향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

요약

결합 전구체 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT)은 동중 태그의 샘플 다중화 기능을 향상 정량 프로테오믹스 전략이다. 이 프로토콜은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 조직에 cPILOT의 응용 프로그램을 설명합니다.

초록

질병의 이해와 바이오 마커의 발견을위한 많은 생물학적 샘플을 분석하는 요구가 증가하고있다. 여러 샘플의 동시 측정이 확산되고 크게 실험 비용과 시간을 단축 한 수 정량 프로테오믹스 (proteomics) 전략. 우리 연구실은 기존의 동위 원소 표지 또는 등압 태그 방식의 샘플 멀티플렉싱을 향상 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT) 결합 전구체라는 기술을 개발했다. 글로벌 cPILOT은 세포, 조직, 체액, 또는 전체 유기체로부터 유래 된 샘플에 적용하고 다른 샘플 조건에 걸쳐 상대적 단백질 존재비에 대한 정보를 제공 할 수있다. cPILOT는 낮은 pH 완충액 조건을 이용하여) (1)에 의해 작동 선택적 dimethylate 펩티드 N 말단 2)) 재료 / 시약의 표를 참조 (시판 등압 시약 리신 잔기의 차 아민 라벨을 높은 pH 완충액 조건을 사용한다. 의 정도가능한 샘플 다중화 사용 전구체 레이블의 수 및 등압 태그 시약에 의존한다. 여기서는 한 번의 분석 마우스 조직에서 12 개 샘플을 분석하는 여섯 플렉스 등압 시약과 함께 광 무거운 디메틸 화를 사용하여 12 플렉스 분석을 제시한다. 향상된 다중 적은 실험 편견과 오류, 더 중요한 것은 실험 시간과 비용을 줄일 수 많은 샘플 조건 (생물 복제, 병기, 약물 치료, 유전자형, 또는 세로 시간 포인트)에서 비교를 허용하는 도움이됩니다. 본 연구에서는 글로벌 cPILOT 방법은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 뇌, 심장, 생물 복제에서 간 조직을 분석하는 데 사용됩니다. 글로벌 cPILOT 다른 생물학적 과정을 연구에 적용되고, 20 개 이상의 샘플을 샘플 다중화를 증가하도록 구성 될 수있다.

서문

단백질 체학은 종종 더 나은 질병 과정을 이해하는 데 많은 샘플, 효소 반응 속도론, 번역 후 수정, 환경 자극에 대한 반응, 치료 치료, 바이오 마커 발견, 약물 메커니즘에 대한 응답의 분석을 포함한다. 정량 방법은 시료 전체 단백질 수준에서의 상대적인 차이를 측정하고 라벨없는 일 수 있거나, 동위 원소 표지 (대사, 화학적, 또는 효소)를 포함하는 이용 될 수있다. 그들은 많은 시료를 동시에 분석 할 수있게하고 다른 세포, 조직, 체액, 또는 유기체 전체 샘플에 적합하기 때문에 안정 동위체 표식 방법은 인기가 증가했다. 동위 원소 표지 방법 ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7} 증가 실험 처리량획득 시간, 비용, 및 실험 오차를 줄일 수있다. 이러한 방법은 펩티드의 단백질 피크의 상대 존재비를 측정하는 전구체 질량 스펙트럼을 사용한다. 대조적으로, 태그 등압 시약 ^{8, 9, 10} 중 하나를 MS / MS 또는 MS에서 검출되는 리포터 이온을 발생 ^3~11 스펙트럼 및 이들 피크는 단백질의 상대적 존재비를보고하는데 사용된다.

프로테오믹스 멀티플렉싱 현재 최첨단은 ¹² 10 12 플렉스 플렉스 등압 태그 분석 중 ^13이다. 향상된 다중 샘플 (즉> 10 개 샘플) 방법은 세포 ^(18)의 분석을 위해 다른 사람에 의해 조직을 ^{14, 15, 16, 17에} 대해 실험실에서 개발하고있다 ^{19, 20, 21,} 또는 표적 펩티드 ²² 어떤 조직이. 우리는 동중 태그 (cPILOT)와 결합 전구체 동위 원소 표지라는 강화 된 다중화 기술을 개발했다. 글로벌 cPILOT 다른 샘플 조건 (≥12) ⁽¹⁴⁾ 전체의 모든 단백질의 상대적 농도에 대한 정보를 얻기에 유용합니다. 도 1은 일반적인 cPILOT 흐름을 나타낸다. 트립신 또는리스-C 펩티드는 선택적으로 낮은 pH ^(2)를 사용하여 디메틸 화와 N 말단에 및 높은 pH를 사용하여 6 플렉스 시약 리신 잔기로 표지된다. 이 전략은 실험 비용과 추가를 줄이는 데 도움이 동중 시약으로 분석 할 수있는 샘플의 수를 두 배로, 실험 단계 및 시간을 줄일 수 있습니다.

우리는 산화 번역 후 MODI을 연구하기 위해 다른 방법을 개발로 cPILOT는 유연3 nitrotyrosine의 변성 단백질 ^14, S-nitrosylation (oxcyscPILOT) ²³ 시스테인 함유 펩티드를 포함 fications. 또한 아미노산 선택적 접근 시스테인 cPILOT (cyscPILOT) ^(17)을 개발 하였다. 상부 이온 선택성 ¹¹ _Y-1 - 이온 방법 ⁽¹⁵⁾ MS ⁽³⁾ 획득 리포터 이온 간섭을 줄이고 cPILOT의 정량 정확도를 향상시킬 수있다. 저해상도 이온 트랩기구는 ²⁴ 일 수 있지만, 획득 방법에서 MS ^(3)의 사용은 orbitrap 질량 분석기 고해상도 장비를 필요로한다.

이전 cPILOT는 알츠하이머 병 마우스 모델에서 간 단백질 ^(16)을 연구하는 데 사용되었습니다. 여기, 우리는 periphe의 역할을 연구하는 뇌, 심장, 간 균질를 사용하여 글로벌 cPILOT 분석을 수행하는 방법에 대해 설명합니다알츠하이머 병의 스피. 이 실험은 생물학적 복제를 통합합니다. 때문에 cPILOT의 다양성의 관심 사용자는 생물 문제와 시스템의 범위를 다른 조직을 연구하는 기술을 사용할 수 있습니다.

프로토콜

윤리 선언문 : 마우스는 독립적 인 비영리 생명 의학 연구 기관에서 구입 한 피츠버그 대학의 실험 동물 자원의 부문에 보관되었다. 모든 동물 프로토콜은 피츠버그 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

화학 태그 1. 단백질 추출 및 펩타이드 생성

1. 조직, 세포, 또는 체액에서 단백질을 추출합니다.
   1. 기계적 균질기를 사용하여 8 M 우레아 (500 μL)를 인산 완충 식염수 조직 (예 : 뇌, 심장, 간) (1X PBS) 60-90 mg의 균질화. 필요한 경우, 프로테아제 억제제 또는 인산 버퍼에 추가 될 수있다. 이 프로젝트에서, 그들은 사용되지 않았다. 균질 대해 다음 파라미터를 사용하여 행렬 A 비드, 4m / 초, 20 초를 용균. 심장 조직을 균질화의 최대 9 사이클을 필요로 할 수있다.
      참고 : 프로테아제 또는 포스 파타 아제 억제제 필요한 경우, S가 버퍼에 추가 될 수있다. 그들은이 연구에 사용되지 않았다.
      1. 용균 튜브에서 조직 균질 액을 제거하고 마이크로 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 8 M 우레아의 PBS 100-500 μL와 튜브 용균 헹구고 조직 파쇄 액과 세정액을 결합한다.
   2. 균질 조직을 원심 분리 (9,447 XG, 4 ℃, 15 분)하여 상층 액을 모은다.
2. 제조자의 지시에 따라 bicinchoninic 산 (BCA) 분석법을 이용하여 단백질 농도를 결정한다.
   주 : 단백질 농도가 너무 높으면 버퍼 희석 또한 필요할 수있다. 이들 조직으로부터 얻어진 시료 농도 6-13 ㎍ / μL 사이에 있었다.
   1. 선택적 : 1 비율 μg의 표준 내부 품질 관리 표준 (예 : 소 알파 카제인 또는 다른 외래 단백질)을 추가 100 μg의 단백질 샘플.

jove_title "> 2. 샘플 소화

1. 각 샘플로부터의 단백질 100 μg의 (100 × ^10-6 g)를 첨가 개별적 마이크로 원심 분리기 튜브로 표시한다. 볼륨이 단백질 농도에 의존한다 (단계 1.2 참조).
2. 각 샘플 (몰 비율 샘플 1 시약 40) 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가한다. 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 몰비의 계산은 66.5 × ¹⁰³ G / 몰이다 소 혈청 알부민 단백질 질량 (BSA) 기반으로한다.
3. 각 샘플 (몰 비율 샘플 1 시약 80) 요오도 아세트 아미드 (IAM)를 추가한다. 2 시간 동안 어둠 속에서 얼음에 품어. 이 반응은 부반응을 방지하기 위해 2 시간 동안 얼음상에서 수행된다.
4. 각 샘플 (몰 비율 샘플 1 시약 40) -L- 시스테인을 추가한다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
5. M. 2의 최종 농도로 희석 우레아, 10 mM의 _CaCl2를 (PH 8.2)에 20 mM 트리스 완충액 추가
6. 추가 L-1-tosylamido -2- 페닐 클로로 메틸 케톤 (TPCK)을 트립신 처리 한 (501 기판에 각 시료) 몰 비율을 효소 및 24 시간 동안 37 ° C에서 배양.
7. 플래시 동결 추가 처리 될 때까지 -80 ℃에서 액체 질소에 저장하여 샘플을 단백질 분해 담금질.

3. 샘플 탈염

1. 포름산 (FA)를 첨가하여 샘플을 다시 산성화. 0.1 %의 최종 농도를 얻기 위해 충분한 FA를 추가합니다. 시료는 -80 ° C에서 원래 경우 다시 산성화 전에 얼음에 샘플을 해동.
2. 탈 염은 이전에 균형으로 C _18의 친수성 친 유성 (HLB) 10 mg의 카트리지를 사용하여 펩티드 ¹⁶ 기재.
3. ~ 10 μL의 부피로 진공 원심 분리 (5 토르, 45 ° C, 77 XG)하여 샘플을 건조.

4. 디메틸 화 라벨 (N 말단)

1. 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 또는 나노 - 순수한 등급의 물에 용해 된 1 % 아세트산 펩타이드 (0.25 ㎍ / μL) 재구성한다. 50 μ 제거; g의 새로운 마이크로 원심 분리 튜브 (1.5 ㎖)에 부와 -80 ° C의 나머지를 저장한다.
2. (8) 60 mM의 (4 %) CH의 μL ₂ O (37 % 중량 / V) 또는 60 mM의 (4 %) ¹³ CD ₂ O (20 % 중량 / V) 또는 많이 디메틸 화와 표지 용 샘플 각각을 추가 . 일반적으로, 시약 4 μL 펩타이드 25 μg의 (단계 4.2, 4.3, 4.6)에 따라 첨가된다.
3. 각각 밝거나 무거운 디메틸 화, 표지 샘플에 24 밀리미터의 NaBH ₃ CN 24 mM의 ₃ NaBD CN 8 μL를 추가한다.
4. 소용돌이와 실온에서 ~ 10 분 튜브 쉐이커에 흔들.
5. 5 분 동안 1 % 암모니아수 (~ 28-30 %의 v / v)의 16 μL를 첨가하여 반응을 켄칭 하였다. 일반적으로, 시약 8 μL 펩타이드 25 μg의 당 추가된다.
6. 다시 산성화시키고, 5 % FA 8 μL 첨가하여 반응 혼합물 (98 %의 절 / V).
7. 여섯 개 개의 샘플을 생성하는 광 및 무거운 dimethylated 펩티드 (도 1)에 결합한다. 표 1을 참조하십시오 본 연구에 사용되는 샘플 태그 및 풀링에 대한 설명.
8. 단계 3.2 및 3.3에 따라 샘플 탈염을 수행합니다.

5. 등압 태그 (라이신 잔기)

1. 트리 에틸 암모늄 바이 카보네이트 (TEAB) 완충액 (pH ~ 8.5) 100 mm 단위 dimethylated 펩타이드 100 μg의 (1 개 ㎍ / μL)를 재구성한다.
2. 제조 업체의 프로토콜에 명시된 바와 같이 동중 시약을 준비합니다 (재료 / 시약의 표 참조).
3. ~ 10 초 동안 펩티드 및 와류에 용해 등압 시약 (41 μL)을 추가한다. ~ 1 시간 동안 마이크로 원심 분리기 튜브 통에 샘플을 흔들어. 8 μL 히드 록실 아민과 실온에서 15 분 동안 샘플을 배양 (/ V w 10 %)로 반응을 켄칭 하였다.
4. 추가로 사용할 때까지 -80 ℃에서 혼합 한 탈염 (단계 3.1 내지 3.3) 또는 저장소로 여섯 개 표지 샘플 풀.
   참고 : 프로테옴 범위와 깊이를 개선하기 위해, 다차원 분리 전략 제안같은 강한 양이온 교환 (SCX).

6. 강한 양이온 교환

1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 SCX을 수행합니다 (재료 표 참조).
   1. 포름산 암모늄 용액 ~ 1 ㎖ (20 mm의 40 mm의 60 mm의 80 mm의 100 mm의 150 mm의 250 밀리미터, 500 mM)을 10 % 아세토 니트릴 (ACN), 0.1 % FA 핀 (PH3)을 준비.
   2. 피펫 팁의 상단에서 빨간 모자를 제거하고 포장 재료는 피펫 팁의 바닥을 향해 있는지 확인하기 위해 슬러리 포장과 피펫 팁을 누릅니다.
      참고 : 치명타 : 프로토콜이 끝날 때까지 피펫 팁을 버리지 마십시오.
   3. 마이크로 원심 분리 튜브 (2 ㎖)의 상부에 원심 어댑터를 놓고 내부 피펫 팁을 고정.
   4. 피펫 팁 SCX 재구성 버퍼 150 μL를 추가합니다.
   5. 실온 (4000 XG)에서 6 분간 피펫 팁을 원심 분리기. 이 단계를 두 번 더 반복하고 폐기물을 폐기하십시오.
   6. 는 P를 녹이고SCX 재구성 완충액 150 μL의 eptides. pH가 3인지 확인합니다.
   7. 피펫 팁, 원심 분리기 (6.1.5 참조) 펩티드를 추가하고 용리액을 유지한다.
   8. 새로운 마이크로 원심 분리 튜브 (2 mL) 중 상기 필터와 피펫으로 옮기고하는 20 mM 포름산 암모늄 용액 150 μL를 추가한다. 실온 (4000 XG)에서 6 분 동안 원심 분리하여 용출액을 유지한다.
   9. 6.1.8 단계를 반복하여 추가의 일곱 번, 암모늄 포르 메이트의 연속적인 농도 (즉, 40 mm의 60 mm의 80 mm의 100 mm의 150 mm의 250 mM 내지 500 mm)를 사용.
2. 마이크로 원심 분리기 튜브 (1.5 mL)을 8 개의 분획을 SCX 옮기고 원심 증발을 사용하여 그것들을 집중한다 (단계 3.3 참조).

7. 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)와 MS ⁽³⁾

1. 0.1 % FA, 필터 질량 분석 등급 물에 펩티드를 재구성하고, 오토 샘플러 바이알에 배치했다. FOLL 같은 필터 펩티드OWS :
   1. 0.65 μm의 필터를 포함하는 미세 원심 분리 관에 추가 재구성 펩티드 (재료 표 참조).
   2. 1 분 동안 12,000 XG 원심 분리기 펩타이드. 필터를 제거 폐기하고, 자동 샘플러 병에 필터링 된 펩티드를 추가 할 수 있습니다.
2. 다음 이동상 버퍼 준비 : 3 %, 0.1 %, FA (A)와 (V / V) ACN 100 % ACN 0.1 % FA (B)와.
3. C ₍₁₈₎ 재료 (는 5㎛, 200 Å 기공 크기)를 2cm로 충전 트랩 컬럼 상 SCX 각 분획 시료 6 μL를 주입한다.
   주 : 다음에 트랩 샘플 세정 : 3 분, 0 % B 단계; 2 차원 액체 크로마토 그래피 시스템을 사용하여 3 μL / 분 (재료 표 참조).
4. 분석 분리 방법을 실행합니다. C ₍₁₈₎ 재료로 충전 된 75 μm의 ID X 13.2 cm 레이저 인출 팁 용융 실리카 모세관 컬럼 (5 ㎛의 100 Å)을 사용한다. 구배는 : 0-5 분, 10 % B; 5-40 분 10-15 % B; 40-90 분 15-25 % B; 90-115 분 25-30 % B; 115-130 분 30-60 % B; 130-135 분 60-80 % B; 135-145 분, 80 % B, 145-150 분, 80-10 %의 B; 150-180 분, 10 % B; 300 거리 nL / 분, 180 분.
5. 분석 분리 방법을 실행하는 동안 질량 분석기에 대한 데이터 수집을 실행합니다.
   주 : 400-1,600 m / z 60,000 해상도, 자동 이득 제어 (AGC)는 1 × ¹⁰⁶ 이온, 최대 분사 시간이 500ms 타겟팅 다음과 같이 조사 MS 스캔을위한 파라미터이다. 다음 CID-MS / MS에 대한 파라미터들은 : 상위 1-7 또는 상부 8-14 데이터 종속 수집 (DDA), 3m / z 분리 폭 500 최소 신호 35 % 정상화 충돌 에너지 (NCE), 0.25 활성화 Q 10 밀리 활성화 시간, 3 × ¹⁰⁴ AGC, 50 밀리 초, 최대 분사 시간. 다음 HCD-MS ^(3)에 대한 매개 변수는 200의 최소 신호 4 m / z 분리 폭 60 % NCE 0.1 활성화 시간, 3 × ¹⁰⁵ AGC 250 개 단말 IT를 300-1,300 m / z MS / MS 선택 범위 , 유엔 조각 부모 이온을 제외 할 수 있습니다.
상단 1-7과 최고 8-14 실행 모두 중복의 각 분석을 수행합니다.
참고 : 샘플이 orbitrap 또는 tribrid 질량 분석기를 포함하는 악기의 새로운 모델을 실행할 경우, DDA 매개 변수는 다양하고 더 MS / MS 및 MS ³ 스캔을 포함하도록 최적화 할 수 있습니다. 또한 tribrid 악기 동기 전구체 선택 (SPS)는 ^3이 사용되어야 -MS.

8. 데이터 분석 ⁽¹⁶⁾

1. 마우스 Uniprot 같은 적절한 데이터베이스에 대한 단백질 분석 소프트웨어를 사용하여 RAW 파일을 검색 할 수 있습니다.
   주 : 빛과 무거운 dimethylated 펩티드를 검색하기 위해 각 RAW 파일에 대한 두 개의 워크 플로우를 작성하는 것이 중요합니다.
2. 다음 매개 변수를 사용하여 RAW 파일을 검색이 놓친 분열, 펩타이드의 질량 범위 300-6,000 다, 15 ppm의 부모 중량 허용 오차, 1 개 다 단편화 허용 오차 트립신. 정적 변형 : 광 디메틸 화 (28.031, N 말단 펩티드) 또는 Heavy의 디메틸 화 (36.076 다, N 말단 펩티드) carbamidomethyl (57.021 다, C).
   주 : 중쇄 때때로 dimethylated 피크는 7 ~ 다 (35.069 다, N 말단 펩티드)에 광 dimethylated 피크 내지 때문에 무거운 dimethylated 펩타이드의 검색 작업 흐름에 통합되어야한다. 동적 변형 : 산화 (15.995 다, M), 6- 플렉스 등압 태그 (229.163 다, K). 거짓 검색 속도를 얻을 수있는 미끼 데이터베이스 검색 (예 : 1, 5 %)와 동중 태그의 기자 이온 농도를 검색 할 수있는 정량 노드를 포함합니다.
3. 통계
   1. 위해서는 전자 스프레드 시트 프로그램에 데이터 내보내기 단백질 리포터 이온 값을 정규화한다. 각 단백질은 각각 내부 표준의 내부 표준 또는 원시 리포터 이온 농도의 중간 비율로 평균 리포터 비 이온 또는 원시 리포터 이온 농도 중 하나를 나눈다. 이러한 전자 스프레드 시트 프로그램, PERS으로 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여EUS, 또는 R 샘플 조건 사이에 큰 변화를 확인합니다.

결과

cPILOT은 N 말단 및 리신 잔기에 라벨 펩티드를 화학적으로하는 아민 계 화학 제를 사용하여 시료 다중화 기능을 향상시킨다. 그림 2는 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 뇌, 심장, 간 조직의 12 플렉스 cPILOT 분석에서 얻어진 대표 MS의 데이터를 보여줍니다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 알츠하이머 병 및 야생형 생쥐 두 생물 복제이 12 ?...

토론

cPILOT는 12 개 이상의 독특한 샘플의 동시 측정을 허용한다. 펩티드의 N 말단 리신 잔기 모두 성공적인 태깅을 보장하기 위해, 반응의 각 세트에 대한 정확한 산도를 갖는 펩티드 및 라벨링 먼저 디메틸 화 반응을 수행하는 데 필수적이다. N- 말단에 선택적 디메틸 화는 (± 0.2) ~ 2.5의 pH를 갖는 의해 수행된다. 이것은 라이신의 아미노기의 PKA의 차이 및 N 말단을 이용함으로써 달성된다. pH가 2.5에서 라...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water - MS Grade	Fisher Scientific	W6-4	4 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS Grade	Fisher Scientific	A955-4	4 L quantity is not necessary
Acetic Acid	J.T. Baker	9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Ammonium formate	Acros Organics	208-753-9
Formic Acid	Fluka Analytical	94318-250ML-F
BCA protein assay kit	Pierce Thermo Fisher Scientific	23227
Urea	Biorad	161-0731
Tris	Biorad	161-0716
Dithiothreiotol (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Iodoacetamide (IAM)	Acros Organics	144-48-9
L-Cysteine	Sigma Aldrich, Chemistry	168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich, Life Science	T1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O	Sigma Aldrich, Life Science	F8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C	Sigma Aldrich, Chemistry	596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP	Sigma Aldrich, Chemistry	190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit	Protea BioSciences	SP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer	Sigma Aldrich, Life Science	T7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg)	Thermo Fisher Scientific	90061
Hydroxylamine hydrochloride	Sigma Aldrich, Chemistry	255580-100G
Standard vortex mixer	Fisher Scientific	2215365	any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges	Waters	186000383	These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model	Sigma Aldrich	57265	A 12 port model is also sufficient
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamber	Thermo Scientific	2825/2826	Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler	Sciex	-	This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer	Thermo Scientific	-	This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH
Analytical balance	Mettler Toledo	AL54
Stir plate	VWR	12365-382	Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 buffer	Fisher Scientific	06-664-261	Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer	Fisher Scientific	06-664-260	Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	05-408-129	Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	04-408-120	Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units	EMD Millipore	UFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 units	Thermo Scientific	69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å)	Bruker	PM5/61100/000	This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å)	Bruker	PM5/61200/000	This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient