処置、バイオマーカーの発見、または薬物のメカニズムへの応答の分析を含みます。定量的な方法は、サンプルを横切るタンパク質レベルの相対的差異を測定するために使用することができ、ラベルフリーであるか、または同位体標識（代謝的、化学的、または酵素）を含むことができます。彼らは多くのサンプルを同時に分析することを可能にし、異なる細胞、組織、体液、または生物全体からのサンプルに適しているので、安定同位体標識法は、人気が成長しています。同位体標識法1、2、3、4、5、6、7増加実験スループット、取得時間、コスト、および実験誤差を低減します。これらの方法は、ペプチドピークからのタンパク質の相対存在量を測定するために、前駆体の質量スペクトルを使用します。対照的に、同重体標識試薬は、8、9、10は、いずれかのMS / MS又はMS 3スペクトル11で検出され、これらのピークは、タンパク質の相対存在量について報告するために使用されるレポーターイオンを生成します。

現在の最先端のプロテオミクス多重では、10プレックス12または12重アイソバリックタグの分析13のいずれかです。強化サンプル多重化（ すなわち > 10個のサンプル）の方法は、セル18の分析のために他の人が組織14、15、16、17のために我々の研究室によって開発された、とされていますSUP>、19、20、21、または標的化ペプチド22を組織します。私たちは、アイソバリックタグ（cPILOT）との組み合わせ前駆同位体標識と呼ばれる強化多重化技術を開発しました。グローバルcPILOTは、異なる試料条件（≥12）14を横切る全てのタンパク質の相対濃度に関する情報を取得するために有用です。 図1は、一般的cPILOTワークフローを示します。トリプシンまたはLys-Cペプチドは、選択的に低pH 2を用いてジメチル化とN末端と高いpHを使用して6-プレックス試薬とリジン残基で標識されます。この戦略は、実験的なコストを削減するのに役立ち、さらに、実験の手順や時間を削減するアイソバリック試薬を用いて分析することができ、サンプルの数が2倍になります。

我々は、酸化翻訳後MODIを研究するために他の方法を開発してきたようcPILOTは柔軟性があります3-ニトロチロシン修飾タンパク質14およびS-ニトロシル化（oxcyscPILOT）23とシステインを含むペプチドを含むfications、。我々はまた、アミノ酸の選択的アプローチ、システインcPILOT（cyscPILOT）17を開発しました。トップイオン11または選択-Y 1 -イオン法15とMS 3獲得は、レポーターイオンの干渉を軽減し、cPILOTの定量精度を向上させることができます。低解像度のイオントラップ機器は、24を動作することができるものの、取得方法におけるMS 3の使用は、オービトラップ質量分析器と高分解能機器を必要とします。

以前は、cPILOTは、アルツハイマー病のモデルマウスからの肝臓タンパク質16を研究するために使用されてきました。ここでは、peripheの役割を研究するために、脳、心臓、肝臓ホモジネートを使用してグローバルcPILOT分析を実行する方法について説明しますアルツハイマー病におけるRY。この実験は、生物学的複製を内蔵しています。そのためcPILOTの汎用性、興味のあるユーザーは、生物学的な問題やシステムの範囲のために他の組織を研究するために技術を使用することができます。

プロトコル

倫理文：マウスは、独立した非営利生物医学研究機関から購入し、ピッツバーグ大学の実験動物資源部門に収容しました。全ての動物プロトコルは、ピッツバーグ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

化学タギング1.タンパク質抽出およびペプチドの生成

  1. 組織、細胞、または体液からタンパク質を抽出します。
    1. 機械式ホモジナイザーを用いて8 M尿素（500μL）を用いてリン酸緩衝生理食塩水（1×PBS）で組織の60〜90 mgの（ 例えば 、脳、心臓、および肝臓）を均質化します。必要であれば、プロテアーゼまたはホスファターゼ阻害剤を緩衝液に添加してもよいです。このプロジェクトでは、彼らが使用されませんでした。ホモジナイザーは、次のパラメータを使用する：行列Aビーズ、4メートル/秒、20秒を溶解します。心臓組織は、均質化の最大9サイクルが必要な場合があります。
      注：プロテアーゼまたはホスファターゼ阻害剤必要であれば、Sがバッファに追加されてもよいです。彼らは、この研究で使用されませんでした。
      1. 溶解チューブから組織ホモジネートを取り外し、マイクロ遠心チューブに移します。 8 M尿素を含むPBSの100-500μLで管を溶解リンスし、組織ホモジネートと共にリンス液を組み合わせます。
    2. ホモジナイズした組織を遠心分離（9447×gで、4℃、15分）し、上清を集めます。
  2. 製造業者の指示に従ってビシンコニン酸（BCA）アッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。
    注：タンパク質濃度が高すぎると、バッファとのさらなる希釈が必要な場合があります。これらの組織からの試料について得られた濃度は6-13μgの/μLの間にありました。
    1. オプション：比1μgの標準と内部品質管理基準（ 例えば 、ウシ、アルファカゼインまたはその他の外因性タンパク質）を追加します：100μgタンパク質サンプル。
jove_title "> 2。試料分解

  1. 個々のマイクロ遠心管を標識するために、各試料からのタンパク質の100μgの（100×10 -6 g）を加えます。ボリュームは、タンパク質濃度に依存している（ステップ1.2参照）。
  2. 各サンプルに：（モル比をサンプリングする1試薬40）ジチオスレイトール（DTT）を加えます。 2時間37℃でインキュベートします。モル比の計算は、66.5×10 3グラム/モルであるウシ血清アルブミン（BSA）のタンパク質の質量をオフに基づいています。
  3. 各サンプルに：（モル比をサンプリングする1試薬80）ヨードアセトアミド（IAM）を加えます。 2時間暗所で氷上でインキュベートします。この反応は、副反応を防止するために、2時間氷上で行われます。
  4. 各サンプルに：（モル比をサンプリングする1試薬40）L-システインを加えます。室温で30分間インキュベートします。
  5. 2 Mの最終濃度となるように尿素を希釈するために10mMのCaCl 2を液（pH 8.2）を含む20mMトリス緩衝液を加えます
  6. 50（トリプシン - 処理L-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン（TPCK）を追加：モル比を酵素に1基板）を各試料に24時間37℃でインキュベートします。
  7. フラッシュ凍結さらに処理するまで-80℃で液体窒素とストア内のサンプルによるタンパク質消化をクエンチします。

3.サンプルの脱塩

  1. ギ酸（FA）を添加することによって、サンプルを再酸性化します。 0.1％の最終濃度を得るために十分なFAを追加します。サンプルは-80℃で、元々ある場合は、再酸性化の前に氷上でサンプルを解凍。
  2. 以前に16を説明したようにC 18の親水性親油性バランス（HLB）10 mgのカートリッジを用いて脱塩ペプチド。
  3. 〜10μLの体積に真空遠心分離（5トル、45℃、77 XG）によって試料を乾燥させます。

4.ジメチル化標識（N末端）

  1. 高速液体クロマトグラフィー（HPLC）またはナノ純グレードの水に溶解し、1％酢酸（0.25μgの/μL）でペプチドを再構成します。 50μを削除;グラム新しい微量遠心管に部分（1.5 mL）に溶解し、-80℃で剰余を格納します。
  2. それぞれ、軽鎖または重ジメチル化で標識するためのサンプルに60 mMの8μL（4％）CH 2 O（37％重量/ V）または60 mMの（4％）13 CD 2 O（20％重量/体積）を追加。典型的には、試薬の4μLは、ペプチドの25μgの（ステップ4.2、4.3、4.6）ごとに添加されます。
  3. それぞれ、軽鎖または重ジメチル化で標識された試料に24ミリモルのNaBH 3 CNまたは24 mMのNaBD 3 CNの8μLを加えます。
  4. ボルテックスし、室温で約10分間、チューブシェーカーで振ります。
  5. 5分間、1％のアンモニア（〜28から30パーセントのV / V）の16μLを添加することにより反応をクエンチしました。典型的には、試薬の8μL、ペプチド25μgのあたりに添加されます。
  6. 5％FA（98％v / v）での8μLを添加することにより反応混合物を再酸性化。
  7. 6個のサンプルの合計を生成するために、軽鎖および重ジメチルペプチド（ 図1）を結合します。 表1を参照してください。 サンプルのタグ付けとプールの説明については、この研究のために使用されます。
  8. ステップ3.2及び3.3に従ってサンプル脱塩を行います。

5.同重体タギング（リジン残基）

  1. トリエチルアンモニウム重炭酸塩（TEAB）緩衝液（pH約8.5）を100mMにジメチル化ペプチド100μgの（を1μg/μL）を再構成します。
  2. 製造業者のプロトコルに記載の同重体試薬を調製し（ 材料/試薬の表を参照のこと）。
  3. ペプチドおよび〜10秒間ボルテックスに可溶化されたアイソバリック試薬（41μL）を追加します。約1時間のマイクロ遠心チューブシェーカー上でサンプルを振ります。 8μLヒドロキシルアミン（w / vの10％）で反応をクエンチし、室温で15分間、サンプルをインキュベートします。
  4. さらに使用するまで-80℃でプール単一の混合物に6つの標識された試料と（ステップ3.1-3.3）を脱塩またはストア。
    注：プロテオームカバレッジ及び深さを向上させるために、多次元分離戦略が提案されています以下のような強カチオン交換（SCX）。

6.強カチオン交換

  1. 製造業者のプロトコルに従ってSCXを行う（ 材料表を参照）。
    1. ギ酸アンモニウム溶液の約1ミリリットル（20ミリメートル、40ミリメートル、60ミリメートル、80ミリメートル、100ミリメートル、150ミリメートル、250ミリメートル、および500 mM）の10％アセトニトリル（ACN）、0.1％FA（PH 3）とを準備します。
    2. ピペットチップの上部から赤色キャップを取り外し、梱包材料がピペットチップの底部に向かっていることを確実にするためにスラリーを充填してピペットチップをタップ。
      注：重要：プロトコルの最後までピペットチップを捨てないでください。
    3. マイクロ遠心チューブ（2 mL）中の上部に遠心アダプタを配置し、内部ピペットチップを固定します。
    4. ピペットチップにSCXの再構成緩衝液の150μLを追加します。
    5. 室温（4,000 XG）で6分間、ピペットチップを遠心。このステップをさらに2回繰り返し、廃棄物を捨てます。
    6. Pを溶かしますSCXの再構成緩衝液の150μLでeptides。 pHが3であることを確認してください。
    7. ピペットチップ、遠心分離機（6.1.5を参照）にペプチドを追加し、溶離液を保持します。
    8. 新しいマイクロ遠心チューブ（2 mL）中にフィルタやピペットを転送し、20mMギ酸アンモニウム溶液の150μLを加えます。室温（4,000 XG）で6分間遠心分離し、溶出液を保ちます。
    9. 繰り返しステップ6.1.8さらに7回、ギ酸アンモニウムの連続濃度（ すなわち、40ミリメートル、60ミリメートル、80ミリメートル、100ミリメートル、150ミリメートル、250 mMの500 mm）を使用。
  2. マイクロ遠心チューブ（1.5 mL）を8つのSCX画分を移し、遠心蒸発を使用してそれらを濃縮する（ステップ3.3参照）。

7.液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS / MS）及びMS 3

  1. 0.1％FA、フィルターで質量分析グレードの水でペプチドを再構成し、オートサンプラーバイアルに入れます。 follとしてフィルターペプチドOWS：
    1. （ 材料表を参照） を 0.65μmのフィルターを含むマイクロ遠心チューブに再構成されたペプチドを加えます。
    2. 1分間12,000×gで遠心分離したペプチド。 、フィルターを取り外し廃棄し、そしてオートサンプラーバイアルに濾過ペプチドを追加します。
  2. 次のように移動相緩衝液を調製する：3％、0.1％FA（A）と（v / v）のACNから100％ACNと0.1％FA（B）と。
  3. C 18材料（5μM、200オングストロームの細孔サイズ）で2 cmの充填トラップカラム上に各SCX画分試料の6μLを注入します。
    注：次のようにトラップで洗浄サンプル：3分、0％B。 2次元液体クロマトグラフィーシステムを使用して、3μL/分（ 材料表を参照）。
  4. 分析分離方法を実行します。 C 18材料を充填した75μmのID X 13.2センチメートルレーザプルチップ溶融シリカ毛管カラム（5μM、100オングストローム）を使用します。勾配がある：0~5分、10％B。 5~40分、10~15％B。 40~90分で15~25％のB; 90から115分、25-30％B。 115-130分30〜60％のB。 130-135分、60~80％B。 135-145分、80％のB、145-150分、80から10パーセントのB。 150-180分、10％B。 300 NL /分、180分。
  5. 分析分離法が実行されている間、質量分析計のためのデータ収集を実行します。
    注：次のようにMSサーベイスキャンのパラメータは、400-1,600 のm / z、60,000解像度、自動利得制御（AGC）1×10 6イオン、最大注入時間500ミリ秒を標的とします。次のようにCID-MS / MSのためのパラメータは、次のとおりトップ1-7又はトップ8-14データ依存取得（DDA）3 のm / zの分離幅、500最小信号、35％の正規化衝突エネルギー（NCE）、0.25起動Q 、10ミリ秒の起動時間、3×10 4 AGC、50ミリ秒の最大注入時間。次のようにHCD-MS 3のパラメータは、次のとおり200最小信号4 のm / z分離幅、60％NCE、0.1起動時間、3×10 5 AGC、250ミリ秒IT、300-1,300 のm / z MS / MS選択範囲、非断片化された親イオンを除外する。
  6. は、トップ1-7とトップ8-14の実行の両方に重複して各解析を実行します。
    注：サンプルはオービトラップ又はtribrid質量分析計を含む器具の新しいモデル上で実行するため、DDAパラメータが変化し、より多くのMS / MS及びMS 3スキャンを含むように最適化することができます。また、tribrid器具ため、同期前駆選択（SPS）は、3を使用しなければならない-MS。

8.データ分析16

  1. 例えば、マウスUNIPROTなど適切なデータベース、に対して、タンパク質解析ソフトウェアを使用してRAWファイルを検索します。
    注：これは、軽および重ジメチル化ペプチドを探索するために、各RAWファイル用の2つのワークフローを作成することが重要です。
  2. 以下のパラメータを用いてRAWファイルを検索2つの逃し切断、ペプチドの質量範囲300-6,000 DA、15ppmの親質量公差、1つのダフラグメンテーション公差とトリプシン。静的変更：光ジメチル化（28.031、ペプチドN末端）またはheavyジメチル化（36.076 DA、ペプチドN末端）、カルバミドメチル（57.021 DA、C）。
    注：時々重ジメチル化ピークは約7 DA（35.069 DA、ペプチドN末端）は、光ジメチルピークからなっているので、重ジメチル化ペプチドの探索ワークフローに組み込まれるべきです。動的変更：酸化（15.995 DA、M）、6重アイソバリックタグ（229.163 Daの、K）。アイソバリックタグのレポーターイオン強度を検索するための偽発見率（ 例えば 1〜5％）および定量ノードを生成するおとりデータベース検索を含めます。
  3. 統計
    1. タンパク質レポーターイオン値を正規化するために、電子スプレッドシートプログラムにデータをエクスポートします。各タンパク質について、それぞれ、内部標準の内部標準又は生レポーターイオン強度の中央値比によりメディアンレポーターイオン比または生レポーターイオン強度のいずれかを分割します。そのような電子スプレッドシートプログラム、ペールスとして適切な統計ソフトウェアを使用してくださいサンプル条件の間で有意な変化を決定するために、EUS、又はR。

結果

cPILOTは、N末端およびリジン残基のラベルペプチドを化学的にアミン系化学物質を使用し、サンプル多重化機能を強化します。 図2は、アルツハイマー病のマウスモデルおよび野生型対照からの脳、心臓、および肝臓組織の12プレックスcPILOT分析から得られた代表的なMSデータを示します。 表1に示されているように、アルツハイマー病および?...

ディスカッション

cPILOTは12個の以上のユニークなサンプルの同時測定が可能になります。ペプチドの両方のN末端及びリジン残基で成功したタグを確保するためには、反応の各セットのための正しいpHを有し、かつ第一のペプチド標識のためのジメチル化反応を行うことが不可欠です。 N末端での選択的ジメチル化は、（±0.2）〜2.5でpHを有することによって行われます。これは、リジンおよびN末端にアミノ基の...

開示事項

著者は何の競合する利害を持っていません。

謝辞

著者はRASRにピッツバーグ大学のスタート・アップ・ファンドおよびNIH、NIGMS R01の助成金（GM 117191から01）を認めます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Water - MS GradeFisher ScientificW6-44 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS GradeFisher ScientificA955-44 L quantity is not necessary
Acetic AcidJ.T. Baker9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
Ammonium formateAcros Organics208-753-9
Formic AcidFluka Analytical94318-250ML-F
BCA protein assay kitPierce Thermo Fisher Scientific23227
UreaBiorad161-0731
TrisBiorad161-0716
Dithiothreiotol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Iodoacetamide (IAM)Acros Organics144-48-9
L-CysteineSigma Aldrich, Chemistry168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreasSigma Aldrich, Life ScienceT1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2OSigma Aldrich, Life ScienceF8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13CSigma Aldrich, Chemistry596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%Sigma Aldrich156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CPSigma Aldrich, Chemistry190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kitProtea BioSciencesSP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) bufferSigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg)Thermo Fisher Scientific90061
Hydroxylamine hydrochlorideSigma Aldrich, Chemistry255580-100G
Standard vortex mixerFisher Scientific2215365any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridgesWaters186000383These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port modelSigma Aldrich57265A 12 port model is also sufficient
Speed-vacThermo ScientificSPD1010any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamberThermo Scientific2825/2826Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosamplerSciex-This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass SpectrometerThermo Scientific-This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
Analytical balanceMettler ToledoAL54
Stir plateVWR12365-382Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 bufferFisher Scientific06-664-261Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 bufferFisher Scientific06-664-260Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pkFisher Scientific05-408-129Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pkFisher Scientific04-408-120Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter unitsEMD MilliporeUFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 unitsThermo Scientific69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å)BrukerPM5/61100/000This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å)BrukerPM5/61200/000This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient

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