JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

および Aβ25 35 の注入による凝集、原線維変化を組み合わせたラットの空間記憶障害、神経細胞の病理学的変化、神経のアミロイド β 蛋白 (a β) 負担の評価によるアルツハイマー病を模倣するプロトコルです。三塩化アルミニウムと遺伝子組換えの人間成長因子 β 1 を変換します。

要約

アルツハイマー病 (AD) はゆっくりとメモリを破壊してニューロンの損失と構造変更を伴う不可逆的、進行性の脳の病気です。世界中のアトピー患者さんの増加に伴い、病理・疾患の治療国際製薬産業の焦点となっています。したがって、研究所の広告を模倣する動物モデルの確立は、非常に重要なのです。

ここでは、ラットの動物で広告の模倣を確立するための詳しいプロトコルについて述べるモデルがアミロイド β タンパク質 25-35 (Aβ25-35) 三塩化アルミニウム (AlCl3) と anterodorsal の視床核の脳室内注入遺伝子組換えヒト成長因子 β 1 (ヒトリコンビ β 1) ラットへの変換の注入。広告の関連マーカーを測定し, を含む: 神経もつれ (NFT) 生産と神経 β 構造神経構造空間記憶。このラットのモデル空間記憶障害、神経細胞の構造と下部組織の病理学的変化、ニューロン細胞内の a β の負担、NFT 集計例を示します、神経の構造と機能障害の臨床に近い模倣アトピーの患者さん。したがって、提示された広告ラット modelprovides 広告の薬剤のスクリーニング、神経病理学、神経機能を探索するため生体内で貴重なツールです。

概要

広告が主な臨床的症候群として漸進的な記憶喪失と、慢性で進行性の神経変性疾患であることが知られています。一般病理学では神経組織の萎縮、神経細胞シナプス損失と神経細胞の構造と機能障害、すべては開発と広告1,2の臨床症状に関与しています。動物の脳室内投与による a β を注入した頃、いくつかの神経毒性のイベントはニューロンの損失、カルシウム恒常性の中断、ニューロンのアポトーシスおよび活性酸素種の過剰産生3を含む脳で発生するとされます。複数の要因は、AD の発症に関与しているし、広告のより良いモデルを確立することが不可欠といえます。

生体内で模倣広告モデル Aβ25 35、AlCl3、ラット ヒトリコンビ β 1 の anterodorsal 視床核注入併用の脳室内投与を確立するための詳しいプロトコルが記載されています。このラットの modelhighly 模倣人間の神経機能と記憶障害、ニューロンの損失や被害、アポトーシス、細胞内 a β の負担、NFT 集計4,5,6など広告の形態病理発生,7,8,9.、AlCl3は可溶性 a β を防ぎますに堆積した a β とヒトリコンビ β 1 が堆積した a β の生産を促進し、広告発生10を促進します。ニューロンにいくつかの要因からこの攻撃は、広告の複数の病因に基づきです。

実験全体 86 日間のスパン:図 1動物の外科手術、動物モデルのスクリーニング、動物の空間記憶のテスト、サンプル準備の時点で、実験的なデザインのタイムラインを示しています。操作の最初の日、ヒトリコンビ β 1 は anterodorsal の視床核に microinjected だった。操作の 2 日目、Aβ25 35、AlCl3が microinjected 側脳室に毎日朝 14 の連続した日の午後、5 日間連続それぞれ。すべてのラットは、術後後 45 日間の回復を許可されました。モリス水迷路は、記憶障害と成功モデル ラット用画面にラットの空間記憶を評価するために使用されました。ラットを受けた水迷路 1 日あたり 2 試験とトレーニングの 4 日連続とトレーニングの日 4、ラットは記憶障害のモリス水迷路のパフォーマンスを評価しました。すべてのラットは動物モデルのスクリーニングの後 37日を供給する続けた。ラットの空間記憶は以上 7 日間連続、手術後 85 日 79 日からモリス水迷路の中でテストされました。すべてのラットが脳のサンプル準備のための 86 日斬首で犠牲になった。

figure-introduction-1582
図 1。実験的なデザインのタイムライン。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

プロトコル

このプロシージャは、1988 年 10 月 31 日の州委員会の科学および技術の中国が発行した実験動物管理の規則に従ってだった11。科学者は、設立し、機関と国立動物規制組織によって承認されたガイドラインに従う必要があります。

注: 動物・試薬: 4 ヶ月歳雄 Sprague-dawley ラット (300-350 g) はこの実験のために供給されました。すべてのラットは、グループ (4 またはケージごと 5) 温度 23 ± 1 ° C 12 時間の明暗サイクルで収容されました。食料と水は、利用可能な自由をだった。ラット 7 日間、プロシージャが実行される前に、の住宅の条件に順応しました。Aβ25 35 1 mg/mL に 1 %dmso 生理食塩水に溶解し、超音波発振器を完全に溶解するまでに 5 分間超音波処理します。AlCl3とヒトリコンビ β 1 がそれぞれ 1% と 0.1 mg/mL の生理食塩水に溶解しました。コンゴ赤、銀製硝酸塩および他の化学物質分析成績普通商業ソースから購入したと。

1. 手術

注: 20 雄 Sprague-dawley ラット側脳室と anterodorsal 視床核に合成 a β で microinjected、合成 a β 投与群として指定します。別 20 ラット同じ操作を受けたが 0.1 %dmso 生理食塩水マイクロインジェクションを受け取った、sham グループとして指定します。

  1. 吸入することによって 100% イソフルランとラットを anaesthetize し、脳定位装置に抑制します。
  2. 手術用ハサミで、頭の頂点に毛皮を剃るし、iodophor で消毒します。頭に使い捨て手術用タオルを取り上げてください。
  3. 手術柳葉とはさみ中央縦頭蓋骨に沿って頭の皮膚に切開を行います。
  4. 皮下組織と筋膜を分離、出血を停止するための滅菌乾燥綿と頭蓋骨 calvarium を一掃し、前マーカーペンで印をつけます。
  5. ラットを参照して脳定位地図12;原点として前を考える 3 つのポイント、anterodorsal の視床核 (ad) をマーク (後方 (P): 前 2.0 mm; 横:l: 正中線に 1.4 mm) 固定 1 つねじ、側脳室 (LV) エリア (ヒトリコンビ β 1 を注入します。後方 (P):; 前に 0.8 mm横:l: 正中線 2.0 mm) Aβ25 35 と AlCl3 と場所を固定 2 番目のネジを注入するため (フロント (F): 前 2.0 mm; 横:l: 正中線に 1.5 mm 厚)。
  6. 優しく柔軟な骨ドリルと頭蓋骨の上記の 3 つの点で示される 3 つの直径 1 mm の穴をドリル (1.5。 ステップ)。脳組織を刺しを避けるために必要なより深いを台無ししてください。
  7. 出血を止めるし、繰り返し滅菌乾燥綿と頭蓋骨の表面をきれいにします。
  8. 4.6 mm の深さで脳に、マイクロ注入ポンプにリンクされている針を挿入し、優しく 1 μ L を注入ヒトリコンビ β 1 (10 ng) 広告領域に。注射後の針 2 分の滞在し、針 (補足ファイル 1) をゆっくりと抜きます。
  9. 広告と 2 番目のねじ固定の頭蓋骨の場所の点で示される、頭蓋骨に 2 本のネジを修正 (1.5 で指定する。 手順) を小型のドライバー。脳組織を刺しを避けるために必要なより深いを台無ししてください。
  10. 高圧による消毒後ガイド カニューレにダミーのカニューレを挿入、カニューレ注入装置 (補足ファイル 2) を組み立てます。
  11. 頭蓋骨の穴 (補足ファイル 3) LV エリアにラットの脳定位固定装置のカニューレ ホルダーの助けを借りて 4.6 mm で脳にステンレス鋼チューブ ガイド カニューレを挿入します。
  12. ミックス 1 mL あたり 1.5 g の割合で義歯基本水と義歯床用基材は、ガイド カニューレ プラスチック台座と皮膚感染症を回避するため全体の皮膚切開のカバーまでガイド カニューレを固定する 2 本のネジをカバーするペーストを置きます。
  13. 操作の 2 日目、小動物麻酔器を用いたイソフルラン吸入とラットを anaesthetize します。ダミーのカニューレを引き出すガイド カニューレに内部カニューレを挿入し、内部カニューレを固定するネジを固定。
  14. 内部カニューレにポリエチレン管のインジェクション ポンプをリンクするをセットし、1 μ L/分 Microinject Aβ25 35 または LV へ AlCl3 に注入速度を調節します。
  15. 4 μ g (1 μ L) を microinject、午後のイソフルラン麻酔下で 5 日間に毎日朝と 3 μ L AlCl3 (1%) で 14 日 Aβ25 35。
  16. 射出が完了後 5 分を待つ、優しく内部カニューレを引き出すし、再びガイド カニューレにダミーのカニューレを挿入します。
  17. (これは最後の Aβ25 35 の注射日に対応) 15 日目術後のカニューレの注入システムを解体します。優しく外科はさみ鉗子と義歯ベース材料ソリッドを削除、2 本のネジを外し、ガイド カニューレを抜く、betadine で傷を消毒します。骨セメントと頭蓋骨の穴を埋めるし、単純な縫合法で皮膚を縫合します。
  18. 偽手術群と同じ操作を実行し、0.1 %dmso 生理食塩水を microinject します。
  19. 術後の看護
    1. 術後後 1 檻あたり 2 匹のラットを家し、30 日のための食糧を提供します。
      注: 偽運営グループ生き残った (90% の成功率の操作)、18 のラットと生き残った扱われる合成 a β のグループ (操作の 95% の成功率) で 19 ラット。

2. 正常モデルのラットとモリス水迷路空間記憶の評価のためのスクリーニング

  1. モリス水迷路
    注: モリス水迷路は、ラットの空間記憶13を評価するために使用されました。モリス水迷路は、直径 120 cm、深さ 50 cm ステンレス鋼円形タンクです。水迷路試験は、行動神経科学 j. ヌネス14で説明されている「ゴールド スタンダード」のパラダイムに基づいて行った。
    1. 食品着色料を数滴でプールの水を黒きます。
    2. 31.5 cm で水と温度 23 ± の深さを維持 1 ° C
    3. 水面下 1.5 cm の円形の透明なプレキシ ガラスのプラットフォームを設定します。
    4. 水迷路試験中は水迷路の周りのすべての空間信号、変数を維持します。
    5. わかりやすいデータ収集のための架空の線によって 4 同じ象限にプールを分割します。
    6. 水迷路の第一象限 (Q1) に隠されたプラットフォームを配置します。
    7. コンピュータ ベースのグラフィック分析ソフトウェアにリンクされている水迷路上ビデオ カメラを通じて水泳行動 (待機時間、軌道、または交差数によって測定) ラットをキャプチャします。
  2. 成功モデル合成 a β 投与ラットのスクリーニング
    1. 手術の日 45、モリス水迷路画面の記憶障害と成功モデル ラットとスクリーニング率 (SR) を収集する連続 4 日間トレーニングを実行します。
      注: SR は、各合成 a β 投与のラットの平均遅延時間として定義され、sham 群ラットは水の下で隠されたプラットフォームを見つける表面の水の 4 日目のトレーニングを迷路。隠されたプラットフォームを検索する各合成 a β 投与のラットの平均待機時間は、"a"と"B"はラットの水迷路トレーニング、次の方程式での 4 日目に隠されたプラットフォームを見つけるための偽手術群の平均待機時間。
      figure-protocol-3875
      SR が 1 つの合成 a β 投与ラットの 0.2 を超える頃、ラットは成功モデル ラット合成 a β 投与ラット15のメモリの障害とみなされました。日中のメモリ パフォーマンス 2 試験のデータに隠されたプラットフォームを見つけるためのラットの平均値を求めた。ラットが迷路水槽と 60 の内で隠されたプラットフォームの検索で泳ぐことができました。 そのモーリス水迷路試験のプロセスが設計された s。ネズミが 60 の内で隠されたプラットフォームを確認していないかどうか s、それからラットは、実験者の手でプラットフォームに置かれました。ラットに隠されたプラットフォームに達したとき (単独または、アシステッド)、ラットがさせた滞在 20 s。ラットだったタンクから削除され、10 の物理的な回復を許可し、s 2 の試験の間。

3. 神経検査

  1. イソフルラン麻酔下の日 86 ポスト外科斬首 (図 1) でラットを安楽死させます。
  2. 氷に脳を置いて、そっと、縫で 2 つの半球を分けます。視交叉とニューロン ヘマトキシリンとエオシン (HE)、コンゴ赤、または硝酸銀光顕微鏡観察のための 4% のホルムアルデヒドの修正の左の脳半球はステイン (セクション 4-6 を参照) を取る。電子顕微鏡観察 (セクション 7) の 2.5% グルタルアルデヒドで右半球の海馬 CA1 領域を修正します。
  3. 光/電子顕微鏡試料の調製、前述の16,17として脳を処理します。

4. 神経彼を汚す

  1. ヒューム フードの蒸留水にグラデーション アルコール (100%、95%、90%、80%、70% アルコール) と各スライド (各 20 分) を deparaffinize します。
  2. ヘマトキシリン (0.5 %w/v)、3 分のため、スライドから非連結の色素を削除する水道水で洗い流し。
  3. 1 アルコール 0.1% 塩酸で洗浄無染色核の色を削除する s。
  4. 背景に明るい青まで 2 分の 0.5% アンモニア溶液に浸します。
  5. 1 分 1% エオシン染色。
  6. グラデーション アルコール (70%、80%、90%、95%、100% アルコール) で 5 分間脱水します。
  7. キシレンでクリアし、メディアを樹脂製マウントをマウントします。
  8. 観察し、実験的なデザインに目がくらんで人によって光学顕微鏡で海馬の中間の CA1 0.125 mm 単位および 0.0352 mm2 400 倍の倍率で大脳皮質の HE 染色の生きている神経細胞を数えます。

5. コンゴ赤染色ニューロン a β 負担を試金するため

  1. ヒューム フードの蒸留水にグラデーション アルコール (100%、95%、90%、80%、70% アルコール) と各スライド (20 分) を deparaffinize します。
  2. 作業ソリューション (0.5 g コンゴ赤、80 mL のメチルアルコール、20 mL glycerinum) コンゴ赤染色 20 分。
  3. 5 分間蒸留水ですすぎ。
  4. 3 のアルカリの 80% のアルコール溶液 (0.2 g アルコール/100 mL の水酸化カリウム) ですぐに区別する s。
  5. 蒸留水で 5 分ごと 2 回すすいでください。
  6. 3 分のギルのヘマトキシリンで対比染色。
  7. 2 分間水道水ですすいでください。
  8. アンモニア水に浸し (水道水とよく混合する水酸化アンモニウムを数滴を追加) 30 s またはセクションが青色に変わります。
  9. 5 分間水道水ですすいでください。
  10. グラデーション アルコール (70%、80%、90%、95%、100% アルコール) で脱水します。
  11. キシレンでクリアし、メディアを樹脂製マウントをマウントします。
  12. 観察し、実験的なデザインに目がくらんで人によって光学顕微鏡で 400 倍の倍率でコンゴーレッドで染色のセルをカウントします。

6. 銀製硝酸塩の汚損ニューロン NFT 形成を試金するため

  1. ヒューム フードの蒸留水にグラデーション アルコール (100%、95%、90%、80%、70% アルコール) と各スライド (20 分) を deparaffinize します。
  2. 20% 硝酸銀溶液と暗闇の中 20 分のキャッピング剤に浸します。
  3. 2 回、各時間に 5 分の蒸留水で洗浄します。
  4. 銀アンモニア溶液に浸します。20% 硝酸銀溶液、アンモニア溶液にドロップし、ソリューションが明確に濁度からまでを追加します。同時に、15 分のガラス棒を使ってソリューションをかき混ぜるし、2 分間水酸化アンモニウム 1% 希釈に入れます。
  5. 軸索の黒いブロックが見られるまで 3-7 分の現像作業液にスライドを配置します。
  6. 1 分の希釈 0.1% アンモニア溶液に浸すし、1 分の水で洗い流し。
  7. 処分するとチオ硫酸ナトリウム 5 %2 分と 5 分の水で洗い流し。
  8. グラデーション アルコール (70%、80%、90%、95%、100% アルコール) で脱水します。
  9. キシレンでクリアし、メディアを樹脂製マウントをマウントします。
  10. 観察、実験的なデザインに目がくらんで人によって光学顕微鏡で 400 倍の倍率で硝酸銀染色用のセルを記録します。

7. 海馬ニューロンの微細構造計測

  1. 複数のキューブ (1 mm3x 1 x 1) にラット海馬 CA1 を切り取り、4 ° C で 2 時間 2.5% グルタルアルデヒドで置く
  2. (PH 7.2 では、時間ごとに 10 分) 時間 PBS 3 つのキューブをすすいでください。
  3. 4 ° C で 2 時間 1 %osmic 酸でキューブを修正します。
  4. 二重蒸留水 3 でキューブをリンス (各時間 10 分) x。
  5. グラデーション アルコール 50%、70%、90% (10 分ごと)、100 %2 回 (各時間 15 分) を脱水します。
  6. 酸化プロピレン 2 回 (各時間 15 分)、プロピレン酸化物: 1:1 (たびに室温で 60 分) 樹脂とプロピレン酸化物: 樹脂 1:4 (たびに室温で 60 分) で交換してください。樹脂 (120 分、室温で) に浸します。
  7. EPON 812 に埋め込むし、重合 (5 時間/35 ° C、5 h/60 ° C、5 h/80 ° C)。
  8. グリコールメタクリル セクション (1 μ m) をカット、メチレン ブルーで染色し、顕微鏡下でローカライズします。
  9. 超薄切片を染色 (50 nm) 酢酸ウラン o と鉛のクエン酸と。
  10. JEM 1400 電子顕微鏡と収集画像の下を確認します。

結果

すべてのデータは、SEM. SAS/STAT パッケージが統計解析の計算に使用された平均 ± として掲載されています。遅延メモリ集録とメモリ再学習テストで隠されたプラットフォームを見つけることのグループの違いは、双方向の分散分析 (ANOVA) で繰り返し測定によって分析されました。プローブの試験とニューロンの数のグループの違いは、ダンカンの複数範囲テスト続いて一方向の分散分析によって分析されました。p < 0.05 は、統計的に有意な18と考えられていた。

合成 a β 投与群の記憶障害と成功モデルのラットのためのスクリーニング:

Sham 群ラットは常に自由に泳いで図 2AA1 と 2AA2のショーで合成 a β 投与群のラット (図 2AB1、AB2) 結果の適応の水泳プールの周囲に常に泳いで、モリス水迷路。メモリ障害モデルラットのスクリーニングの 4 日間、すべてのラットは隠されたプラットフォーム (待機時間) (図 2B) を検索する時間を徐々 に減少していた。日に SR (これは各合成 a β 投与ラットのラット隠されたプラットフォームを見つけるための偽運営グループ遅延に基づいていた) 0.2 以上であった場合、4 のモリス水迷路トレーニング、その後合成 a β 投与ラットが正常と考えられていたメモリ障害モデルラット。各グループの成功モデル スクリーニング。 6 ラットを渡される操作を生き残った 19 ラット (94.70%) の 18 は次の実験のために選ばれました。

figure-results-1075
図 2.成功モデル ラット合成 a β 投与群で記憶障害のスクリーニング使用してモリス水迷路トレーニング。モリス水迷路のラット (A) 適応のスイミング軌道。(AA1-AA2)偽運営グループ(AB1-AB2)合成 a β 投与群。モリスの水のスクリーニング試験の連続 4 日間隠されたプラットフォームを検索に (B) の平均待ち時間は、sham グループおよび合成 a β 投与群のトレーニングを迷路します。 図を参照の 4 から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

合成 a β がラット メモリ集録とメモリ再学習障害を引き起こした:

ラット メモリ集録は、モリス水迷路試験は、79 と 80 日ポスト手術に対応の 1 と 2 の日に位置決めのナビゲーション裁判によって決定されました。トライアル メモリ集録の 2 日間、すべてのラットは、隠されたプラットフォームを見つけるため徐々 に減少の遅延を展示しました。図 3のように、隠されたプラットフォームを見つけるため合成 a β 投与群の遅延は、360.67%、558.28% (F (1, 5) = 238.67, p < 0.01) モリス水の 1 と 2 の日に偽手術群より大きいそれぞれのテストを迷路します。これは、合成 a β がラットの記憶獲得障害を引き起こすことができることを示します。

82、83、84 の日ポスト手術に相当するモーリス水迷路試験の日 4、5、および 6 に試用の逆転によって検定したラット メモリの再学習します。図 3に示すように、隠されたプラットフォームを見つけるため合成 a β 投与群の待ち時間だった偽手術群よりも 306.20%、650.16%、936.92% の長い時間 (F (1, 5) = p < 0.01 138.76)。これは、合成 a β が再学習障害ラット (図 3) メモリを高めることができることを示しています。

figure-results-2682
図 3.合成 a β 引き起こしたラット メモリ獲得と記憶障害を再学習します。位置決めのナビゲーション トライアルは、モリス水迷路試験で 1 と 2 の日に達成を水泳 2 日連続メモリ獲得を評価する使用されました。これらは 79 と 80 日ポスト手術に行った。逆転のトライは、メモリ 4、5、および 6 の日操作の 84、83、82 日間に相当するモーリス水迷路試験スコアを水泳 3 日間連続で再学習を評価する使用されました。線グラフは、モリス水迷路試験で 1、2、4、5、および 6 の日に各グループの隠されたプラットフォームを見つける平均待機時間を表示します。双方向の分散分析によって分析したデータ (日グループ ×) 繰り返し測定で。意味 ± SEM. n = 6。**p < 0.01、sham グループ対。図を参照の 4 から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

合成 a β は、ラットの記憶保持障害を引き起こされます。

ラットの記憶は、81 の日ポスト手術に相当するモーリス水迷路試験の 3 日目にプローブ試験により測定しました。1 日のメモリ保存試験、合成 a β 投与した少ない水泳時間、距離を泳いで、交差 60 第 1 四半期数 s は、それぞれのそれらより 32.14%、30.11%、78.95% (p < 0.01) に対応した、偽運営グループ (図 4A、4 b)。これらの結果は、合成 a β がラットの記憶保持障害を作り出すことができることを示します。

figure-results-3837
図 4.合成 a β がラットの記憶保持障害を生成します。プローブ試験日 81 ポスト手術を実施したモリス水迷路試験で 3 日目に達成を泳いで 1 日によって記憶を評価する使用されました。(A) 水泳時間、距離を泳いで、60 第 1 四半期数を交差プローブ試験 (ないプラットフォーム) で s。データは、複数範囲のテストで一方向の分散分析によって分析されました。意味 ± SEM. n = 6。**p < 0.01、sham グループ対。(B) 水泳プローブ試験ラットの軌道。(A) 偽運営グループ、ターゲット作業領域 (Q1) で大きい水泳の時間と距離を表示します。(B) 合成 a β 投与群、ターゲット作業領域 (Q1) で以下のスイミングの時間と距離を表示します。図を参照の 4 から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

合成 a β の影響ラット遊泳速度。

遊泳速度ラットはモリス水迷路試験日 85 に相当する 7 ポスト手術日トライアル表示プラットフォームによって計算されます。遊泳速度、水泳の距離と時間をプール内の各グループのプラットフォーム上のステップの計算に基づくラットは有意差はなかった。したがって、動機と運動能力が本質的にそのまますべてのラット (図 5) で示すラット遊泳速度の個人差が除外される可能性があります。

figure-results-4977
図 5.合成 a β ラット遊泳速度に影響します。遊泳速度ラットはモリスの水迷路試験は、操作後 85 日目に行ったの 7 日目トライアル表示プラットフォームによって計算されます。各グループの遊泳速度ラットは有意差はなかった。データは、複数範囲のテストで一方向の分散分析によって分析されました。意味 ± SEM. n = 6。図を参照の 4 から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

合成 a β がラット神経細胞形態変化の原因:

すべてのラットは、手術の日 86 斬首によって殺されました。目視検査が見つかりましたいくつかの合成 a β 投与ラットにおける黄色サーフェスまたは薄いまたは折りたたまれた大脳皮質が登場しました。偽手術群 (図 6AA2) と比較して、彼によって合成 a β 投与群の光学顕微鏡観察ステンド、海馬ニューロン病変、神経変性症、neuronophagia などを発見核のアポトーシスと核辺縁 (図 6AB2)。合成 a β 投与群で大脳皮質の一部が破壊され細胞膜, 断片化した核と壊死領域 (広範な炎症細胞浸潤の特徴は典型的な colliquative 壊死を明らかにしたほか、図 6AB3)。これは、合成 a β がラットの神経構造病理学的傷害されることを示します。

偽手術群と比較して神経細胞の構造の病理学的変化に加えてニューロン数も有意に減少した (除く colliquative 壊死サンプル)、合成の大脳皮質と海馬のA β 投与群。神経細胞数は 0.125 mm の海馬 CA1 セクション sham 群のそれより低い 63.86% (p < 0.01) 55.46% (p < 0.01) 低い 0.0352 mm2 の大脳皮質のセクションで合成 a β は、ことができることを提案する (図 6 b)減らされたニューロンの数。

figure-results-6443
図 6.合成 a β がラット神経細胞形態変化を引き起こされる。(A) 彼に染まった海馬と大脳皮質ニューロンの代表的なイメージ。(A1-B1)海馬 40 x;(A2-B2)海馬 CA1 400 x;(A3-B3)大脳皮質の 400 倍。(A1-A3)偽運営グループ(B1-B3)合成 a β 投与群;マーク ニューロンの損失、神経変性 (→)、neuronophagia (←)、核アポトーシス (↗)、核辺縁 (↙) 海馬、典型的な colliquative 壊死 (☆) 中断される細胞膜、大量の炎症性細胞浸潤を示しています合成 a β 投与群の一部に大脳皮質。A1、B1のスケール バー = 10 μ m;A2、B2、A3、B3のスケールバー = 100 μ m。 (B) 光学顕微鏡 (400 倍) で数えられた海馬と大脳皮質の HE 染色でニューロン数。各ボリュームは、3 つの独立したサンプル 9 視野から平均 ± SEM を表します (n = 3)。**p < 0.01、sham グループ対。 図を参照の 4 から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

電子顕微鏡は、海馬の神経細胞の細胞内微細構造を観察しました。合成 a β 投与群 (図 7 b1-B4) 海馬ニューロンの構造大幅破壊され、ミトコンドリアの膨潤を示す、稜破損、増加したミトコンドリアの電子密度が荒い拡張小胞体、摂取ポリゾームと polymicrotubules、いくつかのシナプス密度 (PSD)、多くの二次リソソームと偽運営グループ (図 7 a1 – A4) と比較して、細胞質におけるリポフスチン土砂。核膜は原油と沈没、ユークロマチンは凝縮され、変性、髄鞘層がゆるかったや繊維と内部の軸索変性が減衰しました。 これらの結果は、合成 a β がラットのサブ構造被害のニューロンを作り出すことができることを示しています。

figure-results-8057
図 7.電子顕微鏡観察によって評価海馬ニューロンの細胞内構造は。A1 -A4: 偽運営グループ。スケール バーのA1 = 4 μ m、12, 000 x;A2のスケール バー = 3 μ m、15, 000 x;A3のスケール バー = 5 μ m、10, 000 x;A4のスケール バー = 1 μ m、35, 000 x。(B1-B4)合成 a β 投与群。(B1)ニューロンと核のアポトーシス (←)、ユークロマチン凝縮または変性 (#)、アストロ サイトの足うねり (*)、高電子密度ミトコンドリア (▲)、髄鞘層緩いまたは減衰 (→)。(B2)大きい GFAP, 高電子密度ミトコンドリア (▲)、髄鞘層緩やかなまたは減衰 ()、大きい二次リソソーム (↑)、ペリサイト アポトーシス、ペリサイト ユークロマチン凝縮または変性 (☆)、アストロ サイトの足うねり (*), 電子密度の高いミトコンドリア (▲)、リポフスチン (↓)、髄鞘層緩い以上減衰 (→)。B4: より多くの興奮性神経伝達物質 (#)、高電子密度やけが膜ミトコンドリア (▲)、シナプス以下。B1、B2のスケール バー = 10 μ m、5, 000 x;B3のスケール バー = 5 μ m、8, 000 x;B4のスケール バー = 1 μ m、40, 000 x。図を参照の 4 から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

合成 a β がラット神経細胞における a β の負担の原因:

コンゴ赤染色は、ニューロンの a β 負担を検出する使用されました。結果を示す合成 a β がラット海馬と大脳皮質 (図 8A) 細胞内 a β 負担を特に引き起こすことができます。正の数 a β の赤い細胞の合成 a β 投与群の大脳皮質と海馬のコンゴーレッドで染色が 8.05 〜 と 4.09 倍 (p < 0.01) 偽手術群 (図 8B) のより大きい。これは、合成 a β がラットにおけるニューロン a β の負担を増やすことができますを示しています。

figure-results-9721
図 8.合成 a β は、ニューロン ラットにおける a β 負担を引き起こされる。(A) 代表的な画像正 a β ニューロン海馬コンゴ赤染色と大脳の皮質。(A1-B1)海馬 CA1 400 x;(A2-B2)大脳皮質の 400 倍。(A1-A2)偽運営グループ(B1-B2)合成 a β 投与群は、コンゴ赤染色陽性より a β を示しています。スケール バー = 10 μ m, 400 x。(B) 光学顕微鏡 (400 倍) で数えられた海馬と大脳皮質、コンゴ赤染色 a β 神経細胞の正の数です。各ボリュームは、3 つの独立したサンプル 9 視野から平均 ± SEM を表します (n = 3)。**p < 0.01、sham グループ対。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

合成 a β は、ラットの神経細胞で NFT 沈着を発生しました。

銀製硝酸塩の汚損は、ニューロンの NFT 沈着の検出に使われました。結果は、合成 a β 著しくこと細胞内の NFT 成ラットの海馬と大脳皮質 (図 9A) を表示します。合成 a β 投与群の大脳皮質と海馬に硝酸銀染色茶色 NFT と細胞の正の数は、9.75 〜 と 4.82 倍 (p < 0.01) 偽手術群 (図 9B より大きい).これは、合成 a β がラットで NFT の集計をニューロンを増やすことができますを示しています。

figure-results-11138
図 9.合成 a β は、ニューロン ラット NFT 集計を引き起こされる。(A) 海馬と大脳皮質で硝酸銀染色陽性の NFT ニューロンの代表的なイメージ。(A1-B1)海馬 CA1 400 x;(A2-B2)大脳皮質の 400 倍。(A1-A2)偽運営グループ(B1-B2)合成 a β 投与群。細胞染色複合投与群で硝酸銀による肯定的なより多くの NFT を表示しています。スケール バー = 10 μ m, 400 x。海馬における硝酸銀染色の数 (B) 正 NFT ニューロンと大脳皮質光学顕微鏡 (400 倍) で数えられました。各ボリュームは、3 つの独立したサンプル 9 視野から平均 ± SEM を表します (n = 3)。**p < 0.01、sham グループ対。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

学習と記憶の損失が AD 患者2の主な臨床症状であることが知られています。ここで説明する手順は広告; を勉強する体内法です。我々 は、記憶障害とラット モデル4では神経の傷害を軽減する薬をテスト以前に公開されたプロトコルを適応しています。我々 のプロトコルが正常にモデルの動作、記憶障害、神経細胞傷害、a β の負担と NFT 蒸着、(今回の実験では、生存率における広告を模倣する動物の高い生存率と同様に、貴重なデータを取得するの重要な詳細を提供します操作の成功モデル率 90% 以上)。これらの成功したモデルのラットは、モリス水迷路試験で自分の空間記憶を測定する使用されました。位置決めのナビゲーション試験の結果、合成 a β がラット記憶獲得障害; を引き起こす可能性プローブ試験の結果、合成 a β がラット メモリ保存を減らすことができます。逆転のトライは、合成 a β はラットの学習障害を再れることが発見しました。これらのモリス水迷路試験データを示す合成 a β がラットの空間記憶を誘発することができます。全体的にみて、AlCl3と TGF-β 1 との組み合わせで Aβ25 35 のラット脳室内投与によるを注入、実現可能かつ信頼できる生体内で広告のような動物モデル研究所が作成されます。

以前の研究では、AD 患者における脳の容積が 10% 未満である健康な人のことを示しています。目視による様々 な萎縮大脳半球にあります。皮質の萎縮の程度は積極的に関連メモリ減損19。、組織の多数のニューロンの損失と厳しい形態病理学は直接 AD 患者20のメモリ機能を妨げます。本研究では光/電子顕微鏡観察は、合成 a β と microinjected ラットに劇的な神経病理学的変化、ニューロンの損失、および神経細胞および細胞レベル下の構造の中断を含むが表示されることを発見しました。この結果は、合成 a β により誘導されるラットの空間記憶障害を裏付ける、AD 患者の状態に似ています。

脳 β 負担と NFT 集計が考慮されている最も重要な histopathogenic 特徴広告で知られています。神経の構造を破壊、神経シグナルを邪魔、神経機能を混乱させるし、進行した認知症17は、できます。現在の動物モデルは、AD 患者状態に同意する脳の a β の負担と NFT 集計を発見しました。したがって、合成 a β 投与ラットにおける存在のニューロン損傷は、神経病理学や AD の治療戦略を研究するモデルとして使用できます。

広告モデルで薬効をスクリーニングの例: 趙ら、茎および葉 (SSF) の両方に含まれるフラボノイド オウゴン オウゴン barbata (SBF) は、ラットの記憶障害とアポトーシスを減衰させることを報告合成 a β8,9。郭ら、また SBF が NFT の集約と、Ser199、Ser214、Ser202、Ser404、および Thr231 の側で蛋白過剰リン酸化を抑制でき、合成 a β 投与ラット21 における GSK 3、CDK5、および PKA タンパクと mRNA 発現の減少を報告.同時に、香ら、アストロ サイトやミクログリアの増殖と低 Aβ1 40, Aβ1-42, SBF を抑制でき、割断酵素 1 (BACE1) β サイト アプリ合成 a β の脳における mRNA 発現ラット22も報告しています。上記の結果に基づいて、我々 の動物モデルより多くの神経細胞の機能と構造の障害を含むその他の広告のようなモデルに有利です。

他の広告のようなモデルについてラットに a β の単一脳室内投与ラットの記憶障害、ニューロンの損失、および neurogliocyte の増殖を引き起こす可能性しますが、NFT と a β 沈着23がない可能性があります。高用量アルに暴露したラット脳内記憶障害、ニューロンの損失、neurogliocyte 増殖と老人斑 (SP) と NFT 集計のコスト効果の高い動物モデル、模倣広告、高い成功率を持って表示されます。アルの高用量は、ラット肝傷害を引き起こす可能性があり、食欲不振を伴う減少重量24。高齢ラットは、別の広告のようなモデルです。高齢ラット記憶障害、神経細胞の構造/構造病理学的変化、リポフスチン沈着を示す β 負担と NFT の集計はありません。年齢の 24 ヶ月以上のラットは、このモデルの高齢者と見なされます、したがってしたがってコストは高い17,25して餌の長い期間が必要です。SAMP8 と APP トランスジェニック マウスは広告に最も近い模倣、広告を調査するため、最も理想的なモデルです。両方の動物モデルは高い値段、研究室26,27使用に限定。上記の動物モデルと比較して、合成 a β 治療動物モデルの我々 のモデルが低コスト、高パフォーマンス、それの広告を研究するための理想的なツールを作るします。

結論としては、Aβ25 35 の脳室内投与を併用した AlCl3ラットに TGF-β 1 が空間記憶障害、神経損傷、a β の負担、NFT 沈着を理解する貴重な生体内で動物モデルを提供広告の基礎となります。このモデルは、高速を提供し、高い動物と比較的簡単な実験プロトコル生き残る率高いモデル操作の成功率とより経済的であることを示したの重複率が高い。現在の動物モデル広告を模倣するための効果的なモデルであり、様々 な他の疾患を模倣する使用された自体をさらに検証することができます。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

プロジェクトが河北地方自然科学基金 (号によって支えられました。C2009001007, H2014406048), 伝統的な中国医学 (号 05027)、河北地方行政と河北省の大学、中国の主要な建設プロジェクト。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Sprague-Dawley ratBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, ChinaSCXK(Jing) 2012-0001300–350 g
Morris water mazeChinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, ChinaNo
Movable small animal anesthesiRWD Life Science Co., Ltd. ChinaR580
Brain Stereotaxic ApparatusRWD Life Science Co., Ltd. China68001
Flexible bone drillShanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. ChinaBW-sD908
Transmission electron microscopeJapan Co., Ltd. JapanJEM-1400
Two channel microinjection pumpRWD Life Science Co., Ltd. ChinaRWD202
EM microtomeHitachi Co., Ltd. ChinaH-7650
Dummy cannulaRWD Life Science Co., Ltd. China620010.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5
http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html
Guide cannulaRWD Life Science Co., Ltd. China621010.D.0.40mm/M3.5
Internal cannulaRWD Life Science Co., Ltd. China622010.D.0.41×I.D.0.25mm/figure-materials-1391M3.5
Tighten the nutRWD Life Science Co., Ltd. China625010.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5
Fixing screwRWD Life Science Co., Ltd. China62514M1.2×L2.0mm(100BAO)
The screwdriverRWD Life Science Co., Ltd. China6299945*1mm
PE TubingRWD Life Science Co., Ltd. China62302
Amyloid beta 25-35Sigma Aldrich Co. USASCP0002-5MG
Recombinant human transforming growth factor-β1PeproTech Inc. USA100-21
Aluminium trichlorideTianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China3011080
Congo redTianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China3010016
Silver nitrateSinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China20150720
Denture base materialShanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. China20170609

参考文献

  1. Robinson, M., Lee, B. Y., Hane, F. T. Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 2: Genetics and Epidemiology. J. Alzheimers. Dis. , (2017).
  2. Hane, F. T., Lee, B. Y., Leonenko, Z. Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 1: Pathology. J. Alzheimers Dis. , (2017).
  3. Perl, D. P. Neuropathology of Alzheimer's disease. Mt. Sinai. J. Med. 77, 32-42 (2010).
  4. Wu, X. G., Wang, S. S., Miao, H., Cheng, J. J., Zhang, S. F., Shang, Y. Z. Scutellaria barbata flavonoids alleviate memory deficits and neuronal injuries induced by composited Aβ in rats. Behav. Brain Funct. 12, 33-43 (2016).
  5. Guo, K., Wu, X. G., Miao, H., Cheng, J. J., Cui, Y. D., Shang, Y. Z. Regulation and mechanism of Scutellaria bartata flavonoids on apopotosis of cortical neurons and cytochondriome induced by composited Aβ. Chin Hosp Pharm J. 35, 1994-1999 (2015).
  6. Guo, K., Miao, H., Wang, S. S., Cheng, J. J., Shang, Y. Z. Scutellaria barbata flavonoids inhibits NFT aggregation and regulatory mechanism in rats induced by composited Aβ. Chin. J. Pathophysio. 32, 2147-2156 (2016).
  7. Hou, X. C., et al. Scutellaria Barbata flavonoids inhibit the brain's Aβ and NFT abnormal generation and affect the related enzymes expression in rats induced by composited Aβ. Chin J New Drugs. , (2017).
  8. Zhao, H. X., Guo, K., Cui, Y. D., Wu, X. G., Shang, Y. Z. Effect of Scutellaria barbata flavonoids on abnormal changes of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak protein expression in mitochondrial membrane induced by composite Aβ25-35. Chin J Pathophysiol. 30, 2262-2266 (2014).
  9. Cheng, J. J., et al. Flavonoid extract from Scutellaria stem and leaf attenuates composited Aβ- induced memory impairment and apoptosis in rats. Chin.J. New Drugs. 25, 2627-2636 (2016).
  10. Fang, F., Yan, Y., Feng, Z. H., Liu, X. Q., Wen, M., Huang, H. Study of Alzheimer's disease model induced multiple factors. Chongqing Med. 36, 146-151 (2007).
  11. . Regulations for the Administration of Affairs Concerning Experimental Animals. The Ministry of Science and Technology of the People's Republic of China. , 10-31 (1988).
  12. Bao, X. M., Shu, S. Y. . The stereotaxic atlas of the rat brain. , (1991).
  13. Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rats. J. Neurosic. Methods. 11, 47-60 (1984).
  14. Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
  15. Yu, J. C., Liu, C. Z., Zhang, X. Z., Han, J. X. Acupuncture improved cognitive impairment caused by multi-infarct dementia in rats. Physiol. & Behav. 86, 434-441 (2005).
  16. Shang, Y. Z., Miao, H., Cheng, J. J., Qi, J. M. Effects of amelioration of total flavonoids from stems and leaves of Scutellaria baicalensis Georgi on cognitive deficits, neuronal damage and free radicals disorder induced by cerebral ischemia in rats. Biol. Pharm. Bull. 29, 805-810 (2006).
  17. Song, H. R., Cheng, J. J., Miao, H. J., Shang, Y. Z. Scutellaria flavonoid supplementation reverses ageing-related cognitive impairment and neuronal changes in aged rats. Brain Inj. 23, 146-153 (2009).
  18. Wang, M., et al. Novel RAS inhibitors Poricoic Acid ZG and Poricoic Acid ZH attenuate renal fibrosis via a Wnt/β-Catenin patheway and targeted phosphorylation of smad3 signaling. J Agric Food Chem. 66, 1828-1842 (2018).
  19. Pini, L., et al. Brain atrophy in Alzheimer's Disease and aging. Ageing Res. Rev. 30, 25-48 (2016).
  20. Ubhi, K., Masliah, E. Alzheimer's disease: recent advances and future perspectives. J. Alzheimers Dis. 33, 85-94 (2013).
  21. Guo, K. . Scutellaria barbata flavonoids inhibite NFTs aggregation, tau protein phosphorylation and the regulated mechanism of related enzymes in rats induced by composited Aβ. , (2016).
  22. Shang, Y. Z. . Effects and Mechanism of Scutellaria Barbata Flavonoids on Rat's Memory Impairment Induced by Compound Aβ25-35. , (2013).
  23. Zussy, C., et al. Alzheimer's disease related markers, cellular toxicity and behavioral deficits induced six weeks after oligomeric amyloid-β peptide injection in rats. PLoS One. 8, 1-20 (2013).
  24. Walton, J. R. Aluminum involvement in the progression of Alzheimer's disease. J. Alzheimers Dis. 35, 7-43 (2013).
  25. Neils-Strunjas, J., Groves-Wright, K., Mashima, P., Harnish, S. Dysgraphia in Alzheimer's disease: a review for clinical and research purposes. J. Speech Lang Hear Res. 49, 1313-1330 (2006).
  26. Morley, J. E., Farr, S. A., Kumar, V. B., Armbrecht, H. J. The SAMP8 mouse: a model to develop therapeutic interventions for Alzheimer's disease. Curr Pharm Des. 18, 1123-1130 (2012).
  27. Puzzo, D., Gulisano, W., Palmeri, A., Arancio, O. Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 10, 703-711 (2015).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

137 25 35 1 a

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved