JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В сочетании предшественника изотопная маркировка и изобарической мечения (cPILOT) является количественной стратегией протеомики, что увеличивает возможности выборки мультиплексирования изобарических тегов. Этот протокол описывает применение cPILOT тканей от модели мыши болезни и дикого типа управления Альцгеймера.

Аннотация

Существует растущий спрос проанализировать многие биологические образцы для понимания болезни и обнаружения биомаркеров. Количественные стратегии протеомики, которые позволяют одновременное измерение нескольких образцов стало широко распространенным и значительно уменьшить экспериментальные затраты и время. В нашей лаборатории разработан метод, называемый комбинированным предшественником изотопная маркировкой и изобарической мечения (cPILOT), что повышает образец мультиплексирования традиционной маркировки изотопной или изобарических подходов мечения. Глобальный cPILOT может быть применен к образцам, происходящим из клеток, тканей, телесных жидкостей, или целых организмов и дает информацию о относительных содержаниях белка в различных условиях образца. cPILOT работает на 1) с использованием низких рН буферных условий для селективного dimethylate пептида N-концы и 2) с использованием высоких рН буфера условий для обозначения первичных аминов остатков лизина с коммерчески доступных реагентов изобарических (см Таблицу материалов / реагентов). СтепеньОбразец мультиплексирование доступно зависят от количества меток, используемых предшественников и изобарического реагента мечения. Здесь мы представляем 12-Plex анализа с использованием легкой и тяжелой Диметилирование в сочетании с шестью Plex изобарических реагентов для анализа 12 образцов из тканей мышей в одном анализе. Enhanced мультиплексирование полезно для снижения экспериментального времени и затрат, и что более важно, что позволяет проводить сравнения между многими условиями выборок (биологическими повторностями, стадией заболевания, медикаментозным лечением, генотипами или продольными временными точками) с менее экспериментальным уклоном и ошибками. В этой работе, глобальный cPILOT подход используются для анализа мозга, сердца и ткани печени через биологические повторы от модели мыши болезни и дикого типа управления Альцгеймер. Глобальный cPILOT может быть применен для изучения других биологических процессов, и выполненного с возможностью увеличения мультиплексирования образца до более чем 20 образцов.

Введение

Протеомика часто включает в себя анализ многих образцов, используемых для лучшего понимания болезненных процессов, кинетики ферментов, посттрансляционные модификации, реакция на стимулы окружающей среды, реакцию на терапевтические процедуры, обнаружение биомаркер или механизмы наркотиков. Количественные методы могут быть использованы для измерения относительных различий в уровне белка через образцы и может быть этикетками, свободными или включают изотопную метку (метаболический, химический или ферментативный). Устойчивые методы изотопного мечения выросли в популярности, поскольку они позволяют многие образцы, которые будут проанализированы одновременно и пригодны для образцов из различных клеток, тканей, телесных жидкостей, или целых организмов. Изотоп маркировка метода 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 увеличение пропускной способности , экспериментальнаяпри одновременном сокращении времени приобретения, стоимости и погрешности эксперимента. Эти методы используют спектры масс-предшественник для измерения относительного содержания белков из пептидных пиков. В противоположность этому , меченые реагенты изобарических 8, 9, 10 генерируют репортерные ионы, которые либо обнаружены в MS / MS или MS 3 11 спектры и эти пики используются , чтобы сообщить об относительном содержании белков.

Текущее состояние-оф-арт в мультиплексировании протеомики является либо 10-Plex 12 или 12-Plex изобарно анализа тега 13. Улучшенное мультиплексирование образца (т.е.> 10 образцов) было разработаны методы нашей лаборатории для тканей 14, 15, 16, 17, а также других для анализа клеток 18 SUP>, 19, 20, 21, тканей или целевых пептидов 22. Мы разработали усовершенствованный метод мультиплексирования, называемый в сочетании предшественника изотопное мечение с изобарической мечения (cPILOT). Глобальный cPILOT полезно для получения информации об относительных концентрациях всех белков в различных условиях выборки (≥12) 14. На рисунке 1 показан общий технологический процесс cPILOT. Триптические или Lys-C пептиды селективно помечены на N-конце с использованием Диметилирование низкого рН 2 и в остатках лизина с 6-Plex реагентов с использованием высокого рН. Эта стратегия удваивает число выборок, которые могут быть проанализированы с изобарическими реагентами, которые помогают снизить затраты и экспериментальные кроме того, уменьшает экспериментальные шаги и время.

cPILOT гибок, как мы разработали другие методы для изучения окислительных посттрансляционных модусов, в том числе - модификации 3-нитротирозин-модифицированных белков 14 и цистеина , содержащих пептиды с S-нитрозилирования (oxcyscPILOT) 23. Мы также разработали аминокислоту селективный подход, цистеин cPILOT (cyscPILOT) 17. МС 3 с приобретением топ-иона 11 или селективного-у 1 -ионный метода 15 может помочь уменьшить репортер ионной интерференции и улучшить количественную точность cPILOT. Использование MS 3 в методе сбора требует высокого разрешения прибора с Orbitrap масс - анализатора , хотя низкое разрешение ионной ловушки инструменты могут также работать 24.

Ранее cPILOT был использован для изучения белков печени 16 из мышиной модели болезни Альцгеймера. Здесь мы опишем, как выполнить глобальный анализ cPILOT с помощью мозга, сердца и гомогенатах печени изучить роль peripheчень при болезни Альцгеймера. Этот эксперимент включает в себя биологическую репликацию. Из-за универсальности cPILOT, заинтересованные пользователи могут использовать технику для изучения других тканей для ряда биологических проблем и систем.

протокол

Этика заявление: Мыши были приобретены у независимой, некоммерческой биомедицинского исследовательского института и размещены в Отделе лабораторных животных ресурсов в Университете Питтсбурга. Все протоколы животных были утверждены уход и использование комитетом Институциональных животных путем в Университете Питтсбурга.

1. Белки Добыча и генерация пептидов для химико-мечения

  1. Извлечение белка из ткани, клеток или телесных жидкостей.
    1. Однородный 60-90 мг ткани (например , мозга, сердца и печени) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS 1x) 8 М мочевины (500 мкл) с использованием механического гомогенизатора. Протеаз или ингибиторы фосфатазы могут быть добавлены в буфер, если это необходимо. В этом проекте, они не были использованы. Используйте следующие параметры для гомогенизатора: лизировать бусинки матрицы, 4 м / с, 20 с. Сердце ткани может потребоваться до 9 циклов гомогенизации.
      Примечание: протеаз или ингибитор фосфатазы ы могут быть добавлены в буфер, если это необходимо. Они не были использованы в данном исследовании.
      1. Удалить гомогената ткань из лизирующей трубки и передач в микро-центрифужной пробирку. Промыть лизис трубки с 100-500 мкл PBS с 8 М мочевины, и объединить промывочный раствор с гомогената тканью.
    2. Центрифуга гомогенизированных тканей (9447 мкг, 4 ° С, 15 мин) и собирают супернатант.
  2. Определить концентрацию белка с помощью бицинхониновой кислоты (ВСА) анализа в соответствии с инструкциями изготовителя.
    Примечание: Дальнейшее разбавление буфера может быть необходимо, если концентрация белка слишком высока. Полученные концентрации для образцов из этих тканей были между 6-13 мкг / мкл.
    1. Дополнительно: Добавить стандарт внутреннего контроля качества (например , крупный рогатый скот альфа - казеин или другой экзогенный белок) со стандартом мкг в соотношении 1: 100 мкг образец белка.
jove_title "> 2. Пример Переваривание

  1. Добавьте 100 мкг (100 × 10 -6 г) белка из каждого образца индивидуально помечены микро-центрифужные пробирки. Объем зависит от концентрации белка (см шаг 1.2).
  2. Добавить дитиотреитолу (DTT) (40: 1 реагент к образцу мол соотношения) к каждому образцу. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 ч. Расчет для молярного соотношения базируются белковой масса бычьего сывороточного альбумина (BSA), который составляет 66,5 · 10 3 г / моль.
  3. Добавить иодацетамид (IAM) (80: 1 реагент к образцу мол соотношения) к каждому образцу. Выдержите на льду в темноте в течение 2 ч. Эту реакцию проводили на льду в течение 2 ч, чтобы избежать побочных реакций.
  4. Добавить L-цистеин (40: 1 реагент к образцу мол соотношения) к каждому образцу. Инкубирую при комнатной температуре в течение 30 мин.
  5. Добавьте 20 мМ трис - буфера с 10 мМ CaCl 2 (рН 8,2) для разбавления мочевины до конечной концентрации 2 М.
  6. Добавить Л-1-tosylamido-2 фенилэтила хлорметилкетона (ТРСК) -обработанной трипсин (50: 1 субстрат фермента мол соотношение) к каждому образцу и инкубировать при 37 ° С в течение 24 ч.
  7. Гасят переваривания белков путем флэш-замораживание образца в жидком азоте и хранят при -80 ° С до дальнейшей обработки.

3. Образец обессоливания

  1. Повторно подкислить образцы добавления муравьиной кислоты (FA). Добавьте достаточно FA для получения конечной концентрации 0,1%. Если образцы первоначально при температуре -80 ° С, оттаивают на льду образцы перед повторным подкисления.
  2. Де-солевой пептиды с использованием С 18 гидрофильно - липофильный сбалансированный (HLB) 10 мг картриджей , как описано выше 16.
  3. Сухие образцы от вакуумного центрифугирования (5 мм рт.ст., 45 & deg; С, 77 мкг) до объема ~ 10 мкл.

4. Диметилирование Этикетировочное (N-концы)

  1. Развести пептиды в 1% -ной уксусной кислоте (0,25 мкг / мкл), растворенные в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или нано-чистой воды класса. Удаление 50 мкм; Г порцию на новую микро-центрифужную пробирку (1,5 мл) и хранить остаток при -80 ° С.
  2. Добавить 8 мкл 60 мМ (4%) CH 2 O (37% вес / объем) или 60 мМ (4%) 13 CD - 2 О (20% вес / об) к образцам для маркировки с легкой или тяжелой диметилирование, соответственно , , Как правило, 4 мкл реагента добавляют на 25 мкг пептидов (шаги 4.2, 4.3, 4.6).
  3. Добавить 8 мкл 24 мМ NaBH 3 CN или 24 мМ NaBD 3 CN к образцам , меченных легкой или тяжелой диметилирование, соответственно.
  4. Вихревые и встряхивают на шейкере пробирки в течение ~ 10 мин при комнатной температуре.
  5. Гасят реакции путем добавления 16 мкл 1% аммиака (~ 28-30% об / об) в течение 5 мин. Как правило, 8 мкл реагента добавляют на 25 мкг пептидов.
  6. Повторно подкислить реакционных смесей путем добавления 8 мкл 5% FA (98% об / об).
  7. Смешайте легкие и тяжелые диметилированные пептиды (Рисунок 1) , чтобы генерировать в общей сложности шести образцов. Смотрите таблицу 1 для описания образца мечения и объединения, используемого для данного исследования.
  8. Выполните образец обессоливания в соответствии с шагами 3.2 и 3.3.

5. Изобарная Пометка (остатки Lys)

  1. Развести 100 мкг диметилированный пептидов (1 мкг / мкл) в 100 мМ три-этил бикарбоната аммония (TEAB) буфера (рН ~ 8,5).
  2. Подготовка изобарные реагентов , как указано в протоколе изготовителя (см Таблицу материалов / реагентов).
  3. Добавить растворенные изобарических реагенты (41 мкл) в пептидов и вихря в течение ~ 10 с. Взболтать образцы на шейкере трубки микро-центрифуге в течение ~ 1 ч. Гасят реакции с гидроксиламином 8 мкл (10% вес / объем) и инкубируют образцы в течение 15 мин при комнатной температуре.
  4. Бассейн шесть меченых проб в одну смесь и обессоливания (шаги 3.1-3.3) или хранить при -80 ° С до дальнейшего использования.
    Примечание: Для улучшения покрытия протеома и глубины, стратегия многомерное разделения предлагаютсятакие как сильный катионит (SCX).

6. Сильный катионит

  1. Выполните SCX в соответствии с протоколом производителя (см Материалы таблицу).
    1. Подготовьте ~ 1 мл формиата аммония растворов (20 мМ, 40 мМ, 60 мМ, 80 мМ, 100 мМ, 150 мМ, 250 мМ, и 500 мМ) с 10% ацетонитрила (ACN), 0,1% FA (рН 3).
    2. Удалите красную крышку с верхней частью наконечника пипетки и нажмите наконечник пипетки с упаковкой суспензии, чтобы гарантировать, что упаковочный материал в нижней части наконечника пипетки.
      Примечание: Критический: Не выбрасывайте кончик пипетки до конца протокола.
    3. Поместите адаптер центрифуг на верхней части микро-центрифужную пробирку (2 мл) и закрепить наконечник пипетки внутри.
    4. Добавить 150 мкл SCX восстанавливающего буфера для пипеток.
    5. Центрифуга пипеток в течение 6 мин при комнатной температуре (4000 XG). Повторите этот шаг еще два раза и выбросить отходы.
    6. Растворите рeptides в 150 мкл буфера SCX восстанавливающей. Убедитесь, что значение рН равно 3.
    7. Добавить пептиды в пипетки, центрифуга (см 6.1.5), и держать элюент.
    8. Перенести фильтр и пипетку на новую микро-центрифужную пробирку (2 мл) и добавляют 150 мкл 20 мМ раствора формиата аммония. Центрифуга в течение 6 мин при комнатной температуре (4000 XG) и держать элюент.
    9. Повторите шаг 6.1.8 дополнительные семь раз, с использованием последовательных концентраций (т.е. 40 мМ, 60 мМ, 80 мМ, 100 мМ, 150 мМ, 250 мМ и 500 мМ) формиата аммония.
  2. Передача восемь SCX фракций в микро-центрифужные пробирки (1,5 мл) и концентрируют их с помощью центробежного испарения (см шаг 3.3).

7. жидкостная хроматография-тандемной масс - спектрометрии (ЖХ-МС / МС) и МС 3

  1. Развести пептидов в масс-спектрометрического сорта воды с 0,1% FA, фильтруют и помещают в ампулу автоматического пробоотборника. Фильтр пептиды как ФолляРМО:
    1. Добавить восстановленные пептиды в микро-центрифужную пробирку , содержащую фильтр 0,65 мкм (см Материалы таблицу).
    2. Центрифуга пептиды при 12000 мкг в течение 1 мин. Удалить фильтр, удалите и добавьте отфильтрованные пептиды в ампулу автоматического пробоотборника.
  2. Подготовьте буфера подвижной фазы следующим образом: 3% (об / об) ACN с 0,1% FA (A) и 100% ACN с 0,1% FA (B).
  3. Вводят 6 мкл каждой фракции SCX образца на колонку , заполненную ловушку до 2 см с С 18 материала (5 мкм, 200 размер пор).
    Примечание: очистка образца на ловушку выглядит следующим образом: 3 мин, 0% В; 3 мкл / мин с использованием 2D - системы жидкостной хроматографии (см Материалы таблицу).
  4. Выполнить метод аналитического разделения. Используйте 75 мкм ID х 13,2 см лазерного наконечника растянутой плавленого кварца капиллярную колонку , заполненную С 18 материал (5 мкм, 100 А). Градиент: 0-5 мин, 10% В; 5-40 мин, 10-15% В; 40-90 мин, 15-25% В; 90-115 мин, 25-30% В; 115-130 мин, 30-60% В; 130-135 мин, 60-80% В; 135-145 мин, 80% В, 145-150 мин, 80-10% В; 150-180 мин, 10% В; 300 нл / мин, 180 мин.
  5. Запуск сбора данных для масс-спектрометра в то время как метод аналитического разделения работает.
    Примечание: Параметры для обследования сканирования MS заключаются в следующем: 400-1,600 м / г, разрешение 60000, автоматическую регулировку усиления (АРУ) цель 1 × 10 6 ионы, максимальное время впрыска 500 мс. Параметры для ИДС-MS / MS заключаются в следующем: Лучшие 1-7 или 8-14 Топ данных зависит приобретение (ДВР), 3 м / з ширины изоляции, 500 минимальный сигнал, 35% энергии нормализуется столкновений (НКЭ), 0,25 кв активации , 10 мс время активации, 3 × 10 4 АРУ, 50 мс максимальное время впрыска. Параметры для HCD-MS 3 следующим образом : 200 минимальный сигнал, м / г ширина 4 изоляция, 60% NCE, время активации 0,1, 3 × 10 5 АРУ, 250 мс IT, 300-1,300 м / з диапазон выбора МС / МС , исключить не-фрагментарный родительский ион.
    6. Выполнить каждый анализ в двух экземплярах как для верхней 1-7 и верхней 8-14 пробегов.
    Примечание: Для получения образцов работать на более новую модель документа , содержащего Orbitrap или tribrid масс - спектрометр, параметры DDA будет изменяться и могут быть оптимизированы , чтобы включать больше MS / MS и MS 3 сканирования. Кроме того, для tribrid инструментов, выбор синхронного предшественника (СПС) 3 - МС должны быть использованы.

8. Анализ данных 16

  1. Поиск файлов RAW с помощью программного обеспечения для анализа белка с соответствующей базой данных, таких как мыши UniProt.
    Примечание: Важно, чтобы создать два рабочие процесс для каждого файла RAW, чтобы искать для легких и тяжелых диметилированных пептидов.
  2. Поиск файлов RAW, используя следующие параметры: трипсином с двумя пропущенных расщеплений, диапазон масс пептида 300-6,000 Da, 15 частей на миллион масс материнской толерантности, 1 Da толерантности фрагментации. Статические модификации: светло-диметилирование (28,031, пептид, N-конец) или чтяжела ое диметилирование (36,076 Да, пептид, N-конец), carbamidomethyl (57,021 Да, С).
    Примечание: Иногда тяжелый диметилированный пик ~-Да (35,069 Да, пептид, N-конец) составляет от света диметилированного пика, и, таким образом, должны быть включено в рабочий процесс поиска для тяжелых диметилированных пептидов. Динамические модификации: окисление (15,995 Da, М), 6-Plex изобарно тег (229,163 Да, К). Включите манок поиск в базе данных с получением ложных скорости обнаружения (например , 1 и 5%) и узел для поиска количественного для ионных интенсивностей репортер изобарических тегов.
  3. Статистика
    1. Экспорт данных в электронную программу электронных таблиц для того, чтобы нормализовать значения ионных белка репортер. Для каждого белка, либо разделить медианные соотношения ионов репортера или интенсивности ионов сырья репортера медианного отношением внутреннего стандарта или сырых интенсивности ионов репортера внутреннего стандарта, соответственно. Используйте соответствующее статистическое программное обеспечение, такие как программы электронной таблицы, PersEUS, или R, чтобы определить существенные изменения среди образцов условий.

Результаты

cPILOT использует химию на основе амина химически пептиды ярлыка на N-конце и остатках лизина и улучшает возможности выборки мультиплексирования. Рисунок 2 показывает репрезентативных данных MS , который получают из 12-Plex анализа cPILOT головного мозга, сердца, печен...

Обсуждение

cPILOT позволяет одновременное измерение более чем 12 уникальных образцов. Для того, чтобы обеспечить успешное мечение как на N-концевых остатки лизина и пептиды, крайне важно, чтобы иметь правильный рН для каждого набора реакций и проводить реакцию Диметилирования сначала для пептиднога ...

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующие интересы.

Благодарности

Авторы признают, Университет Питтсбурга запуска средства и NIH, грант NIGMS R01 (GM 117191-01) в RASR.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Water - MS GradeFisher ScientificW6-44 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS GradeFisher ScientificA955-44 L quantity is not necessary
Acetic AcidJ.T. Baker9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
Ammonium formateAcros Organics208-753-9
Formic AcidFluka Analytical94318-250ML-F
BCA protein assay kitPierce Thermo Fisher Scientific23227
UreaBiorad161-0731
TrisBiorad161-0716
Dithiothreiotol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Iodoacetamide (IAM)Acros Organics144-48-9
L-CysteineSigma Aldrich, Chemistry168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreasSigma Aldrich, Life ScienceT1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2OSigma Aldrich, Life ScienceF8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13CSigma Aldrich, Chemistry596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%Sigma Aldrich156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CPSigma Aldrich, Chemistry190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kitProtea BioSciencesSP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) bufferSigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg)Thermo Fisher Scientific90061
Hydroxylamine hydrochlorideSigma Aldrich, Chemistry255580-100G
Standard vortex mixerFisher Scientific2215365any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridgesWaters186000383These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port modelSigma Aldrich57265A 12 port model is also sufficient
Speed-vacThermo ScientificSPD1010any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamberThermo Scientific2825/2826Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosamplerSciex-This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass SpectrometerThermo Scientific-This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
Analytical balanceMettler ToledoAL54
Stir plateVWR12365-382Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 bufferFisher Scientific06-664-261Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 bufferFisher Scientific06-664-260Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pkFisher Scientific05-408-129Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pkFisher Scientific04-408-120Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter unitsEMD MilliporeUFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 unitsThermo Scientific69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å)BrukerPM5/61100/000This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å)BrukerPM5/61200/000This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient

Ссылки

  1. Ong, S. -. E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. &. #. 2. 1. 6. ;., de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
  3. Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, . From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , (1998).
  4. Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
  5. Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
  6. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
  7. Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
  8. Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  9. Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  10. Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
  11. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
  12. McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  13. Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
  14. Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
  15. Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
  16. Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
  17. Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
  18. Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
  19. Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
  20. Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
  21. Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
  22. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  23. Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
  24. Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
  25. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  26. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

123cPILOT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены