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要約

ヒト多能性幹細胞（hPSC-CM）に由来する心筋細胞の電気生理学的特徴付けは、心臓疾患のモデル化および薬物応答の決定に重要である。このプロトコールは、多電極アレイ上のhPSC-CMを分離してプレートし、それらの電場電位を測定し、QTおよびRR間隔を分析するための方法を提供するのに必要な情報を提供する。

要約

心筋細胞は、現在、ヒト胚性およびヒト誘導性多能性幹細胞（hPSC）の両方から高効率で誘導することができる。 hPSC由来心筋細胞（hPSC-CM）は、ヒトの心血管疾患、特に不整脈症候群のモデリングに大きな価値を有するものとしてますます認識されている。彼らはまた、薬物スクリーニングおよび発見、安全性薬理学、そしておそらく最終的には個人化された医薬品のために潜在的に有用である薬物応答を予測するためのインビトロシステムとしての関連性を実証している。これは、患者または感受性個体からhPSC-CMをhiPSCとして誘導することによって促進されるであろう。しかし、すべてのアプリケーションにおいて、hPSC-CMの電気的特性の正確な測定および解析は、心臓イオンチャネル変異および/またはイオンチャネルを標的とする薬物による変化を同定するために不可欠であり、突然の心臓死を引き起こす可能性がある。手動パッチクランプと比較して、多電極アレイ（MEA）デバイスは、中〜高スループットの録音が可能です。このプロトコールは、hPSC-CMの2D細胞培養物を小さな凝集体および単一細胞に解離させ、それらをMEA上にプレートして自発的な電気活性を場電位として記録する方法を記載する。 QTおよびRR間隔などの特定のパラメータを抽出するために記録されたデータを分析する方法もここに記載されています。これらのパラメータの変化は、心臓不整脈の原因である突然変異を有するhPSC-CMおよび特定の薬物の添加後に予想され、心毒性リスクを有するものの検出を可能にする。

概要

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は、分化によって人体の任意の細胞型を自己複製し、実質的に生成する能力を有する1,2 。 hPSCをいくつかの心臓系統（心室、心房、ペースメーカー様心筋細胞）に分化させる方法に関する詳細なプロトコールは、3,4,5,6,7に記載されている。心筋細胞は電気的に活性な細胞であり、電気生理学的活動の詳細な知識は、心臓発達および疾患の理解に極めて有益であり得る8 。患者固有のhiPSC由来心筋細胞（hiPSC-CM）は、長いQT症候群を含むいくつかの心臓不整脈の細胞、分子および電気的特徴をモデル化および研究するために首尾よく使用されている（LQTS）9,10,11,12,13、ブルガダ症候群14 、およびカテコー​​ルアミン性多形性心室頻拍15,16 。さらに、治療上の介入を再現し、細胞病理学的表現型10,15,20,21,22を救済するために、病的なhiPSC-CMに複数の薬物が加えられている。より最近では、WT hiPSC-CMに基づくスクリーニングプラットフォームが開発されており、齧歯類の心筋細胞がhuと深く相違するため、創薬の初期段階へのヒトシステムの必要性に対応して23,24,25イオンチャンネルの発現と生物物理学に携わります26 。

この目的のために、中〜高スループットアプリケーションに適した技術が開発され実行されている。これらには、膜電位、Ca 2+過渡および歪みの光記録、インピーダンス測定（細胞収縮性の間接的測定として）および細胞外場電位（FP）測定（総説24参照）が含まれる。多電極アレイ（MEA）デバイスは、単層または心筋細胞の小さなクラスターによって生成および形成される電気波形信号（またはFP）の記録を可能にする。 FP輪郭は、心臓活動電位と、ある程度は心電図（ECG）記録27と相関する。それらは、典型的には、Na +流入および膜脱分極（R / Qピーク）に対応する初期急速な上向きストロークを示し、遅い波/プラトー相は、Ca2+流入、および優勢なK +流出（Tピーク）に対応する再分極段階を含む。 FP波形の摂動は、特定の活動電位段階の変化と相関させることができる28 。

特に、アップストローク速度や休止膜電位などのパラメータに関しては、アクション・ポテンシャルのパッチ・クランプ記録がより有益である可能性がありますが、中規模および高スループット・スケールでの実験では手動測定が可能ではなく、自動パッチ・クランプは最近hPSC -CM 29 。しかし、MEAの長期記録は研究対象の化合物への急性および慢性両方の曝露を可能にするので、hPSC-CMプラットフォームを薬物スクリーニング、発見24,30および安全性薬理学31,32に使用することが可能になりました。これは、将来の精度またはpersoの約束を保持する化粧品33 。

このプロトコールの目的は、hPSC-CMを解離させてMEAチップ上に播種し、それらのFPを測定するために必要な情報を提供することである。この手順では、各工程が最適化され、解離後の最適な細胞生存と回復、MEAプレートへの最適な細胞付着、およびパラメータの標準化された分析および定量化が保証される。特に、細胞外FP記録、QTおよびRR間隔の分析、および薬物効果の評価のための手順が説明され例示される。

プロトコル

1.溶液および試薬の調製

  1. 表1に記載の試薬を組み合わせることにより、低インスリン、ウシ血清アルブミン、ポリビニルアルコール、必須脂質（LI-BPEL）培地34,35,36を用いてhPSC-CM培地を調製する。培地を0.22μmの細孔フィルターでろ過し、4℃で2週間保存します。
  2. 200μg/ mLの濃度に達するように5mLの滅菌蒸留水中で1mgのヒト組換えフィブロネクチンを再構成し、-80℃で保存することにより、ヒト組換えフィブロネクチン原液を調製する。
  3. 1 gの酵素洗剤粉末を100 mLの温かい（〜40-45°C）溶液に溶解することにより、マイクロアレイチップからの残留細胞の除去を助けるために、1％（w / v）酵素洗剤溶液（材料表参照）脱イオン水。溶液を冷却し、4℃で保存する。fまたは1年まで。

MEAチップの滅菌（図1A）

注記：MEAのいくつかの異なる構成が利用でき、シングルまたはマルチウェル形式があります。ここに記載されているプロトコルは、8×8グリッド配列の60個の記録電極を含むシングルチャンバMEAを使用しています（材料表を参照 ）。電極の直径は30μmであり、電極間の距離は200μmである。 1つの参照電極も存在する。

  1. 脱イオン水でチップを完全にすすぎます。
  2. オートクレーブが可能なガラスペトリ皿にMEAチップを入れてください。アルミ箔で皿を包みます。
  3. 実験室用圧力鍋でチップを6分間滅菌する。開ける前に食器を冷ます。
    注：あるいは、チップを80％（v / v）エタノール1 mLに室温で15〜30分間浸して滅菌することができます。
  4. チップを細胞培養フードに置き、表面をUV光に約30分間さらす。

3.MEAチップのコーティング（図1Bおよび1C）

  1. 清潔なチップを標準的な10cmのプラスチック滅菌ペトリ皿の中に置きます。
  2. 8mLの滅菌蒸留水をペトリ皿に加えて加湿チャンバーを形成し、インキュベーターに置いたときにチップ上の培地の少量が乾燥するのを防ぎます。
  3. 電極アレイが配置されているチップの中心に心筋細胞のメッキを確実にするために、カスタムメードのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）リング（ 図1B ）を使用してください。 （PTFEリングは80％エタノールに予め保存されています。）培養フード内で、エタノールからリングをはずし、蓋のない滅菌ペトリ皿に入れ、リングをフード内で乾燥させます。
  4. 火炎滅菌ピンセットを使用して、1つのMEAチップ内に乾燥したリングを置きます（ 図1C ）。
    注：または、80％エタノールを使用してピンセットを洗い、iを乾燥させます・組織培養フードを使用する前に。
  5. ヒト組換えフィブロネクチンストック（蒸留水中200μg/ mL）の1つのアリコートを解凍し、Ca 2+およびMg 2+を含むPBSで希釈して、40μg/ mLの作業溶液を得る。 40μg/ mLフィブロネクチン50μLをリングの内側に加えることによって電極を被覆する。
    注：ヒト組換えフィブロネクチンを用いたコーティングは、最適なhPSC-CM結合を保証します。しかしながら、他のタイプのコーティングタンパク質、例えばウシフィブロネクチンまたは細胞外マトリックスタンパク質混合物を使用することができる。
  6. 10cmのプラスチックペトリ皿の蓋を閉じ、MEAチップを含む皿をインキュベーターに注意深く移す。 37℃で少なくとも1時間、または4℃/ Nでインキュベートする。
  7. MEAチップを含むディッシュを細胞培養フードに移す。 MEAチップを使用する前に、PTFEリングをずらすことなく、フード内のP200ピペットまたは真空システムを使用して50μLのフィブロネクチンを吸引します。 plaを使用するこのステップのためのヒント。電極に損傷を与える可能性があるため、固形物（ピペットチップなど）が皿の内側に触れないようにしてください。
    注：これにより、MEAチップの寿命が延びます。
  8. LI-BPEL培地（ 表1と表の表を参照 ）を均等に分注し、リングが浮遊しないようにして、950μLのLI-BPEL培地を静かに加えます。皿をインキュベーターに戻してください。

4. hPSC-CMの解離とメッキ（図2）

注記：ここに記載したプロトコールは、分化開始後約18日目にサイトカイン34を用いて単層培養で分化させたhPSC-CMを利用する。しかし、2Dおよび3DのhPSC-CM培養に適していることが証明されています。前または後の時点で分化した培養物を使用する場合、解離酵素（ 表の表を参照 ）のインキュベーション時間を調節することは、セサリー。以下の量は、12ウェルプレート形式（3.8cm 2 ）の単一ウェルについてのものである。

  1. hPSC-CMs培養液から培地をよく吸引する。
  2. 組織培養フードの下で作業しながら、Ca 2+ / Mg 2+を含まないPBS1〜2mL /ウェルを加えて培養物を洗浄する。 PBSを吸引する。
  3. 500μL/ウェルの解離酵素を添加する。 37℃で5分間インキュベートする。
  4. 1 mLのLI-BPEL /を加えて酵素を希釈する。静かにP1000ピペットを使用して掻きすることによって、hPSC-CMの単層を簡単に取り外す。細胞懸濁液を15mLチューブに集める。
  5. 1 mLのLI-BPELでウェルをすすぎ、残りの細胞および細胞凝集塊をすべて回収する。
  6. 別の2〜3 mLのLI-BPELを加えて5〜6 mLの最終容量にし、細胞塊を解離するために5 mLピペットで3〜5倍上下に静かにピペットをかけます。
    注：この時点での単一細胞への解離は、細胞の生存に影響を及ぼすため、必要ではありません。小さなクラスターの存在はより高い細胞生存率を保証する。
  7. 300×gで3分間RTで細胞を遠心分離する。
  8. 上清を除去し、余分な液体の大部分を除去しようとするが、細胞ペレットを取り除かない。
  9. 250μlのLI-BPELに細胞ペレットを再懸濁します（P1000を使用し、非常に静かにピペッティングします）。
  10. 電極アレイの上にPTFEリングの中心に細胞懸濁液を直接ピペッティングすることにより、MEAあたり〜50μLの細胞懸濁液（12ウェルプレートの1つのウェルから最大5つのMEAを調製することができる）を分配する。
    注：この段階では、細胞クラスターの存在により細胞を計数することは困難であり、使用されるhPSC-CM源に応じて、MEAあたりの細胞の総数は実質的に変化し得る。めっきしている間に、解離した細胞の雲が電極の領域を覆っていることを確認します。
  11. 慎重に37℃でインキュベーターにMEAを移し、細胞をO / Nに付着させる

5.リング除去と媒体リfreshment（図3）

  1. プレーティング後1日目に、滅菌ピンセットを使用して滅菌環境でリングを注意深く取り外します（ 図3A-3B ）。
  2. 80％（v / v）エタノールでリングをすすぎ、新鮮な80％（v / v）エタノールを含む50mLチューブに保存する。
  3. 500μLの培地をMEAチップから静かに取り出し、新鮮なLI-BPEL500μLを加える。
  4. 37℃でインキュベーターにMEAを移す。
    注：細胞は、リング除去および培地交換の1〜7日後に鼓動を開始するはずである（ 図3C ）。
  5. リング除去の1〜7日後にMEA上のhPSC-CMの電気活性を測定する。

6.信号品質をチェックします（図4）

  1. コンピュータの電源を入れ、MEAセットアップにリンクされたソフトウェアスイート（TCX-Control、MC_MEA Select、MC_Rack）を起動します。生理的温度で測定値を記録するには、TCX-Controlで温度を37℃に設定します。
  2. MEAチップfを含む皿を取り除くインキュベーターに行ってください。蓋を開け、MEAチップを取り出し、組織上に置き、残留水を吸収する。
  3. 慎重にプレートの外部接点を組織で拭き取り、100％（v / v）エタノールで湿らせた綿棒を使用して掃除し、シグナルノイズを引き起こす可能性のある残存する水分や残渣を取り除きます。
  4. MEAプレートを加熱された（37℃）記録ヘッドステージに移し、自発的な活動（ 例えば、ハードウェア：材料表 ;ソフトウェア：MC_Rack参照）を検出する。
    1. MC_Rackを開く：「編集」→「MC_Cardを追加」をクリックして新しいプロトコルを作成します。ドロップダウンメニューの[編集]を使用して、さまざまなレコーダーと表示ウィンドウをプロトコルに追加します。
      注：少なくとも10 kHzのサンプリング周波数を推奨します。私たちが使用するプロトコルには、MEAチップ全体の完全なレイアウトを持つ1つのLongterm Display Toolと、薬物効果iを取り込むために不可欠な1つのスパイクソーターが含まれていますnリアルタイム。 Spike Cutoutは、20 msの「Pre Trigger」、800 msの「Post Trigger」、2 msの「Dead Time」で調整されています。実験を開始する前にプロトコルを「.rck」ファイルとして保存して再読み込みすることができます。
  5. 「再生」ボタンをクリックして、再生モードでプロトコルを開始します。
    注：ここでは、手順6.5で保存したプロトコルをリロードすることができます。 MC_Rackでは、「ファイル」→「開く」をクリックしてプロトコル（.rckファイル拡張子）を読み込みます。
  6. 信号が明らかに目に見えるRのピークとTのピークを示す場合は、適応段階を完了するために10〜15分待つ。品質の良いトレースと悪いトレースの例を図4に示します。
    注：いずれの電極でもTピークが検出されない場合は、実験を続行しないでください。通常、これは、hPSC-CMの電気的活性が不十分であるか、または電極への細胞の付着が不良である結果である。

7. Exを開始するペリメントと録音

  1. 「記録」をクリックしてから「再生」をクリックし、ベースライン条件で10分間データを取得して定常状態を決定します。最良の信号を持つ電極に注釈を付けると、解析のために後で容易に識別してエクスポートすることができます。
  2. 薬物応答評価のために、10分ごとに薬物濃度を増加させる。一例として、hERGブロッカーE4031を1μMの最終濃度で添加する。このために、100μLの培地を除去し、培地に溶解した同じ量の10μME4031を加える。
    注：Caveroら31）が以前に実証したように、薬物応答曲線を大きく変化させる可能性があるため、薬物が溶解する量の賢明な選択が重要である。
  3. 他のすべての薬物濃度について、ステップ7.2を繰り返す。
  4. プロトコルの終了時に録音を終了するには、「停止」をクリックしてください。

8。再利用のためのMEAクリーニング

  1. 実験記録が終わったら、P1000ピペットで穏やかに培地を除去する。皿の内部に触れないでください。電極に損傷を与える可能性があります。地域の安全規則に従って廃棄してください。
  2. 洗浄ボトルを使用してMEAチップを脱イオン水ですすぎ、洗浄工程を3〜4回繰り返す。
    注：この時点では、セルがチップから完全に取り外される必要はありません。
  3. 各ウェルに1％（v / v）の酵素洗剤溶液1 mLを添加し、4℃でO / Nをインキュベートして、細胞の分離および細胞の除去を可能にする。
  4. 1日後、脱イオン水でMEAチップをすすぎ、酵素洗剤溶液および残留細胞を除去し、脱イオン水1mLを加える。クリーンMEAチップは、4℃の脱イオン水に浸して保存することができます。

9.データのエクスポート

  1. MEAセットアップにリンクされたMC_Data Toolソフトウェアを開きます。
  2. 「ファイル」→「MCを開く」をクリックします。D '。
  3. 「ツール」→「MCDからABFに変換」をクリックします。
  4. 分析のためにエクスポートする記録信号が最も良い電極を選択します。エクスポートしたファイルを保存するディレクトリを選択し、[保存]をクリックします。書き出した電極の数と記録ファイルの合計サイズによっては、書き出し手順に数分かかることがあります。

10.データ分析

  1. 電気生理学データの取得と分析プログラム（ 例： pClamp）をダウンロードしてインストールします。完了したら、分析ソフトウェア（Clampfitなど）を起動します。
  2. RR間隔計算（図5）。
    1. 2つの垂直カーソルを配置して、トレース上の関心領域を定義します。 「イベント検出」→「しきい値検索」を選択します。 図5Aに示すように、水平カーソルは、定量化しなければならないすべてのイベントを横断する必要があります。
    2. クリック＆＃39; OK 'を選択し、次に[全体カテゴリを受け入れる]を選択します。ソフトウェアはトレースを検索して、適切なすべてのイベントを探します。青い印がイベントの上に置かれます。
    3. メインイベント検出ウィンドウのパラメータを調整して、自動選択の感度を調整します。
    4. すべてのイベントが自動的に識別されたら、結果ウィンドウ（ウィンドウ→結果）に移動し、頻度データを含む「Intervent Interval」と題する列をコピーします（ 図5B ）。
  3. QT間隔の計算（図6-9）：
    1. 定常状態の状態で1つのFPの直前と直後に1つのカーソルを置きます。 「イベント検出」→「テンプレートの作成」を選択します（ 図6 ） 。
    2. FPが正しく識別されていることを確認し、[追加]をクリックします。テンプレートが下のパネルに移動します。
    3. テンプレートを '.atf'ファイルとして保存します。ファイル。このようにして、録音全体を通してソフトウェアによって検索されるテンプレートトレースが作成されました（ 図7 ）。薬物効果によってFPの形状が変わる可能性があるため、各条件ごとに1つのテンプレートを作成します。必要に応じて、トレースをわずかにフィルタリングして、2つのカーソル内に最大10.000ポイントを含めるようにします。
    4. テンプレートが '.atf'拡張子で保存されたら、 'イベント検出'→ 'テンプレート検索'を選択し、テンプレートをロードします。
    5. "Template match threshold"を調整して、選択した間隔ですべてのFPを正しく識別します。
    6. すべてのイベントが正しく識別されたら、新しい '.abf'ファイルに保存します。
  4. 分析ソフトウェアを使用してファイルを開き、Q / RピークとTピークの両方について「ピーク時間」を自動的に計算します（ 図8,9 ）。トレースにノイズが多い場合は、フィルタを適用してください。 QT間隔を計算するには、選択したスプレッドシートエディタのT値からのQ / R値。

結果

解離およびプレーティングの1日後、hPSC-CMの層は、MEAチャンバーの中心を覆う緻密で白いフィルムとして見える（ 図3A ）。リングを除去した後（ 図3B ）、  層は所定の位置に留まらなければならず、光学顕微鏡上の検査では、（収縮する）hPSC-CM層（ 図3C ）によって覆われたMEA電極が示される。細胞の物理的および電気的結合のために、分析には1つの電極（金電極）のみが使用される。

あるいは、胚様体または微小組織のような3D構造を用いて作業する場合、それらは物理的および電気的に分離されないようにメッキすることができる。顕微鏡での目視検査では、クラスター間の物理的な接続が確認されず、MEAの非同期R波によって電気的結合が確認されなかった。このc複数の独立した電極を分析することができる。

FPトレースの典型的な記録を図4に示します。特に、良好な品質のトレースは、Na +流入および膜脱分極（R / Qピーク）に対応する明確なピーク、K +流出（Tピーク）に対応する明確な再分極相​​、および高い信号対雑音比（ 図4A 、左：y軸スケールおよび図4B ）。品質の悪いトレース（ 図4A 、中央）は、hPSC-CMがMEAプレートまたは弱いhPSC-CM電気活性に付着しなかった結果である可能性があります。より良い接続のために1〜3日間待つと、信号が改善されることがあります。ただし、信号の改善が見られない場合は、このMEAを実験から除外することを推奨します。ノイズの多いトレース（ 図4A 、右）は、フィルタリング後に分析されることがあります。

ピークの検出を示す画面を目視検査することで、RR間隔の解析を成功させることができます（ 図5A、5B ）。垂直カーソルによって定義された時間間隔内に、各ピークに対応する青色マークが存在するはずである。プログラムが1つまたは複数のピークを特定しない場合は、水平カーソルを移動して分析を再実行するか、検出設定を調整してください。同様に、QT間隔の成功した分析は、FP検出を示す画面の目視検査によって同定することができる（ 図7 ）。垂直カーソルによって定義される時間間隔内に、各FP検出に対応する青色のマークが存在するはずである。プログラムが1つまたは複数のFPを特定しない場合は、FPテンプレートを再定義するか（ 図6 ）、検出設定を調整して解析を再実行してください。

抽出された個々のFPトレースまたはそれらの平均（ Figure 8）は、 図9のような特定の設定でQT間隔値を得るために使用することができる。疾患とWT hPSC系統（ 図10A ）においてQT-RR関係の解析が有意義であり、有意義であり、QT間隔補正の必要性および/または効果を評価することができる（ 図 10B〜10D）。 LQTSを引き起こす突然変異を有するhPSC-CMは、WT対照と比較して延長されたQT間隔を有する（ 図11A ）。 hERC遮断薬によるhPSC-CMの治療は、QT間隔の延長をもたらす（ 図11B ）。逆に、hERG活性化因子による治療は、QT間隔の短縮をもたらす（ 図11C ）。最後に、hPSC-CMの鼓動頻度に影響を及ぼす薬物による治療は、RR間隔の変化として目に見えるはずである（ 図11D 、RR間隔の短縮）。

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図1：MEAチップの滅菌とコーティング （ A ）MEAチップをオートクレーブ可能なガラスペトリ皿に置き、アルミホイルで包み、6分間蒸し、UVに30分間暴露することを含む、滅菌プロセスを表す図式。 （ B ）カスタムPTFEリングの上部（左パネル）および側面（中パネル）リングは、MEAチップの中心にその位置決めを可能にする4つのフラップを含み、内径は0.4cm（右パネル）である1.2cmの外径を有する。 （ C ）標準的なプラスチックシャーレにチップを置き、MEAチャンバーの外側に8mLの脱イオン水を加え、PTFEリングをチャンバーの中央に置き、フィブロネクチンで電極アレイをコーティングすることを含む、MEAチップの調製を表す概略図。 。インキュベーション時間の後、フィブロネクチンを除去し、培養培地と交換する。t = "_ blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図2：hPSC-CMの解離およびメッキ。 hPSC-CMの酵素的解離、遠心分離、再懸濁、およびMEAチャンバーの中央のメッキのプロセスを表す模式図。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-3073
図3：hPSC-CM層を備えたMEAチップ （ A ）リングおよびhPSC-CMの層を含むMEAチップの上面図。リング除去後のMEAチップの側面図（ B ）。 （ C ）マイクロプレート上にメッキされたhPSC-CM層の明視野像電極アレイ; 4倍の倍率。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-3522
図4：hPSC-CMのMEA記録。 （ A ）MEAで記録された代表的なトレースは、高い信号対雑音比（左）、明らかに見えるR / QおよびTピークのない品質の悪いトレース（中）、R / QおよびTピークを伴う良好な品質のトレースを示すR / QとTのピークが明瞭に見えますが、信号対雑音比が低いノイズのあるトレース（右）があります。 （ B ）hPSC-CMを用いたMEA実験中に記録できる、異なる形態の良好なFPトレースの代表的な例。陰影の付いた領域は、分析中に測定されたQT間隔を表す。 MEAにおけるFPは、第1の誘導体アクションポテンシャル28の eと比較すると、完全な活動電位再分極に近いT波選択の理論的実証として、赤い点線で示されたFPトレースの積分を計算した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図5：RR間隔の計算 （ A ）解析ソフトウエアを用いた自動ピーク検出（上）とデータ抽出（下）によるRR間隔解析の例（表の表を参照）。垂直カーソルは、関心のある時間間隔を識別し、水平カーソルは、青色のマークによって検出および識別されるすべてのイベントを横切っている。 （ B ）拡大された欄は、RR間隔を計算するために使用される抽出されたデータを示す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-4669
図6：FPテンプレートの作成単一のFPの前後に配置された垂直カーソルを使用したテンプレート選択の例。このテンプレートは、FPの自動識別に使用されます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-5015
図7：FPテンプレートの自動識別。 2つの垂直カーソルで定義された間隔でのテンプレート検索の例。検出されたすべてのイベントは青色のマークで識別され、yは挿入図に重ね合わされている。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図8：FPパラメータの定量。最初の2つのカーソル内で手動で識別されたRピークと、最後の2つのカーソル内で手動で識別されたTピークを持つ、保存されたイベントの分析。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図9：分析ウィンドウ Rピークを検出するための統計ウィンドウで使用されるパラメータ。 Tピークの検出のために、カーソルおよび（必要であれば）poを変更する珍しいこの図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図10：QT-RRの関係。 （ A ）WT（LQT1 corr ）とLong QT症候群1型（LQT1 R190Q ）のhPSC-CM間のQT間隔とRR間隔の異なる関係の例。陰影区域は、RR間隔の同じシフトが、LQT1疾患ラインのQT間隔のより大きなシフトを生じさせ、したがって不整脈感受性を増加させる可能性があることを示す。 （ B ）7つの異なるhPSC系のCMにおけるMEAで測定された未補正のQTとRR間隔との関係。 Bazett（ C ）またはFridericia（ D ）の式に対するQT補正の効果は、QT-RRの傾きの変化として示され、奇妙な関係。図は参考文献30から適応されている。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図11：疾患または薬物誘発QTおよびRR間隔変動。 （ A ）Long-QT症候群（LQTS）突然変異を有する患者由来のhPSC-CMにおけるQT間隔の延長の例は、その同質遺伝子WT対照と比較して。 （ B ）薬理学的hERGブロックでのhPSC-CMにおけるQT間隔の延長の例。 （ C ）hERG活性化剤の用量を増やして治療したときのQT間隔の短縮。矢印は短縮の方向を示します。 （ D ）薬物誘発RR間隔短縮の例。パネル（C）は、参考文献> 30。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

低インスリン、BSA、ポリビニルアルコール、必須脂質（LI-BPEL）培地
成分 100 mLの量
IMDM 43mL
F12 43mL
アスコルビン酸2-リン酸（蒸留水中5mg / mL） 1 mL
細胞培養サプリメント（L-グルタミンの直接代用品） 1 mL
ペニシリン/ストレプトマイシン 0.5mL
フェノールレッド 1 mg
タンパク質を含まないハイブリドーマ培地-III（PFHMII） 5 mL
BSA（IMDM中10％wt / vol） 2.5mL
PVA（蒸留水中5％wt / vol） 2.5mL
化学的に定義された脂質濃縮物（CDLC） 1 mL
インスリン - トランスフェリン - セレン - エタノールアミン（ITS-X）100X 0.1 mL
α-モノチオグリセロール（1mL IMDM中13μL） 0.3mL
試薬を組み合わせ、0.22μmの細孔フィルターで濾過し、培地を4℃で2週間保存します。

表1：Li-BPEL媒体組成。

ディスカッション

このプロトコルは、MEAを使用してFPを測定するためにhPSC-CMを解離および準備する方法を示しています。 hPSC-CMは、通常、FPとして測定することができる自発的な電気的活動を示し、鼓動頻度、QT間隔持続時間、および不整脈事象に関して有意なデータを提供することができる。

2D心臓分化培養物の解離は、MEA上の鼓動層を再創造するために必要であり、重要な段階である。繰り返されるピペッティングおよび/または積極的な解離酵素処理による機械的ストレスは、高い細胞死亡率、MEAプレートへの付着の失敗、および自発的な電気活性の欠如をもたらし得る。このプロトコルは単層培養に最適化されています。しかしながら、EB洗浄後のPBS洗浄および解離酵素とのより長いインキュベーション時間のような、わずかな改変を伴う三次元（3D）培養物（ 例えば、胚様体またはEB）にも同様のアプローチを用いることができる。インポート2Dおよび3Dの両方の分化培養において、分化した細胞が高ければ高いほど、より長いインキュベーション時間は、細胞外マトリックス沈着の増加のために細胞を分離することである可能性がある。

FPパラメータを定量化するために本明細書に記載されたプロトコルは、心臓薬用の用量反応曲線を生成するために使用することができる。最近、Cavero et al。 図31に示すように、薬物の開始濃度は、MEA測定の結果に深刻な影響を及ぼす可能性がある。したがって、結果の精度と信頼性を向上させるために、以下のことを提案する：1）不可逆活性化剤/ブロッカーの場合、試験する薬物を含む比較的多量の培地を使用する。より詳細には、MEAチップから培地容量の10〜50％を除去し、薬剤が予め適切な濃度で溶解されている等容量の培地を加える。この場合、最終的な薬物濃度を計算するためには、培地除去後の濃度の変化。 2）可逆的アクチベータ/ブロッカーの場合、100Xストック溶液から各薬物用量の10μLを加える。

心臓分化プロトコールの大部分は、結節様、心房様および心室様の心筋細胞の多様な混合集団をもたらし、心室型が最も代表的である。これは、特定の心筋細胞サブタイプに影響を及ぼす心疾患をモデル化する場合、または心臓サブタイプ特異的イオンチャネルに作用する薬物をモデル化する場合に制限を構成し得る。いくつかの研究では、心臓分化3,5,37,38の間により制御された仕様を指示するための条件が最適化されているが、それらのより広い適用性は依然として調査中である。

さらに、分化の様々な効率（異なる実験およびdi異なるhPSC系統）が39,40,41,42,43,44で観察されることがある。表面タンパク質発現35,45（蛍光補助細胞選別または磁気ビーズ選択46,47 ）および代謝選択44,48に基づく心筋細胞富化戦略は、任意の（遺伝子改変または電気信号を改善するために、hPSC-CMのhPSC-ライン事前メッキを行った。

hPSC-CMはヒト成人心筋細胞4,49と比較して未熟であることは周知であるが、それらはr特定の疾患に関連する変化（ 例えば 、チャネル障害）19,20,50および薬物誘発応答（ 例えば、心臓イオンチャネル遮断薬）4,51。さらに、未成熟細胞は解離が容易であり、解離およびプレーティング後に成人の心筋細胞よりも良好に回復する44したがって、hPSC-CM未成熟はこの点で利点として報酬を受ける可能性がある。しかし、 例えば、遅く発症した心臓疾患を予防し、成人の心筋細胞の薬物反応を忠実に再現するためには、より成熟した機械的、代謝的および電気的hPSC-CM状態が得られるべきである。これらの細胞を成熟させる方法には、培養時間の延長、機械的歪み53 、電気的ペーシング54 、小さな分子55、3D培養56 、他の細胞型57との共培養、さらにはこれらのアプローチの組み合わせ58 ;今日まで、これらのアプローチのいずれも大人様の表現型を導かなかった。

未熟な機能の一部として、hPSC-CMは電気的自動性を示します。ここでは、QT間隔とRR間隔を正確に定量化する方法について詳しく説明します。自発的な電気活動を測定することの1つの制限は、hPSC-CMが異なる拍動周波数を表示する場合、QT間隔の比較が難しいことである。この場合、BazettまたはFridericiaの公式を使用して周波数のQT間隔を補正することができます。しかし、これまでに報告されているように、補正方法自体に起因する可能性のあるバイアスを除外するために、生データと訂正データの両方についてQT間隔とRR間隔をプロットすることにより、長軸回帰分析を実行することを強く推奨します。

ここに提示されたプロトコルは、前述の方法59,60と共に、手順の標準化およびhPSC-CM FPの分析を助け、データ再現性を改善し、実験室間の結果のより良い比較を可能にする。

開示事項

CLMはPluroomicsの共同設立者であり顧問です。出版コストの一部はマルチチャネルシステムの対象となっていました。

謝辞

この研究は、以下の助成金によって支援された：CVON（HUSTCARE）：オランダ心臓血管研究イニシアチブ（オランダ心臓財団、オランダ大学メディカルセンター連盟、オランダ保健研究開発機構、オランダオランダ科学アカデミー）。欧州研究評議会（ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC）。私たちは、hPSC心臓分化の助けをしてくれたE. Giacomelli（LUMC）に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Biological safety cabinet/laminar flow-hoodCleanair
MEA2100 in vitro recording systemMulti Channel Systems
CO2 cell-culture incubatorSanyoMCO-15A
CentrifugeHitachihimac-CT6EL
Leica stereomicroscopeLeica MicrosystemsMS5
Handheld pipetman (P-10 (10 μL), P-200 (200 μL), P-1000 (1,000 μL))Gilson International
Filter tips (10 μL, 200μL, 1,000μL)Corning4807 (10 μL), 4810 (200μL), 4809 (1000μL)
Disposable bottle top filter (0.22 μm pore size)MilliporeSCGVU02RE
Sterile plastic pipetteGreiner Bio-One606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL)
TweezersDumont
Autoclavable Petri dishesVWR/ Duran Group391-0860
MEA chipMulti Channel SystemsMEA200/30iR-Ti-gr
Phosphate-buffered Saline (PBS) calcium, magnesiumThermo Fisher Scientific14040-091
Phosphate-Buffered Saline (PBS) no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190-169
Human recombinant fibronectinTebu-BioJ64560
Custom-made polytetrafluoroethylene (PTFE) MEA ringsLUMC: department of Instrument Development
Dissociation enzyme - TrypLE Select 1xThermo Fisher Scientific12563-029
Tergazyme enzyme detergentSigma-AldrichZ273287-1EA
Distilled WaterThermo Fisher Scientific15230-089
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents for LI-BPEL medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Thermo Fisher Scientific21056-023
F12 nutrient mixture (Ham)Thermo Fisher Scientific31765-027
Ascorbic Acid 2-phosphateSigma-AldrichA8960
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-038
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15070-063
Phenol RedSigma-AldrichP3532
Protein-free Hybridoma Medium-II (PFHMII)Thermo Fisher Scientific12040-077
Bovine Serum Albumin (BSA)Bovogen Biologicals AustraliaBSAS05
Poly(Vinyl Alcohol) (PVA)Sigma-AldrichP8136
Chemically-defined Lipid Concentrate (CDLC)Thermo Fisher Scientific11905-031
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100xThermo Fisher Scientific51599-056
α-MonothioglycerolSigma-AldrichM6145
NameCompanySoftware versionComments
MC_RackMulti Channel Systems4.6.2Alternatively, data can be recorded using Cardio2D or MC_Experimenter (MultiChannel Systems)
TCX ControlMulti Channel Systems1.3.4
MEA SelectMulti Channel Systems1.3.0
MC_Data ToolMulti Channel Systems2.6.15Alternatively, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) can be used when custom data export is required (HDF5, EDF, etc.)
ClampfitMolecular Devices7.0.0Used in step 10.1 for analyzing, graphing, and formatting of all of data. To use Clampfit, download and install the electrophysiology data acquisition and pClam (latest version, 10.7.0), available on the Molecular Devices Website. Once complete, launch the software Clampfit. Alternatively, data can be analysed using Cardio2D (MultiChannel Systems) or MatLab custom code.

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