Exemple amélioré Multiplexage de tissus à l'aide combinée Precursor et étiquetage Isotopique isobarique Tagging (cPILOT)

Résumé

marquage isotopique de précurseur combiné et le marquage isobare (cPILOT) est une stratégie de protéomique quantitative qui améliore les capacités de multiplexage échantillon d'étiquettes isobares. Ce protocole décrit l'application de cPILOT aux tissus à partir d'un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les contrôles de type sauvage.

Résumé

Il y a une demande de plus en plus d'analyser de nombreux échantillons biologiques pour la compréhension des maladies et la découverte de marqueurs biologiques. stratégies protéomiques quantitatives qui permettent la mesure simultanée de plusieurs échantillons se généralisent et réduire considérablement les coûts expérimentaux et les temps. Notre laboratoire a développé une technique appelée précurseur combinée marquage isotopique et de marquage isobarique (cPILOT), ce qui améliore l'échantillon multiplexage de marquage isotopique traditionnel ou des approches de marquage isobares. cPILOT globale peut être appliquée à des échantillons provenant de cellules, des tissus, des fluides corporels ou des organismes entiers et donne des informations sur les abondances de protéines différentes conditions relatives à travers l'échantillon. cPILOT fonctionne en 1) en utilisant des conditions de tampon à faible pH pour sélectivement peptide dimethylate N-terminales et 2) en utilisant des conditions de tampon à pH élevé pour étiqueter des amines primaires des résidus lysine avec des réactifs isobares disponibles dans le commerce (voir le tableau des Matériaux / réactifs). Le degré demultiplexage d'échantillons disponibles dépend du nombre d'étiquettes précurseurs utilisés et le réactif de marquage isobare. Nous présentons ici une analyse 12-plex en utilisant la lumière et déméthylation lourde combinée à six plex réactifs isobares pour analyser 12 échantillons de tissus de souris en une seule analyse. multiplexage amélioré est utile pour réduire le temps et le coût expérimental et plus important encore, ce qui permet la comparaison entre les nombreuses conditions d'échantillons (biologiques, réplicats stade de la maladie, les traitements médicamenteux, génotypes, ou points de temps longitudinaux) avec biais moins expérimental et d'erreurs. Dans ce travail, l'approche globale de cPILOT est utilisé pour analyser le cerveau, le cœur et les tissus du foie à travers réplicats biologiques à partir d'un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les contrôles de type sauvage. Mondial cPILOT peut être appliquée à l'étude d'autres processus biologiques et adapté pour augmenter le multiplexage de l'échantillon à plus de 20 échantillons.

Introduction

Proteomics implique souvent l'analyse de nombreux échantillons utilisés pour mieux comprendre les processus de la maladie, la cinétique enzymatique, les modifications post-traductionnelles, réponse aux stimuli environnementaux, la réponse aux traitements thérapeutiques, la découverte de biomarqueurs, ou les mécanismes de la drogue. Les méthodes quantitatives peuvent être utilisées pour mesurer les différences relatives dans les taux de protéine à travers les échantillons et peut être sans étiquette ou comporter un marquage isotopique (métabolique, chimique ou enzymatique). méthodes d'étiquetage des isotopes stables ont gagné en popularité car ils permettent de nombreux échantillons à analyser simultanément et conviennent à des échantillons de différentes cellules, des tissus, des fluides corporels ou des organismes entiers. Méthodes marquage isotopique ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7} augmenter le débit expérimental,tout en réduisant le temps d'acquisition, les coûts et l'erreur expérimentale. Ces méthodes utilisent des spectres de masse précurseur pour mesurer les abondances relatives des protéines à partir des pics peptidiques. Au contraire, les réactifs de marquage isobares ^{8, 9, 10} génèrent des ions rapporteurs qui sont soit détectés dans MS / MS ou MS ^{3 11} spectres et ces pics sont utilisés pour rendre compte des abondances relatives des protéines.

L'état actuel de l'art dans le multiplexage de la protéomique est soit un 10-plexe ¹² ou 12-plexe analyse de balise isobare ^13. Multiplexage d'échantillon amélioré (c. -à > 10 échantillons) méthodes ont été développées par notre laboratoire pour les tissus ^{14, 15, 16, 17,} et par d' autres pour l'analyse des cellules ¹⁸ sup>, ^{19, 20, 21} tissus, ou des peptides cibles ^22. Nous avons développé une technique de multiplexage amélioré appelé marquage isotopique précurseur combiné avec le marquage isobarique (de cPILOT). CPILOT mondiale est utile pour obtenir des informations sur les concentrations relatives de toutes les protéines à travers différentes conditions d'échantillon (≥12) ^14. La figure 1 montre un flux de production cPILOT général. Trypsiques ou peptides Lys-C sont marqués sélectivement à l'extrémité N-terminale avec diméthylation en utilisant un faible pH ² et au niveau des résidus de lysine de 6-plex réactifs en utilisant un pH élevé. Cette stratégie double le nombre d'échantillons qui peuvent être analysés avec des réactifs isobares ce qui contribue à réduire les coûts expérimentaux et, en outre, réduit les étapes expérimentales et de temps.

cPILOT est flexible que nous avons développé d'autres méthodes pour étudier l'oxydation modi post-traductionnellefications, y compris les protéines modifiées ^{3-nitrotyrosine-14} et les peptides contenant des cystéines avec S-nitrosation (oxcyscPILOT) ^23. Nous avons également mis au point une approche sélective d' acides aminés, cPILOT cystéine (cyscPILOT) ^17. Acquisition MS ³ avec un haut-ion ou ^11-y sélective ₁ d' ion de procédé ¹⁵ peut aider à réduire l' interférence d'ions rapporteur et d' améliorer la précision quantitative des cPILOT. L'utilisation de MS ³ dans le procédé d'acquisition nécessite un instrument à haute résolution avec un analyseur de masse Orbitrap bien que les instruments de piégeage d'ions à basse résolution peuvent également travailler ^24.

Auparavant, cPILOT a été utilisé pour étudier les protéines du foie à partir d' un ¹⁶ modèle de souris de la maladie d'Alzheimer. Nous décrivons ici comment effectuer une analyse globale de l'aide cPILOT cerveau, le cœur, et homogénats de foie pour étudier le rôle de la periphery dans la maladie d'Alzheimer. Cette expérience intègre la réplication biologique. En raison de la polyvalence des cPILOT, les utilisateurs intéressés peuvent utiliser la technique pour étudier d'autres tissus pour une série de problèmes biologiques et des systèmes.

Protocole

Déclaration d'éthique: Les souris ont été achetés auprès d'un institut de recherche indépendant, biomédicale à but non lucratif et logés dans la Division des ressources animales de laboratoire à l'Université de Pittsburgh. Tous les protocoles animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation des institutions à l'Université de Pittsburgh.

1. extraction des protéines et la production de produits chimiques pour Peptides marquage

1. Extrait de protéines à partir de tissus, des cellules ou des fluides corporels.
   1. Homogénéiser 60-90 mg de tissu (par exemple le cerveau, le cœur et le foie) dans une solution saline de tampon phosphate (PBS 1x) avec 8 M d' urée (500 pi) en utilisant un homogénéisateur mécanique. Les inhibiteurs de protéase ou phosphatase peuvent être ajoutés au tampon si nécessaire. Dans ce projet, ils ne sont pas utilisés. Utiliser les paramètres suivants pour la homogénéiseur: matrice des billes de lyse A, 4 m / s, 20 s. le tissu cardiaque peut nécessiter jusqu'à 9 cycles d'homogénéisation.
      REMARQUE: Protease ou inhibiteur de phosphatase s peut être ajouté à la mémoire tampon, si nécessaire. Ils ne sont pas utilisés dans cette étude.
      1. Retirer homogénat de tissu à partir du tube de lyse et transférer dans un tube de micro-centrifugeuse. Rincer les tubes de lyse avec 100 à 500 pi de PBS avec 8 M d'urée et de combiner la solution de rinçage avec le tissu homogénat.
   2. Centrifuger les tissus homogénéisés (9447 xg, 4 ° C, 15 min) et recueillir le surnageant.
2. Déterminer la concentration en protéine en utilisant un dosage de l' acide bicinchoninique (BCA) selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE: dilution plus avec le tampon peut être nécessaire si la concentration en protéines est trop élevée. Les concentrations résultantes pour les échantillons provenant de ces tissus ont été dans l'intervalle 6-13 ug / ul.
   1. Facultatif: ajouter un étalon de contrôle interne de la qualité (par exemple de la caséine alpha bovine ou une autre protéine exogène) avec le rapport standard de 1 ug: échantillon de protéine de 100 ug.

jove_title "> 2. Digestion échantillon

1. Ajouter 100 ug (100 x 10 ^-6 g) de protéine de chaque échantillon de repérage individuel des tubes de micro-centrifugation. Le volume est fonction de la concentration en protéine (voir étape 1.2).
2. Ajouter dithiothréitol (DTT) (40: 1 réactif à l'échantillon rapport mol) à chaque échantillon. Incuber à 37 ° C pendant 2 h. Le calcul pour le rapport molaire est basé sur la masse de la protéine d'albumine de sérum bovin (BSA), qui est de 66,5 x 10 ³ g / mol.
3. Ajouter iodoacétamide (IAM) (80: 1 réactif à l'échantillon rapport mol) à chaque échantillon. Incuber sur la glace dans l'obscurité pendant 2 h. Cette réaction est réalisée sur de la glace pendant 2 h pour éviter des réactions secondaires.
4. Ajouter la L-cystéine (40: 1 réactif à l'échantillon rapport mol) à chaque échantillon. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
5. Ajouter du tampon Tris 20 mM avec 10 mM de _CaCl2 (pH 8,2) pour diluer l' urée à une concentration finale de 2 M.
6. Ajouter L-1-tosylamido-2-cétone de chlorométhyle phényléthyle (TPCK) traité à la trypsine (50: 1 substrat à l'enzyme rapport mol) à chaque échantillon et incuber à 37 ° C pendant 24 h.
7. Stopper la digestion des protéines par flash-congélation de l'échantillon dans l'azote liquide et stocker à -80 ° C jusqu'à traitement ultérieur.

3. Exemple de dessalage

1. Re-acidifier les échantillons par addition d'acide formique (FA). Ajouter suffisamment FA pour obtenir une concentration finale de 0,1%. Si les échantillons sont à l'origine à -80 ° C, dégel des échantillons sur la glace avant de re-acidification.
2. De-sel en utilisant les peptides C ₁₈ hydrophile - lipophile équilibrée (HLB) des cartouches de 10 mg comme décrit précédemment ^16.
3. Sécher les échantillons par centrifugation sous vide (5 torr, 45 ° C, 77 x g) à un volume de ~ 10 pi.

4. diméthylation d'étiquetage (N-terminales)

1. Reconstituer peptides dans 1% d'acide acétique (0,25 pg / ul) dissous dans une Chromatographie liquide à haute performance (HPLC) ou de l'eau de qualité nano-pure. Supprimer un 50 μ; G portion dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse (1,5 ml) et stocker le reste à -80 ° C.
2. Ajouter 8 ul de 60 mM (4%) CH ₂ O (37% en poids / volume) ou 60 mM (4%) ¹³ CD ₂ O (20% en poids / v) pour les échantillons pour le marquage avec la lumière ou diméthylation lourde, respectivement . Typiquement, 4 pl de réactif est ajouté par 25 ug de peptides (étapes 4.2, 4.3, 4.6).
3. Ajouter 8 ul de 24 mM de NaBH ₃ CN ou 24 mM NaBD ₃ CN pour les échantillons marqués avec de la lumière ou diméthylation lourde, respectivement.
4. Vortex et secouer sur un agitateur de tube pour ~ 10 min à température ambiante.
5. Stopper la réaction en ajoutant 16 pl de 1% d'ammoniac (~ 28-30% v / v) pendant 5 min. Typiquement, 8 pl de réactif est ajouté par 25 ug de peptides.
6. Re-acidifier les mélanges réactionnels par addition de 8 pi de 5% FA (98% v / v).
7. Combiner la lumière et peptides lourds diméthylées (figure 1) pour générer un total de six échantillons. Voir le tableau 1 pour une description de marquage des échantillons et la mise en commun utilisé pour cette étude.
8. Effectuer échantillon dessalage selon les étapes 3.2 et 3.3.

5. isobare étiquetage (résidus Lys)

1. Reconstituer 100 ug de peptides diméthylées (1 ug / ul) dans un tampon de 100 mM de bicarbonate d'ammonium tri-éthyle (TEAB) (pH ~ 8,5).
2. Préparer les réactifs isobares comme indiqué dans le protocole du fabricant (voir le tableau des Matériaux / réactifs).
3. Ajouter des réactifs isobares solubilisées (41 ul) à des peptides et des vortex pendant 10 s ~. Secouer les échantillons sur un agitateur à tubes micro-centrifugeuse pendant environ 1 h. Stopper la réaction avec 8 ul d'hydroxylamine (10% p / v) et on incube les échantillons pendant 15 min à température ambiante.
4. Regrouper les six échantillons marqués en un seul mélange et dessaler (étapes 3.1 à 3.3) ou conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
   NOTE: Pour améliorer la couverture protéome et de la profondeur, une stratégie de séparation multi-dimensionnelle est suggérécomme échangeur de cations forte (SCX).

6. Échange de Cation forte

1. Effectuer SCX selon le protocole du fabricant (voir tableau des matériaux).
   1. Préparer ~ 1 ml de solution de formiate d'ammonium (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, et 500 mM) avec 10% d'acétonitrile (ACN), 0,1% FA (pH 3).
   2. Retirer le bouchon rouge de la partie supérieure de l'embout de pipette et appuyez sur l'embout de pipette avec la suspension d'emballage pour garantir que le matériau de garnissage est vers le bas de la pointe de pipette.
      REMARQUE: Critique: Ne jetez pas la pointe de la pipette jusqu'à la fin du protocole.
   3. Placez l'adaptateur de centrifugation sur la partie supérieure d'un tube de micro-centrifugeuse (2 ml) et de fixer la pointe de la pipette à l'intérieur.
   4. Ajouter 150 pi de tampon de reconstitution SCX à pointes de pipette.
   5. Centrifuger les embouts de pipette pour 6 min à température ambiante (4000 x g). Répétez cette étape deux fois et jeter les déchets.
   6. Dissoudre le peptides dans 150 ul de tampon de reconstitution SCX. Assurez-vous que le pH est 3.
   7. Ajouter peptides aux embouts de pipette, centrifugeuse (voir 6.1.5), et conserver l'éluant.
   8. Transférer le filtre et la pipette dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse (2 ml) et ajouter 150 ul de 20 mM de solution de formiate d'ammonium. Centrifuger pendant 6 min à température ambiante (4000 x g) et conserver l'éluant.
   9. Répétez l' étape 6.1.8 un sept fois supplémentaires, en utilisant des concentrations successives ( par exemple 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM et 500 mM) de formiate d'ammonium.
2. Transfert des huit fractions SCX à tubes micro-centrifugeuse (1,5 ml) et de les concentrer en utilisant l'évaporation centrifuge (voir étape 3.3).

7. Chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS / MS) et MS ³

1. Reconstituer les peptides dans l'eau de qualité par spectrométrie de masse avec 0,1% de FA, filtrer et placer dans un flacon auto-échantillonneur. Filtrer les peptides comme follOWS:
   1. Ajouter peptides reconstitués dans un tube de micro-centrifugation contenant un filtre de 0,65 pm (voir Matériaux tableau).
   2. peptides Centrifuger à 12 000 g pendant 1 min. Retirer le filtre, jeter et ajouter des peptides filtrés dans un flacon échantillonneur automatique.
2. Préparer les tampons de phase mobile comme suit: 3% (v / v) avec 0,1% d'ACN FA (A) et 100% d'ACN avec 0,1% FA (B).
3. Injecter 6 uL de chaque échantillon de la fraction sur une colonne SCX de piège emballé à 2 cm à C ₁₈ matériau (5 um, 200 Â de taille de pore).
   REMARQUE: le nettoyage de l'échantillon sur le piège est le suivant: 3 min, 0% B; 3 ul / min en utilisant un système de Chromatographie liquide 2D (voir Matériaux tableau).
4. Exécuter le procédé de séparation analytique. Utiliser un identifiant 75 um x 13,2 cm colonne de silice fondue laser à pointe tiré capillaire garnie d' un matériau C ₁₈ (5 um, 100 Â). Le gradient est la suivante: 0-5 min, 10% B; 5-40 min, 10-15% de B; 40-90 min, 15 à 25% de B; 90-115 min, 25-30% de B; 115-130 min, 30-60% de B; 130-135 min, 60-80% de B; 135-145 min, 80% B, 145-150 min, 80-10% de B; 150-180 min, 10% B; 300 nL / min, 180 min.
5. Exécuter l'acquisition de données pour le spectromètre de masse pendant le procédé de séparation analytique est en cours d'exécution.
   REMARQUE: Les paramètres pour l'analyse de l' enquête MS sont les suivantes: 400-1,600 m / z, 60 000 de résolution, commande automatique de gain (AGC) Cible 1 x 10 ⁶ ions, le temps d'injection maximale de 500 ms. Paramètres pour CID-MS / MS sont les suivantes: Haut 1-7 ou 8-14 Haut données acquisition dépendant (DDA), 3 m / z largeur d'isolement, 500 signal minimum, l' énergie de collision normalisée de 35% (NCE), 0,25 activation q , 10 ms de temps d'activation, 3 x 10 ⁴ AGC, 50 ms temps d'injection maximale. Paramètres pour HCD-MS ³ sont les suivantes: 200 signal minimum, 4 m / z largeur d'isolement, 60% RCE, 0,1 heure d'activation, 3 x 10 ⁵ AGC, 250 ms IT, 300-1,300 m / z plage de sélection MS / MS exclure ion parent non fragmenté.
6. Effectuer chaque analyse en double exemplaire tant pour le top 1-7 et 8-14 top fonctionne.
   NOTE: Pour les échantillons fonctionnent sur un modèle plus récent d'un instrument contenant un Orbitrap ou un spectromètre de masse tribrid, les paramètres DDA varient et peuvent être optimisés pour inclure plus MS / MS et MS ³ scans. En outre, pour les instruments tribrid, la sélection de précurseur synchrone (SPS) -MS ³ doivent être utilisés.

8. Analyse des données ¹⁶

1. Rechercher les fichiers RAW à l'aide du logiciel d'analyse de protéines contre une base de données appropriée, telle que la souris Uniprot.
   NOTE: Il est important de créer deux flux de travail pour chaque fichier RAW afin de rechercher la lumière et des peptides diméthylés lourds.
2. Rechercher les fichiers RAW en utilisant les paramètres suivants: la trypsine avec deux manqués clivages, la gamme de masse peptidique 300-6,000 Da, la tolérance masse parente de 15 ppm, une tolérance à la fragmentation Da. modifications statiques: la lumière diméthylation (28,031, peptide N-terminale) ou heavy diméthylation (36,076 Da, peptide N-terminal), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
   REMARQUE: Parfois, le pic diméthylé lourd est ~ 7 Da (35,069 Da, peptide N-terminale) est du pic de lumière diméthylé et devrait être incorporé ainsi dans le flux de travail de recherche de peptides diméthylés lourds. modifications dynamiques: oxydation (15,995 Da, M), une étiquette 6-plex isobare (229,163 Da, K). Inclure une recherche de base de données leurre pour donner des taux de fausses découvertes (par exemple 1 à 5%) et un noeud de quantification pour rechercher les intensités d'ions rapporteurs d'étiquettes isobares.
3. Statistiques
   1. Exporter des données dans un programme de feuille de calcul électronique afin de normaliser les valeurs d'ions rapporteurs de la protéine. Pour chaque protéine, soit diviser les rapports d'ions rapporteurs médianes ou les intensités d'ions rapporteurs brut par le rapport entre la médiane de l'étalon interne ou les intensités d'ions reporter premières de l'étalon interne, respectivement. Utilisez le logiciel statistique approprié comme un programme de feuille de calcul électronique, PersEUS ou R pour déterminer des changements importants entre les conditions échantillons.

Résultats

cPILOT utilise la chimie à base d'amine de peptides chimiquement de l'étiquette à l'extrémité N-terminale et les résidus de lysine et améliore les capacités de multiplexage d'échantillons. La figure 2 montre des données représentatives de MS qui est obtenu à partir d' une analyse de cPILOT 12-Plex du cerveau, le cœur et les tissus du foie à partir d' un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les contrôles de type sauvage...

Discussion

cPILOT permet la mesure simultanée de plus de 12 échantillons uniques. Afin d'assurer le marquage avec succès à la fois l'extrémité N-terminale et les résidus lysine de peptides, il est impératif d'avoir le pH correct pour chaque ensemble de réactions et d'effectuer la réaction de diméthylation première pour le marquage des peptides. diméthylation sélective à l'extrémité N-terminale est réalisée en ayant un pH à ~ 2,5 (± 0,2). Ceci est obtenu en tirant parti des différences de p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water - MS Grade	Fisher Scientific	W6-4	4 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS Grade	Fisher Scientific	A955-4	4 L quantity is not necessary
Acetic Acid	J.T. Baker	9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Ammonium formate	Acros Organics	208-753-9
Formic Acid	Fluka Analytical	94318-250ML-F
BCA protein assay kit	Pierce Thermo Fisher Scientific	23227
Urea	Biorad	161-0731
Tris	Biorad	161-0716
Dithiothreiotol (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Iodoacetamide (IAM)	Acros Organics	144-48-9
L-Cysteine	Sigma Aldrich, Chemistry	168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich, Life Science	T1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O	Sigma Aldrich, Life Science	F8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C	Sigma Aldrich, Chemistry	596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP	Sigma Aldrich, Chemistry	190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit	Protea BioSciences	SP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer	Sigma Aldrich, Life Science	T7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg)	Thermo Fisher Scientific	90061
Hydroxylamine hydrochloride	Sigma Aldrich, Chemistry	255580-100G
Standard vortex mixer	Fisher Scientific	2215365	any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges	Waters	186000383	These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model	Sigma Aldrich	57265	A 12 port model is also sufficient
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamber	Thermo Scientific	2825/2826	Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler	Sciex	-	This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer	Thermo Scientific	-	This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH
Analytical balance	Mettler Toledo	AL54
Stir plate	VWR	12365-382	Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 buffer	Fisher Scientific	06-664-261	Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer	Fisher Scientific	06-664-260	Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	05-408-129	Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	04-408-120	Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units	EMD Millipore	UFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 units	Thermo Scientific	69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å)	Bruker	PM5/61100/000	This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å)	Bruker	PM5/61200/000	This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient