JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kombine ön-madde izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) izobarik etiketlerin örnek çoğullama kabiliyetini arttıran bir sayısal proteomik stratejisidir. Bu protokol bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden dokulara cPILOT uygulanmasını tarif etmektedir.

Özet

Hastalık anlayış ve biyomarker keşfi için birçok biyolojik numunelerin analiz etmek giderek artan bir talep vardır. Birden numunelerin eş zamanlı ölçümü yaygın hale gelir ve büyük ölçüde deneysel maliyetleri ve sürelerini azaltmak gelmiş izin kantitatif proteomik stratejileri. Laboratuvarımız geleneksel izotopik etiketleme veya İzobarik etiketleme yaklaşımların örneği çoklama artırır izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) kombine habercisi olarak adlandırılan bir teknik geliştirdi. Küresel cPILOT hücreler, dokular, vücut sıvıları veya bütün organizmalardan gelen örnekleri uygulanmış ve farklı örnek koşullar arasında görece protein bolluk hakkında bilgi verir edilebilir. cPILOT düşük pH'li bir tampon koşulları kullanılarak: 1) ile çalışır seçici dimethylate peptit, N-terminali ve 2)) Malzemeler / Reaktifler bakınız Tablo (ticari olarak temin edilebilen izobarik reaktifler ile lizin kalıntılarının birincil aminler etiket için yüksek pH tampon koşulları kullanılmasına ilişkindir. derecesiMevcut örnek çoğullama kullanılan ön-madde etiket sayısı ve izobarik etiketleme reaktifi bağlıdır. Burada, tek bir analizde fare dokularından 12 örnekleri analiz etmek için, altı-karmaşık izobarik reaktifler ile birleştirilmiş hafif ve ağır dimetilasyon kullanarak 12-karmaşık analizini. Geliştirilmiş çoğullama az deneysel önyargı yanılma ile, daha da önemlisi, deneysel zaman ve maliyet ve azaltarak birçok örnek koşullarına (biyolojik çoğaltır, hastalık evresi, ilaç tedavileri, genotipi veya boyuna zaman noktalarında) arasında karşılaştırma izin verdiği için yararlıdır. Bu çalışmada, küresel cPILOT yaklaşım Alzheimer hastalığı fare modeli ve sokak türü kontrollerden beyin, kalp, ve biyolojik çoğaltır genelinde karaciğer dokuları analiz etmek için kullanılır. Küresel cPILOT diğer biyolojik süreçleri incelemek için uygulanan ve 20'den daha fazla numune numune çoğullama artırmak için adapte edilebilir.

Giriş

Proteomiks genellikle daha iyi hastalık süreçlerini anlamak için kullanılan pek çok numune, enzim kinetiği, post-translasyonel modifikasyonlar, çevresel uyarılara yanıt ve terapötik tedaviler, belirleyici keşif ya da ilaç mekanizmalarına müdahale analizini içerir. Nicel yöntemler örnekleri üzerinden protein seviyelerinde göreli farklarını ölçmek için ve etiketsiz olabilir ya da izotopik etiketleme (metabolik, kimyasal ya da enzimatik) içeren kullanılabilecektir. pek çok örnekler eş zamanlı olarak analiz edilmesine izin verir ve farklı hücreler, dokular, vücut sıvıları veya bütün organizmalardaki örnekler için uygundur, çünkü kararlı izotop etiketleme yöntemleri popülaritesi büyüdü. İzotop etiketleme yöntemleri, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 artış deneysel verim,edinme zamanı, maliyetleri ve deneysel hatayı azaltırken. Bu yöntemler, peptid tepelerinden proteinlerin nispi bolluklarını ölçmek için ön-madde kütle spektrumları kullanın. Bunun aksine, izobarik etiketleme ayıraçları 8, 9, 10 ya da MS / MS veya MS tespit edilir raportör iyonları üreten 3 11 spektrumları ve bu tepe proteinlerin nispi bolluk rapor etmek için kullanılır.

Proteomik çoklama mevcut state-of-the-art 12 10-karmaşık veya 12-karmaşık izobarik etiket analizi 13 ya da bir. Geliştirilmiş örnek çoklayıcı (yani> 10 numune) yöntemleri hücrelerde 18 analizi için başkaları tarafından dokular 14, 15, 16, 17 için laboratuarda geliştirilmiş ve edilmiştir sup>, 19, 20, 21, ya da hedef peptidleri 22 dokular. Biz İsobarik etiketleme (cPILOT) ile kombine öncü izotopik etiketleme denilen gelişmiş bir çoğullama teknik geliştirdi. Küresel cPILOT farklı örnek koşullarında (≥12) 14 üzerindeki tüm proteinlerin nispi konsantrasyonları hakkında bilgi almak için kullanılır. Şekil 1, genel bir cPILOT akışını gösterir. Triptik veya Lys-C peptidler seçici düşük pH 2 ile dimetilasyon N-terminalinde ve yüksek pH değeri 6-karmaşık reaktifler ile lizin kalıntılarında etiketlenir. Bu strateji, deney maliyetleri ve ek azaltmaya yardımcı olur izobarik reaktifler ile analiz edilebilir numune sayısını iki katına, deneysel adımlar ve zamanı azaltır.

oksidatif post-translasyonel modi incelemek için başka yöntemler geliştirdik olarak cPILOT esnektir3-nitrotirosin modifiye edilmiş proteinler 14 ve S-nitrozilasyonuyla (oxcyscPILOT) 23 sistein içeren peptidlerin dahil fications. Ayrıca, bir amino asit, seçici bir yaklaşım, sistein cPILOT (cyscPILOT) 17 geliştirdik. Bir üst iyon 11 veya seçici-y 1 -iyon yöntemi 15 MS 3 alıcı raportör iyon girişimi azaltmak ve cPILOT kantitatif hassaslığını arttırabilir. Düşük çözünürlüklü iyon kapanı araçları da 24 ile de çalışabilir elde etme yönteminde MS 3'ün kullanımı, Orbitrap kütle analizörü ile bir yüksek çözünürlüklü bir cihaz gerektirir.

Daha önce, cPILOT bir Alzheimer hastalığı fare modelinde karaciğer proteinleri 16 çalışma için kullanılmıştır. Burada, periphe rolünü incelemek için beyin, kalp ve karaciğer homojenatlan kullanılarak küresel cPILOT analizi gerçekleştirmek için nasıl tarifAlzheimer hastalığında ry. Bu deney biyolojik çoğaltma içermektedir. Çünkü cPILOT çok yönlülüğü, ilgilenen kullanıcılar biyolojik sorunlar ve sistemlerin bir dizi diğer dokuları incelemek için tekniği kullanabilirsiniz.

Protokol

Etik Beyanı: Fareler bağımsız, kar amacı gütmeyen biyomedikal araştırma kurumundan alınan ve Pittsburgh Üniversitesi Hayvan Kaynakları Laboratuarı Bölümü yerleştirildiler. Tüm hayvan protokolleri Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

Kimyasal etiketleme için 1. Protein Ekstraksiyonu ve Peptidlerin üretimi

  1. Doku hücreleri veya vücut sıvılarından protein ekstrakte edilir.
    1. Mekanik bir homojenleştirici kullanılarak 8 M üre (500 uL) ile fosfat tamponlu tuzlu su içinde doku (örneğin, beyin, kalp, karaciğer) (1 x PBS) 60-90 mg homojenleştirin. Gerekirse Proteaz veya fosfataz inhibitörleri tampona ilave edilebilir. Bu projede, onlar kullanılmamıştır. homojenleştirici için aşağıdaki parametreler kullanın: matrisi boncuklar, 4 m / s, 20 s lize. Kalp doku homojenizasyon kadar 9 döngüleri gerektirebilir.
      Not: Proteaz veya fosfataz inhibitörü gerekli olduğu takdirde tampon ilave edilebilir. Onlar bu çalışmada kullanılmamıştır.
      1. yokedici tüpten, doku homojenatının çıkarın ve bir mikro-santrifüj tüpüne aktarılır. 8 M üre ile PBS 100-500 uL tüpler lize durulayın ve doku homojenatı ile durulama çözeltisi birleştirir.
    2. Homojenize doku santrifüj (9447 x g, 4 ° C, 15 dakika) ve süpernatan toplamak.
  2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir bisinkoninik asit (BCA) deneyi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
    Not: protein konsantrasyonu çok yüksek ise, tamponla daha fazla seyreltmek gerekli olabilir. bu dokulardan numuneler için elde edilen konsantrasyonları 6-13 ug / ml arasında idi.
    1. İsteğe bağlı: oran 1 ug standart bir iç kalite kontrol standart (örneğin sığır alfa kazein veya diğer dışsal protein) ekleyin: 100 ug protein örneği.
jove_title "> 2. Örnek Sindirim

  1. Her bir numunenin protein 100 ug (100 x 10 -6 g) ekleyin bireysel mikro santrifüj tüplerini etiketli. hacim, protein konsantrasyonuna bağlı olan (adım 1.2).
  2. Her bir örnek için (mol oranı örnek 1 reaktifi 40) ditiyotreitol (DTT) ilave edilir. 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Mol oranının hesaplanması 66.5 x 10 3 g / mol, sığır serum albümin protein kütlesinin (BSA), kapalı dayanır.
  3. Her bir örnek için (mol oranı örnek 1 ayıracı 80) iodoasetamid (IAM) ekleyin. 2 saat boyunca karanlıkta buz üzerinde inkübe edin. Bu reaksiyon, yan reaksiyonları önlemek için 2 saat buz üzerinde gerçekleştirilir.
  4. Her bir örnek için (mol oranı örnek 1 reaktifi 40), L-sistein ekleyin. 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir.
  5. 2 M bir son konsantrasyona kadar üre seyreltmek için 10 mM CaCl2 (pH 8.2) ile 20 mM Tris tamponu ekleyin
  6. Ekle L-1-tosilamido-2-feniletil klorometil keton (TPCK) tripsin ile tedavi edilen (50: 1 alt-tabaka her bir numuneye) mol oranı, enzim ve 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilmiştir.
  7. Flaş dondurma daha sonra işlenene kadar -80 ° C'de sıvı azot ve mağaza örnek tarafından protein sindirimini sönümlenir.

3. Örnek tuz giderme

  1. formik asit (FA) eklenerek örnekleri yeniden asitleştirin. % 0.1 bir son konsantrasyon elde etmek için yeterli FA ekleyin. Numuneler -80 ° C'de ilk olarak ise, yeniden asitleştirildi numunelerin buz üzerine çözülme.
  2. De-tuzu olarak daha önce dengeli C18 hidrofilik lipofilik (HLB) 10 mg kartuşları kullanılarak peptidler 16 tarif.
  3. ~ 10 uL hacme kadar vakum santrifüj (5 Torr, 45 ° C, 77 x g) örnekleri kurutun.

4. dimetilasyon Etiketleme (N-uçlarında)

  1. yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ya da nano saf derece su içinde çözülmüş% 1 asetik asit içinde peptidleri (0.25 ug / ml) ile sulandırın. 50 ^ ı kaldırınG yeni bir mikro santrifüj tüpüne (1.5 mL) bölümü ve -80 ° C 'de kalan saklayın.
  2. 8 60 mM (% 4) CH uL 2 O (% 37 ağırlık / hacim) ya da 60 mM (% 4) 13 CD 2 O (% 20 ağırlık / hacim) hafif ya da ağır dimetilasyon ile etiketlenmesi için numunelere sırasıyla ekleme . Tipik olarak, reaktif 4 uL peptidlerin 25 ug (Adım 4.2, 4.3, 4.6) ilave edilir.
  3. Sırasıyla hafif ve ağır dimetilasyon, etiketli örnekler, 24 mM NaBH3 CN ya da 24 mM NaBD 3 CN 8 uL ekleyin.
  4. Vorteks ve oda sıcaklığında ~ 10 dakika boyunca bir tüp çalkalayıcıda sallayın.
  5. 5 dakika için,% 1 amonyak (~% 28-30 h / h), 16 uL ilave reaksiyonları söndürüldü. Tipik olarak, reaktif 8 uL peptidlerin 25 ug ilave edilir.
  6. Yeniden asitleştirmek% 5 FA 8 uL eklenmesiyle reaksiyon karışımları (98% v / v).
  7. Altı numune toplam üretmek için hafif ve ağır dimetile peptidler (Şekil 1) birleştirin. Tablo 1 Bkz Bu çalışma için kullanılan örnek etiketleme ve havuzu bir açıklaması.
  8. adım 3.2 ve 3.3 uygun numune tuz giderme gerçekleştirin.

5. Isobaric Etiketleme (Lys kalıntıları)

  1. tri-etil amonyum bikarbonat (TEAB) tamponu (pH-8.5), 100 mM dimetile peptitlerin 100 ug (1 ug / ml) ile sulandırın.
  2. Imalatçının protokolünde belirtildiği gibi izobarik reaktifler hazırlayın (Malzeme / Reaktiflerin Tablo bakınız).
  3. ~ 10 s için peptidler ve vorteks çözündürülmüş izobarik reaktifler (41 uL) ilave edilir. Yaklaşık 1 saat boyunca bir mikro santrifüj tüpü çalkalayıcı üzerinde örnekleri çalkalayın. 8 uL hidroksilamin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca numune inkübe (ağırlık / hacim,% 10) ile olan reaksiyonları söndürün.
  4. bir sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de tek bir karışım ve tuzunun giderilmesi (Adım 3.1-3.3) veya deposuna altı etiketli örnekleri havuz.
    NOT: proteom kapsamını ve derinliğini artırmak için, çok boyutlu bir ayırma stratejisi önerilirgibi kuvvetli katyon değiştirme (SCX).

6. güçlü katyon alışveriş

  1. Üreticinin protokolü doğrultusunda SCX gerçekleştirin (Malzeme Tablo).
    1. amonyum format çözeltilerinin ~ 1 mL (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, ve 500 mM),% 10 asetonitril (ACN),% 0.1 FA (pH 3) ile hazırlanır.
    2. pipet üstünden kırmızı kapağını çıkarın ve ambalaj malzemesi pipet alt kısmına doğru olduğundan emin olmak için bulamaç ambalaj pipet dokunun.
      NOT: Kritik: protokolün sonuna kadar pipet kenara atma.
    3. bir mikro santrifüj tüpüne (2 mL) üst kısmına santrifüj adaptörünü ve iç pipet sabitleyin.
    4. pipet uçlarına SCX sulandırma tamponu 150 mcL ekleyin.
    5. Oda sıcaklığında (4,000 xg) 6 dakika pipet uçları santrifüjleyin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın ve atık atın.
    6. p çözündürülürSCX sulandırma 150 uL tampon içinde peptidlerin. pH değeri 3 olduğundan emin olun.
    7. pipet uçları, santrifüj (6.1.5 bakınız) peptidleri ekleyin ve eluent tutun.
    8. yeni bir mikro santrifüj tüpüne (2 mL) filtre ve pipet aktarın ve 20 mM amonyum format çözeltisinin 150 uL ekleyin. Oda sıcaklığında (4,000 xg) 6 dakika boyunca santrifüj ve eluent tutun.
    9. Adımı tekrar 6.1.8 ek yedi kez, amonyum format ardışık konsantrasyonlarda (yani, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM ve 500 mM) kullanılarak.
  2. mikro santrifüj tüplerine (1.5 ml) sekiz SCX fraksiyonlar aktarın ve santrifüj buharlaştırma kullanarak bunları konsantre (adım 3.3).

7. Sıvı Kromatografi-Tandem Kütle Spektrometresi (LC-MS / MS) ve MS3

  1. % 0.1 FA, filtre ile kütle spektrometresi dereceli su peptitleri sulandırın ve bir otomatik numune şişesine koyun. foll olarak filtre peptidlerakımlarının:
    1. 0.65 um bir filtre ihtiva eden bir mikro santrifüj tüpüne yeniden peptidleri ekleyin (Malzeme Tablo).
    2. 1 dakika için 12,000 x g'de santrifüjleyin peptidler. Filtreyi çıkarın atmak ve bir oto-numune şişesine süzülür peptidler ekleyin.
  2. aşağıdaki mobil faz olarak tamponlar hazırlayın:% 3,% 0.1 FA (A) (v / v) ACN ve% 100 ACN% 0.1 FA (B).
  3. C18 malzeme (5 um, 200 A gözenek boyutu) ile 2 cm paketlenmiş tuzak kolonuna her SCX fraksiyon numunenin 6 uL enjekte edilir.
    Not: aşağıdaki gibi tuzak örnek bir temizlik: 3 dak,% 0 B; 2B, sıvı kromatografi sistemi kullanılarak 3 uL / dakika (Malzeme Tablo).
  4. analitik ayırma yöntemi çalıştırın. Cı-18 malzeme ile dolu, bir 75 um id x 13.2 cm lazer çekilmiş ucu eritilmiş silis kılcal kolonu (5 um, 100 A) kullanın. gradyanı: 0-5 dakika,% 10 B; 5-40 dakika,% 10-15 B; 40-90 dakika, 15-25% B; 90-115 dakika, 25-% 30 B; 115-130 dak, 30-60% B; 130-135 dak, 60-80% B; 135-145 dakika,% 80 B, 145-150 dak, 80-10% B; 150-180 dakika,% 10 B; 300 nL / dakika, 180 dakika.
  5. Analitik ayırma yöntemi çalışırken kütle spektrometresi için veri toplama çalıştırın.
    Not: 400-1,600 m / z, 60.000 çözünürlük, otomatik kazanç kontrol (AGC), 1 x 10 6 iyonları, maksimum püskürtme süresi 500 ms hedef aşağıdaki gibidir: MS araştırması tarama parametrelerdir. Aşağıdaki gibi CID-MS / MS parametreleri şunlardır: en 1-7 ya da en iyi 8-14 veri bağımlı alıcı (DDA), 3 m / z yalıtım genişliği, 500 minimum sinyal,% 35 normalize çarpışma enerjisi (NCE), 0.25 aktivasyon q , 10 ms'lik aktivasyon zaman, 3 x 10 4 AGC, 50 ms maksimum enjeksiyon süresi. Aşağıdaki gibi HCD-MS 3 için parametreler şunlardır: 200 minimum sinyal, 4 m / z izolasyon genişliği,% 60 NCE, 0.1 aktivasyon süresi, 3 x 10 5 AGC, 250 ms IT, 300-1,300 m / z MS / MS seçim aralığı un-parçalı ana iyonu dahil değildir.
  6. en 1-7 ve üst 8-14 koşular her ikisi için iki kopya halinde her bir analizi yapın.
    Not: örnekleri Orbitrap veya tribrid kütle spektrometresi içeren bir aletin yeni bir model ile çalıştırın DDA parametreler değişir ve daha çok MS / MS ve MS 3 tarama dahil etmek için optimize edilebilir. Buna ek olarak, tribrid araçlar için, eş zamanlı ön-seçimi (SPS) 3 kullanılması gerekmektedir -MS.

8. Veri Analizi 16

  1. Böyle fare UniProt gibi uygun bir veritabanına karşı protein analizi yazılımı kullanılarak RAW dosyalarını arayın.
    NOT: Hafif ve ağır dimetilated peptidler aramak için her RAW dosya için iki iş akışı oluşturmak için önemlidir.
  2. Aşağıdaki parametreler kullanılarak RAW dosyalarını Arama: iki cevapsız bölünmeler, peptid kütle aralığı 300-6.000 Da, 15 ppm, ana kütle toleransı, 1 Da parçalanma toleransı ile tripsin. Statik modifikasyonlar: açık dimetilasyon (28,031 peptit N-ucu) veya heavy dimetilasyon (36,076 Da, peptit N-ucu), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
    Not: Bazı durumlarda ağır dimetile zirvesidir ~ 7 Da (35,069 Da, peptit N-ucu) ışık dimetile tepe noktasından ve böylece ağır dimetile peptidler için arama akışı içine dahil edilmelidir. Dinamik modifikasyonlar oksidasyon (15,995 Da, E), 6-karmaşık izobarik etiketi (229,163 Da, K). Yanlış keşif oranlarını elde etmek için bir yem veritabanı arama (örneğin 1, 5%) ve izobarik etiketlerin haberci iyon yoğunlukları aramak için kantitasyon düğümü içerir.
  3. istatistik
    1. amacıyla bir elektronik tablo programa İhracat verileri proteini raportör iyon değerlerini normalize etmek. Her bir protein için, sırası ile, iç standart iç standart veya ham raportör iyon yoğunluklarının ortalama oranı ile medyan raportör iyon oranlarına veya ham raportör iyon yoğunluklar ya bölün. Bu tür bir elektronik çizelge programı Pers olarak uygun istatistiksel yazılım kullanıneus, ya da R örnek koşullar arasında önemli değişiklikler tespit etmek.

Sonuçlar

cPILOT N-terminus lisin kalıntılarında etiket peptidleri kimyasal olarak amin bazlı kimyası kullanır ve örnek çoğullama kabiliyetini artırır. Şekil 2, bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden beyin, kalp, karaciğer ve bir doku 12-karmaşık cPILOT analizinden elde edilen temsili MS verilerini gösterir. Tablo 1'de gösterildiği gibi, Alzheimer hastalığı ve vahşi tip fareler için iki biyolojik çoğaltır...

Tartışmalar

cPILOT fazla 12 farklı numune eş zamanlı olarak ölçülmesini sağlar. peptidlerin N-terminali ve hem de lizin kalıntılarının başarılı etiketleme sağlamak amacıyla, reaksiyonların her set için doğru pH değerine sahip olması ve peptit etiketleme için ilk dimetilasyon reaksiyonu gerçekleştirmek için zorunludur. N-ucunda seçici dimetilasyon (± 0.2) ~ 2.5 bir pH değerine sahip olması ile gerçekleştirilir. Bu lisin üzerindeki amino gruplarının pKa farklılıklarını ve N-terminali kullanılmas...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar var.

Teşekkürler

Yazarlar RASR için Pittsburgh Başlangıç ​​Fon Üniversitesi ve NIH, NIGMS R01 hibe (GM 117191-01) kabul eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Water - MS GradeFisher ScientificW6-44 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS GradeFisher ScientificA955-44 L quantity is not necessary
Acetic AcidJ.T. Baker9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
Ammonium formateAcros Organics208-753-9
Formic AcidFluka Analytical94318-250ML-F
BCA protein assay kitPierce Thermo Fisher Scientific23227
UreaBiorad161-0731
TrisBiorad161-0716
Dithiothreiotol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Iodoacetamide (IAM)Acros Organics144-48-9
L-CysteineSigma Aldrich, Chemistry168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreasSigma Aldrich, Life ScienceT1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2OSigma Aldrich, Life ScienceF8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13CSigma Aldrich, Chemistry596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%Sigma Aldrich156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CPSigma Aldrich, Chemistry190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kitProtea BioSciencesSP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) bufferSigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg)Thermo Fisher Scientific90061
Hydroxylamine hydrochlorideSigma Aldrich, Chemistry255580-100G
Standard vortex mixerFisher Scientific2215365any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridgesWaters186000383These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port modelSigma Aldrich57265A 12 port model is also sufficient
Speed-vacThermo ScientificSPD1010any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamberThermo Scientific2825/2826Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosamplerSciex-This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass SpectrometerThermo Scientific-This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
Analytical balanceMettler ToledoAL54
Stir plateVWR12365-382Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 bufferFisher Scientific06-664-261Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 bufferFisher Scientific06-664-260Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pkFisher Scientific05-408-129Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pkFisher Scientific04-408-120Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter unitsEMD MilliporeUFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 unitsThermo Scientific69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å)BrukerPM5/61100/000This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å)BrukerPM5/61200/000This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient

Referanslar

  1. Ong, S. -. E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. &. #. 2. 1. 6. ;., de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
  3. Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, . From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , (1998).
  4. Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
  5. Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
  6. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
  7. Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
  8. Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  9. Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  10. Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
  11. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
  12. McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  13. Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
  14. Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
  15. Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
  16. Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
  17. Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
  18. Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
  19. Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
  20. Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
  21. Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
  22. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  23. Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
  24. Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
  25. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  26. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiochemistrySay 123kantitatif proteomikcPILOT TMTizotopik etiketleme ve izobarik etiketlemeo ullamadokular

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır