Estabelecimento de um mímico valioso de doença de Alzheimer em modelo Animal de rato por injeção Intracerebroventricular de proteína Beta amiloide compostos

Resumo

Este é um protocolo para imitar a doença de Alzheimer em ratos por uma avaliação de imparidade de memória espacial, alterações patológicas neuronais, fardo de proteína (Aβ) beta amyloid neuronal, e agregação neurofibrilares, induzida pela injeção de Aβ25-35 combinado com tricloreto de alumínio e recombinante humano transformando β1-fator de crescimento.

Resumo

A doença de Alzheimer (AD) é uma doença cerebral progressiva, irreversível que lentamente destrói a memória e é acompanhada pela mudança de perda e estrutura do neurônio. Com o aumento de pacientes em todo o mundo, a patologia e o tratamento da doença tornou-se um foco na indústria farmacêutica internacional. Assim, o estabelecimento do modelo animal para imitar AD no laboratório é de grande importância.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o estabelecimento de uma mímica do anúncio em um animal de rato modelo embora injeção intracerebroventricular de amiloide beta proteína 25-35 (Aβ25-35) combinado com tricloreto de alumínio (AlCl₃) e núcleo talâmica anterodorsal injeção de recombinante humano transformando o fator de crescimento-β1 (RHTGF-β1) para ratos. Os marcadores relacionados de AD foram medidos, incluindo: memória espacial, estrutura neuronal e subestrutura, neuronal Aβ e produção neurofibrilares (NFT). Este modelo de rato demonstra comprometimento de memória espacial, estrutura neuronal e alterações patológicas de subestrutura, fardo Aβ intracelular neurônio e agregação NFT e fornece um mímico perto do transtorno de estrutura e função neuronal ao de clínica Pacientes de AD. Assim, o apresentado AD rato modelprovides uma ferramenta valiosa na vivo para explorar a função neuronal, patologia neuronal e triagem de drogas de AD.

Introdução

É sabido que o anúncio é uma doença neurodegenerativa crónica e progressiva, com perda gradual de memória como a principal síndrome clínica. Na patologia geral, há atrofia do tecido nervoso, neurônio e perda de sinapse, bem como neuronal subcellular distúrbios estrutura e função, que todos estão envolvidos no desenvolvimento e manifestação clínica da AD^1,2. É relatado que, quando os animais eram intracerebroventricularly injetado com Aβ, alguns neurotóxicos eventos ocorrem no cérebro envolvendo perda de neurônio, rompimento de homeostase de cálcio, neurônio apoptose e de excesso de produção de espécies reativas de oxigênio³. No entanto, múltiplos fatores estão envolvidos na patogênese da AD e, portanto, é essencial estabelecer um modelo melhor de AD.

Um protocolo detalhado é descrito aqui para estabelecer na vivo imitar AD modelo através de injeção intracerebroventricular de Aβ25-35 e AlCl₃, combinado com a injeção de núcleo talâmica anterodorsal de RHTGF-β1 para ratos. Este rato modelhighly imita a função neuronal humana e histopathogenesis do anúncio, incluindo deficiência de memória, perda de neurônio e dano de estrutura, apoptose, fardo Aβ intracelular e NFT agregação^{4,5,6 , 7 , 8 , 9}. o AlCl₃ impede que o Aβ depositada formando Aβ solúvel, e o RHTGF-β1 pode promover a produção de Aβ depositada e facilitar a ocorrência de AD¹⁰. Este ataque de vários fatores para o neurônio está em conformidade com a patogênese multi da AD.

Todo o experimento durou 86 dias: a Figura 1 mostra um cronograma do projeto experimental, com ponto de tempo de cirurgia animal, triagem de modelo animal, teste de memória espacial animal e preparação da amostra. No primeiro dia de operação, RHTGF-β1 foi injetadas para o núcleo talâmica anterodorsal. No segundo dia da operação, Aβ25-35 e AlCl₃ foram injetadas em ventrículo lateral diariamente por 14 dias consecutivos de manhã e 5 dias consecutivos, no período do tarde, respectivamente. Todos os ratos foram autorizados a recuperar durante 45 dias após a operação. O labirinto de água Morris foi usado para a tela para ratos de modelo de sucesso, com comprometimento de memória e para avaliar a memória espacial dos ratos. Os ratos foram submetidos a 4 dias consecutivos de labirinto de água treinando com 2 ensaios por dia, e no dia 4 do treinamento, os ratos foram avaliados com o desempenho de labirinto de Morris água para perda de memória. Todos os ratos continuaram a ser alimentados com 37 dias após a exibição do modelo animal. A memória espacial de ratos foi testada no labirinto de água Morris por 7 dias consecutivos, de 79 de dia para dia 85 após a operação. Todos os ratos foram sacrificados por decapitação no dia 86 para preparação de amostras de cérebro.

Figura 1. Cronograma do projeto experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Este procedimento foi em conformidade com os regulamentos de Experimental Animal administração emitido pelo Comité de estado da ciência e tecnologia da China em 31 de outubro de 1988¹¹. Os cientistas devem seguir as diretrizes estabelecidas e aprovadas por suas organizações reguladoras animais institucionais e nacionais.

Nota: Animal e regentes: ratos Sprague-Dawley machos de quatro meses (300-350 g) foram fornecidos para este experimento. Todos os ratos foram alojados em grupos (quatro ou cinco por gaiola), a uma temperatura de 23 ± 1 ° C, com um ciclo de claro-escuro de 12-h. Comida e água eram disponíveis ad libitum. Os ratos foram aclimatados para as condições de habitação de 7 dias antes que o procedimento foi executado. Aβ25-35 foi dissolvido em solução salina de DMSO de 1% para 1 mg/mL e lisados por 5 min em um oscilador ultra-sônico até dissolver completamente. AlCl₃ e RHTGF-β1 foram dissolvidos em solução salina em 1% e 0,1 mg/mL, respectivamente. Vermelho Congo, nitrato de prata e outros produtos químicos foram de grau analítico e foram adquiridos a partir de fontes comerciais comuns.

1. ato cirúrgico

Nota: 20 ratos Sprague-Dawley machos foram injetados com Aβ composto no ventrículo lateral e anterodorsal núcleo talâmica e designados como o grupo composto de Aβ-tratados. Outros 20 ratos estavam sujeitos à mesma operação mas receberam microinjeção salina de 0.1% DMSO e designado como o grupo de operação.

1. Anestesiar os ratos com 100% de isoflurano por inalação e então frear um aparelho estereotáxica cerebral.
2. Raspar a pele sobre o vértice da cabeça com uma tesoura cirúrgica e desinfectar com Iodofor. Em seguida, cobrir a toalha cirúrgica descartável na cabeça.
3. Fazer uma incisão na pele cabeça ao longo da calvaria longitudinal mediana com bistouries cirúrgicos e tesoura.
4. Separe o tecido subcutâneo e fáscia, limpe a calvária de crânio com um algodão seco estéril para parar o sangramento e marcar o bregma com uma caneta.
5. Referir-se o rato cerebral estereotáxica mapa¹²; Considerando o bregma como o ponto de origem, marcar os três pontos, o núcleo talâmica anterodorsal (ad) (posterior (P): 2,0 mm para o bregma; lateral (L): 1.4 mm para a linha média) para injectar RHTGF-β1 e fixação de um parafuso, a (área do ventrículo lateral (LV) posterior (P): 0,8 mm para o bregma; lateral (L): 2,0 mm para a linha média) para injetar Aβ25-35 e AlCl3 e o segundo parafuso fixação lugar (frontal (F): 2,0 mm para o bregma; lateral (L): 1,5 mm para a linha média).
6. Delicadamente, perfurar três furos de 1 mm de diâmetro com uma broca de osso flexível, designada nos três pontos acima do crânio (1.5. etapa). Não aperte mais profundo do que o necessário para evitar a esfaquear o tecido cerebral.
7. Parar o sangramento e limpe a superfície do crânio repetidamente com algodão seco estéril.
8. Inserir uma agulha ligada à bomba de micro-injeção, para o cérebro a 4,6 mm de profundidade e delicadamente Injete 1 μL RHTGF-β1 (10 ng) para a área de anúncio. Fique agulha 2 min após a injeção e lentamente, retirar a agulha (arquivo suplementar 1).
9. Fixar os dois parafusos sobre o crânio, designado nos pontos do anúncio e o segundo lugar do crânio para fixação (que foram designados em 1.5. passo) com uma pequena chave de fenda. Não aperte mais profundo do que o necessário para evitar a esfaquear o tecido cerebral.
10. Montar o sistema de implantação de cânula (suplemento 2 de arquivo), inserir a cânula manequim dentro da cânula guia após desinfecção por alta pressão.
11. Inserir a cânula de guia de tubos de aço inoxidável para o cérebro a 4,6 mm área de LV através do orifício do crânio (Supplemental arquivo 3), com a ajuda de titular da cânula estereotáxica aparelho dos ratos.
12. Misture o material de base de dentadura com água base de dentadura a proporção de 1,5 g por 1 mL, colocar a pasta para cobrir o suporte de plástico de cânula guia e dois parafusos para a cânula guia de imobilização e até cobrir a incisão de pele inteira para evitar a infecção de pele.
13. No dia 2 da operação, anestesiar os ratos com isoflurano inalação usando a máquina de anestesia de animais pequenos. Retirar a cânula de manequim, inserir a cânula interna da cânula guia e aparafuse o parafuso de fixação para imobilizar a cânula interna.
14. Conjunto do tubo de polietileno que liga a bomba de microinjeção para a cânula interna e regular a velocidade de injeção de 1 µ l/min. Microinject a Aβ25-35 ou AlCl3 para o LV.
15. Microinjeção 4 μg (1 μL) Aβ25-35 diariamente durante 14 dias, de manhã e 3 μL AlCl₃ (% 1) diariamente por 5 dias à tarde sob anestesia de isoflurano.
16. Espere 5 min depois de terminar a injeção, delicadamente retire a cânula interna e inserir a cânula manequim novamente dentro da cânula guia.
17. No post do dia 15 a cirurgia (que corresponde ao último dia de injeção de Aβ25-35) desmontar o sistema de implantação de cânula. Suavemente retire o sólido de material base da dentadura com tesoura cirúrgica e fórceps, desaparafuse os dois parafusos, retirar a cânula guia e desinfectar a ferida com betadine. Preencher o buraco do crânio com cimento ósseo e sutura da pele com um método simples sutura interrompida.
18. Executar a mesma operação com o grupo de operação e microinjeção de solução salina de DMSO de 0,1%.
19. Enfermagem no pós-operatório
    1. Casa 2 ratos por gaiola depois da operação e prestação de alimentos por 30 dias.
       Nota: 18 ratos na operação grupo sobreviveu (90% taxa de sucesso da operação) e 19 ratos tratados com compostos Aβ grupo sobreviveu (taxa de sucesso de 95% da operação).

2. triagem para ratos de modelo de sucesso e avaliação de memória espacial com labirinto de Morris água

1. Labirinto de água Morris
   Nota: O labirinto de água Morris foi usado para avaliar o rato memória espacial¹³. O labirinto de água de Morris é um tanque circular de aço inoxidável com 120 cm de diâmetro e 50 cm de profundidade. O teste de labirinto de água foi realizado, com base no paradigma da "padrões de ouro" descrito em neurociência comportamental por J. Nunez¹⁴.
   1. Escurecer a água da piscina com algumas gotas de corante alimentar.
   2. Manter a profundidade da água a 31,5 cm e a temperatura de 23 ± 1 ° C.
   3. Defina uma plataforma circular de acrílico transparente de 1,5 cm abaixo da superfície da água.
   4. Manter-se de que todos os sinais espaciais ao redor do labirinto de água são invariáveis durante os testes de labirinto de água.
   5. Divida a piscina em 4 quadrantes iguais por linhas imaginárias para coleta de dados descritivos.
   6. Coloque a plataforma escondida no primeiro quadrante (Q1) do labirinto de água.
   7. Capture o rato nadando comportamentos (medidos pelo número de cruzamento, trajetória ou latência) através de uma câmera de vídeo, sobre o labirinto de água ligado a um software analítico de gráficos baseados em computador.
2. Triagem para ratos de modelo de sucesso ao grupo de compostos Aβ-tratados
   1. No dia 45 de cirurgia, execute o labirinto de água Morris treinamento durante 4 dias consecutivos para tela de ratos com deficiência de memória modelo de sucesso e recolher a taxa de rastreio (SR).
      Nota: O SR é definido como a latência média de cada rato composto Aβ-tratados e o grupo de operação de ratos para encontrar a plataforma escondida debaixo de água de superfície no dia 4 de água formação de labirinto. "A" é a latência média de cada rato Aβ-Tratado composto para encontrar a plataforma escondida e "B" é a latência média do grupo operação de ratos para encontrar a plataforma escondida, no dia 4 de labirinto de água de formação, na seguinte equação:
      
      Quando SR era maior do que 0,2 para um rato composto Aβ-tratados, o rato foi considerado como um rato de modelo de sucesso com a memória prejudicada de rato Aβ-tratados compostos¹⁵. O desempenho de memória intradiário foi calculado para os dados de 2 ensaios pelo valor médio de ratos para encontrar a plataforma escondida. O processo de teste de labirinto da água Morris foi projetado tais que os ratos foram autorizados a nadar no tanque de labirinto de água e pesquisa para a plataforma escondida dentro de 60 s. Se um rato não descobriu a plataforma escondida dentro de 60 s, então o rato foi colocado na plataforma com a mão do experimentador. Quando um rato chegou na plataforma escondida (independentemente ou assistida), o rato era deixe ficar lá por 20 s. Então, o rato foi removido do tanque e permitiu uma recuperação física para 10 s entre os 2 ensaios.

3. exame neurônio

1. No dia 86 pós cirurgia, sob anestesia de isoflurano, eutanásia em ratos por decapitação (Figura 1).
2. Coloque o cérebro no gelo e delicadamente, separe os dois hemisférios da Rafe. Tirar mancha de hemisfério esquerdo do quiasma óptico e correção em formol 4% para a observação de luz microcopy de hematoxilina neurônio e eosina (HE), vermelho Congo ou nitrato de prata (ver seções 4-6). Corrigi a área do hipocampo CA1 hemisfério direito em glutaraldeído 2,5% para observação de microcopy elétron (secção 7).
3. Processo do cérebro para a preparação da amostra microcopy Luz/elétron, como descrito anteriormente,^16,17.

4. neurônio mancha

1. Deparaffinize cada slide (20 min cada), com gradiente álcool (álcool 100%, 95%, 90%, 80% e 70%) para a água em uma coifa destilada.
2. Mancha para 3 min com hematoxilina (0,5% p/v) e em seguida enxaguar com água corrente para remover o corante desvinculado das laminas.
3. Enxaguar com 0,1% de ácido clorídrico em álcool por 1 s para remover a cor dos núcleos imaculados.
4. Imergir em solução de amônia 0,5% por 2 min até que o fundo se transforma luz azul.
5. Mancha para 1 min com eosina 1%.
6. Desidrata-se por 5 min com gradiente álcool (álcool 70%, 80%, 90%, 95% e 100%).
7. Claras em xilol e montar com meio de montagem resinoso.
8. Observar e contar os neurônios vivos da mancha por 0,125 mm no meio CA1 do hipocampo e por 0,0352 mm² no córtex cerebral em uma ampliação de 400 x com microscópio óptico por uma pessoa cegado para o delineamento experimental.

5. a mancha para análise do neurônio Aβ fardo vermelho Congo

1. Deparaffinize cada slide (20 min), com gradiente álcool (álcool 100%, 95%, 90%, 80% e 70%) para a água em uma coifa destilada.
2. Manchar-se por 20 min com vermelho Congo solução (0,5 g vermelho de Congo, 80 mL de álcool metílico, glycerinum de 20 mL) de trabalho.
3. Enxaguar em água destilada por 5 min.
4. Diferenciar-se rapidamente com solução alcalina de 80% de álcool (0,2 g álcool/100 mL de hidróxido de potássio) por 3 s.
5. Lave duas vezes, cada um por 5 min com água destilada.
6. Counterstain em hematoxilina de Gill para 3 min.
7. Enxaguar em água da torneira por 2 min.
8. Mergulhe em água amônia (adicione algumas gotas de hidróxido de amónia para água da torneira e misture bem) por 30 s ou até as seções ficarem azuis.
9. Enxaguar em água da torneira por 5 min.
10. Desidratam com gradiente álcool (álcool 70%, 80%, 90%, 95% e 100%).
11. Claras em xilol e montar com meio de montagem resinoso.
12. Observar e contar as células coradas com vermelho Congo em uma ampliação de 400x, com microscópio óptico por uma pessoa cegado para o delineamento experimental.

6. de nitrato de prata para análise do neurônio NFT formação de coloração

1. Deparaffinize cada slide (20 min), com gradiente álcool (álcool 100%, 95%, 90%, 80% e 70%) para a água em uma coifa destilada.
2. Imergir em solução de nitrato de prata 20% e agente tampando por 20 min no escuro.
3. Lavar em água destilada duas vezes, 5 minutos de cada vez.
4. Imergir em solução de amônia prata. Gota de solução de amoníaco em solução de nitrato de prata 20% e adicione até que a solução passa de turbidez para esclarecimento. Simultaneamente, agitar a solução com uma vareta de vidro por 15 min e coloque o hidróxido de amônio 1% diluído por 2 min.
5. Coloque o deslize-o para a solução de trabalho de desenvolvimento para 3-7 min até que o bloco preto no axônio pode ser observado.
6. Mergulhe na solução 0,1% diluído amônia para 1 min e depois enxaguar com água por 1 min.
7. Descarte-se com tiossulfato de sódio 5% por 2 min e depois enxaguar com água por 5 min.
8. Desidratam com gradiente álcool (álcool 70%, 80%, 90%, 95% e 100%).
9. Claras em xilol e montar com meio de montagem resinoso.
10. Observar e registar a célula para mancha de nitrato de prata em uma ampliação de 400 x com microscópio óptico por uma pessoa cegado para o delineamento experimental.

7. hippocampal neurônio ultraestrutura de medição

1. Corte o hipocampo de rato CA1 em vários cubos (1 x 1 x 1 mm³) e coloque em glutaraldeído 2,5% para 2 h a 4 ° C.
2. Lave os cubos com PBS três vezes (pH 7.2, 10 min para cada vez).
3. Corrigir os cubos no ácido ósmico de 1% para 2 h a 4 ° C.
4. Lave os cubos em água bidestilada 3 x (10 min para cada vez).
5. Desidratam com gradiente álcool 50%, 70% e 90% (10 min para cada), 100% duas vezes (15 min para cada vez).
6. Substitua pelo óxido de propileno, duas vezes (15 min para cada vez), óxido de propileno: resina em 1:1 (60 min. para cada hora à temperatura ambiente) e óxido de propileno: resina 1:4 (60 min. para cada hora à temperatura ambiente). Mergulhe em resina (120 min, à temperatura ambiente).
7. Incorporar em EPON 812 e polimerizar (5h/35 ° C, 60 ° C/5h, 80 ° C/5h).
8. Cortar as seções semithin (1 µm), mancha de azul de metileno e localizar sob o microscópio.
9. Manchar as seções ultra-finas (50 nm) com citrato-ó-acetato de uranilo e chumbo.
10. Examine sob um microscópio JEM-1400 e coletamos imagens.

Resultados

Todos os dados são apresentados como média ± SEM. SAS/STAT pacote foi usado para calcular a análise estatística. As diferenças de grupo na latência para encontrar a plataforma escondida na aquisição de memória e re-aprendizagem teste de memória foram analisadas por duas vias de análise de variância (ANOVA) com medidas repetidas. As diferenças de grupo no julgamento de sonda e o número de neurônios foram analisadas por ANOVA One-Way, seguido pelo teste de Duncan múltiplo-gama. p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo¹⁸.

Seleção para modelo de sucesso de ratos com deficiência de memória para o grupo composto de Aβ-tratados:

Os resultados na Figura 2AA1 e 2AA2 mostram que o grupo de operação de ratos sempre nadou livremente e os ratos do grupo composto de Aβ-tratada (Figura 2AB1, AB2) sempre nadou em todo o perímetro da piscina na natação adaptável na Labirinto de água de Morris. Nos 4 dias de triagem para ratos de modelo de comprometimento de memória, todos os ratos tinham progressivamente declinando vezes para encontrar a plataforma escondida (latência) (Figura 2B). No dia 4 de água Morris labirinto formação, se o SR era mais do que 0,2 (que se baseava a latência de cada rato composto Aβ-tratados e o grupo de operação de ratos para encontrar a plataforma escondida) e, em seguida, o rato de Aβ-tratados composto foi considerado um sucesso rato de modelo com deficiência de memória. 18 dos 19 ratos (94.70%) que sobreviveram a operação passada os bem sucedido modelo triagem. 6 ratos de cada grupo foram escolhidos para os experimentos seguintes.

Figura 2 . Triagem para os ratos de modelo de sucesso com perda de memória no grupo composto de Aβ-tratados usando a água de Morris labirinto treinamento. (A) a natação adaptável a trajetória dos ratos no labirinto de água de Morris. (AA1–AA2) Grupo de operação; (AB1–AB2) Grupo composto de Aβ-tratados. (B) média latência para encontrar a plataforma escondida durante 4 dias consecutivos do julgamento triagem na água Morris labirinto de treinamento para a operação e o grupo de compostos Aβ-tratados.  A figura foi modificada da referência 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Compostos Aβ causada rato aquisição de memória e memória re-aprendizagem deficiências:

A aquisição de memória do rato foi determinada pelo julgamento de navegação posicionamento no dia 1 e 2 do teste de labirinto da água Morris, que correspondia à cirurgia de post dia 79 e 80. Durante os 2 dias da aquisição memória experimental, todos os ratos exibiram latência progressivamente decrescente para encontrar a plataforma escondida. Como mostrado na Figura 3, as latências do grupo composto de Aβ-tratada para encontrar a plataforma escondida foram 360.67% e 558.28% (F (1, 5) = 238.67, p < 0,01) maior do que aqueles do grupo de operação no dia 1 e 2 da água Morris labirinto de teste, respectivamente. Isso indica que o composto Aβ pode induzir deficiência de aquisição de memória em ratos.

O rato memória re-aprendizagem foi analisada com a inversão de julgamento no dia 4, 5 e 6, o teste de labirinto de água Morris, que correspondia à cirurgia de post do dia, 82, 83 e 84. Como mostrado na Figura 3, as latências do grupo composto de Aβ-tratada para encontrar a plataforma escondida foram 306.20%, 650.16% e 936.92% mais tempo do que aqueles do grupo de operação (F (1, 5) = 138.76, p < 0,01). Isto demonstra que os compostos Aβ pode elevar a memória re-aprendizagem imparidade em ratos (Figura 3).

Figura 3 . Aβ composto causou a aquisição de rato memória e memória re-aprendizagem deficiências. O julgamento de navegação posicionamento foi utilizado para avaliar a aquisição de memória por 2 dias consecutivos natação conquista no dia 1 e 2 no teste de labirinto de água de Morris. Estas foram realizadas na cirurgia de post dia 79 e 80. A inversão experimental foi utilizada para avaliar a memória re-aprendizagem por 3 dias consecutivos natação pontuação no dia 4, 5 e 6 no teste de labirinto de água de Morris, que correspondia ao dia 82, 83 e 84 da operação. As parcelas de gráfico de linha mostram a latência média para encontrar a plataforma escondida para cada grupo no dia 1, 2, 4, 5 e 6 no teste de labirinto de água Morris. Os dados foram analisados por ANOVA de duas vias (dia x grupo) com medidas repetidas. Quer dizer n ± SEM. = 6. ^** < p 0,01, vs grupo Sham-operado. A figura foi modificada da referência 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Compostos Aβ causada perda de retenção de memória de rato:

A retenção da memória de rato foi medida pelo julgamento de sonda no dia 3 do teste de labirinto de água de Morris, que correspondia ao dia 81 pós cirurgia. Na retenção da memória 1 dia experimental, o grupo composto de Aβ-tratado levou menos tempo a nadar, nadar a distância e cruzando o número no Q1 dentro de 60 s, o que correspondeu a 32.14% e 30,11% 78.95% (p < 0,01), respectivamente, do que aqueles da grupo de operação (Figura 4A, 4B). Esses resultados mostram que os compostos Aβ pode produzir perda de retenção de memória em ratos.

Figura 4 . Aβ composto produzidos por imparidade de retenção de memória rato. O julgamento de sonda foi utilizado para avaliar a retenção da memória por 1 dia de natação conquista no dia 3 no teste de labirinto de água Morris, que foi realizado em dia 81 pós cirurgia. (A) tempo a nadar, nadar a distância e cruzando o número no Q1 dentro de 60 s no julgamento de sonda (sem plataforma). Os dados foram analisados por ANOVA One-Way com o teste de múltipla-gama. Quer dizer n ± SEM. = 6. ^** < p 0,01, vs o grupo Sham-operado. (B) a natação trajetória de ratos no julgamento de sonda. (A) operação grupo, mostrando a distância e maior tempo de natação no quadrante alvo (Q1). (B) tratados com compostos Aβ grupo, mostrando menos tempo de natação e distância no quadrante alvo (Q1). A figura foi modificada da referência 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Compostos Aβ influenciado rato velocidade de natação:

O rato nadando a velocidade foi calculado pela plataforma visível julgamento no dia 7 do teste de labirinto de água Morris, que correspondia ao dia 85 pós-operatório. O rato nadando a velocidade, com base no cálculo da distância e tempo para pisar na plataforma, de cada grupo na piscina de natação não foi significativamente diferente. Portanto, as diferenças individuais no rato nadando a velocidade poderiam ser excluídas, que indica que a motivação e as habilidades motoras eram essencialmente intactas em todos os ratos (Figura 5).

Figura 5 . Compostos Aβ influenciado velocidade de natação de rato. O rato nadando a velocidade foi calculado pela plataforma visível julgamento no dia 7 do teste de labirinto da água Morris, que foi realizado no dia 85 após a operação. O rato nadando a velocidade de cada grupo não foi significativamente diferente. Os dados foram analisados por ANOVA One-Way com o teste de múltipla-gama. Quer dizer n ± SEM. = 6. A figura foi modificada da referência 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Compostos Aβ causada alteração morfológica Neuronal do rato:

Todos os ratos foram mortos por decapitação no dia 86 da cirurgia. A inspeção visual encontrado que uma superfície amarela ou um córtex cerebral fino ou recolhido apareceu em vários compostos ratos tratados com Aβ. Comparado com o grupo de operação (figura 6AA2), observação de microscopia óptica do grupo composto de Aβ-tratada por ele manchado, encontraram alterações patológicas neurônio hippocampal, tais como degeneração tangles, neuronophagia, pyknosis nuclear e nuclear margination (figura 6AB2). Além disso, a parte do córtex cerebral no grupo composto de Aβ-tratados revelou necrose presente típico, que foi caracterizado por rompidas as membranas celulares, núcleos fragmentados e infiltração de células inflamatórias extensas na região necrótica ( Figura 6A B3). Isso indica que o composto Aβ pode resultar em neuronais lesões patológicas estruturais em ratos.

Além das alterações patológicas da estrutura neuronal, comparado com o grupo de operação, a contagem de neurônio foi também significativamente diminuída no hipocampo e córtex cerebral (exceto para a amostra de necrose presente) dos compostos Grupo de aβ-tratados. O número de neurônio foi 63.86% (p < 0,01) inferior do grupo de operação nas seções de CA1 hippocampal de 0,125 mm e 55.46% (p < 0,01) menor no córtex cerebral seções 0.0352 mm2 (Figura 6B), o que sugere que o composto Aβ pode resultar em uma contagem diminuída do neurônio.

Figura 6 . Compostos Aβ causou alteração morfológica neuronal de rato. (A) imagens representativas dos neurônios corticais cerebrais e hipocampo, manchados com. (A1–B1) Hipocampo 40 x; (A2–B2) CA1 do hipocampo 400 x; (A3–B3) Córtex cerebral x 400. (A1–A3) Grupo de operação; (B1–B3) Grupo de Aβ-tratados composto; mostra perda de neurônio marcado, degeneração tangles (→), neuronophagia (←), nuclear pyknosis (↗), membranas celulares nucleares margination (↙) no hipocampo, necrose presente típico (★), interrompido, um grande número de células inflamatórias infiltradas no córtex cerebral na parte do grupo composto de Aβ-tratados. Barra de escala de A1, B1 = 10 µm; Barra de escala de A2, A3, B2, B3 = 100 µm. (B) números de neurônios com mancha no hipocampo e córtex cerebral, que foram contados sob um microscópio (400x). Cada volume representa a média ± SEM de 9 campos visuais de 3 amostras independentes (n = 3). ^** < p 0,01, vs grupo Sham-operado.  A figura foi modificada da referência 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A microscopia eletrônica observou a ultraestrutura subcellular dos neurônios do hipocampo. A subestrutura de neurônios hippocampal do grupo composto de Aβ-tratada (Figura 7B1 – B4) significativamente foram destruídos, apresentando inchaço mitocondrial e ruptura de cristas, densidade de elétrons mitocondrial aumentada, dilatadas áspero retículo endoplasmático, poliribosomami pescavore e polymicrotubules, alguns densidade pós-sináptica (PSD), muitos lisossomos secundários e sedimentos de lipofuscina no citoplasma, em comparação com o grupo de operação (Figura 7A1 – A4). A membrana nuclear foi rude e afundado, a eucromatina foi condensada e desnaturada, as camadas de mielina foram soltas ou degeneração e axônios internos e fibras foram atenuadas.  Estes resultados demonstram que os compostos Aβ pode produzir danos de subestrutura neurônio em ratos.

Figura 7 . Estrutura subcelular de neurônio hippocampal avaliada pela observação microscópica de elétron. A1 -A4: grupo Sham-operado. Barra de escala de A1 = 4 µm, 12, 000 x; Barra de escala de A2 = 3 µm, 15, 000 x; Barra de escala de A3 = 5 µm, 10, 000 x; Barra de escala de A4 = 1 µm, 35, 000 x. (B1–B4) Grupo composto de Aβ-tratados. (B1) Neurônio e pyknosis nucleares (←), condensação de eucromatina ou degeneração (#), ondas de pé astrocyte (*), mitocôndrias de elétrons de alta densidade (▲), bainha de mielina camadas soltas ou atenuação (→); (B2) Maior GFAP, mitocôndrias de elétrons de alta densidade (▲), bainha de mielina camadas soltas ou atenuação (), lisossomos secundários maiores (↑), pericitos pyknosis, pericitos condensação de eucromatina ou degeneração (☆), ondas de pé astrocyte (*), densidade de elétrons de alta mitocôndrias (▲), mais lipofuscina (↓), bainha de mielina camadas soltas ou atenuação (→). B4: mais neurotransmissor excitatório (#), elétrons de alta densidade ou lesão da membrana mitocôndria (▲), menos sinapse. Barra de escala de B1, B2 = 10 µm, 5, 000 x; Barra de escala de B3 = 5 µm, 8, 000 x; Barra de escala de B4 = 1 µm, 40, 000 x. A figura foi modificada da referência 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Compostos Aβ causada Aβ fardo nos neurônios de rato:

Coloração vermelho Congo foi usado para detectar a carga Aβ sobre os neurônios. Os resultados mostram que os compostos Aβ notavelmente pode induzir o fardo Aβ intracelular no hipocampo de rato e córtex cerebral (Figura 8A). O número positivo de células com Aβ vermelho manchado pelo vermelho do Congo no hipocampo e córtex cerebral do grupo composto de Aβ-tratados é 8.05 - e 4.09 vezes (p < 0,01) maior do que aqueles do grupo de operação (Figura 8-B). Isto demonstra que Aβ composto pode aumentar a carga Aβ neurônio em ratos.

Figura 8 . Compostos Aβ causou fardo Aβ no rato neurônios. (A) imagens representativas do neurônio Aβ positivo manchado pelo vermelho do Congo no hipocampo e cerebral cortical. (A1–B1) CA1 do hipocampo 400 x; (A2–B2) Córtex cerebral x 400. (A1–A2) Grupo de operação; (B1–B2) Compostos Aβ-lote de ensaio, mostra mais Aβ positivo células manchadas pelo vermelho Congo. Barra de escala = 10 µm, 400 x. (B) números positivos de neurônios Aβ manchados pelo vermelho do Congo no hipocampo e córtex cerebral, que foram contados sob um microscópio (400x). Cada volume representa a média ± SEM de 9 campos visuais de 3 amostras independentes (n = 3). ^** < p 0,01, vs grupo Sham-operado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Compostos Aβ causada NFT deposição nos neurônios de rato:

Coloração de nitrato de prata foi usada para detectar a deposição de NFT em neurônios. Os resultados mostram que compostos Aβ, visivelmente que pode causar a deposição intracelular de NFT em ratos, hipocampo e córtex cerebral (Figura 9A). O número positivo de células com NFT marrom manchado por nitrato de prata no hipocampo e córtex cerebral do grupo composto de Aβ-tratados é 9.75 - e 4.82 vezes (p < 0,01) maior do que aqueles do grupo de operação (Figura 9B ). Isto demonstra que os compostos Aβ pode aumentar a agregação de NFT neurônio em ratos.

Figura 9 . Compostos Aβ causou agregação NFT no rato neurônios. (A) imagens representativas dos neurônios NFT positivos manchados pelo nitrato de prata em hipocampo e córtex cerebral. (A1–B1) CA1 do hipocampo 400 x; (A2–B2) Córtex cerebral x 400. (A1–A2) Grupo de operação; (B1–B2) Grupo composto de Aβ-tratados. mostrando o NFT mais positivo células manchadas pelo nitrato de prata em grupo composto-tratados. Barra de escala = 10 µm, 400 x. (B) positivo NFT neurônios números de manchadas pelo nitrato de prata em hipocampo e córtex cerebral, que foram contados sob um microscópio (400x). Cada volume representa a média ± SEM de 9 campos visuais de 3 amostras independentes (n = 3). ^** < p 0,01, vs grupo Sham-operado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

É sabido que a perda de memória e aprendizagem são principais sintomas clínicos em pacientes². O procedimento descrito aqui é um método na vivo para estudar AD; Nós adaptamos um protocolo previamente publicado que testou um medicamento para aliviar os déficits de memória e lesões neuronais em um rato modelo⁴. Nosso protocolo fornece detalhes importantes para obter dados valiosos, bem como uma alta de sobrevida dos animais que o modelo com sucesso a operação, déficits de memória, lesões de neurônio, fardo Aβ e deposição de NFT, para imitar o AD (no presente experimento, a taxa de sobrevivência e taxa de sucesso do modelo de operação são mais de 90%). Estes ratos de modelo de sucesso foram usados para medir a sua memória espacial com o teste de labirinto de água de Morris. O julgamento de navegação posicionamento encontrado que os compostos Aβ pode causar perda de aquisição de memória em ratos; o julgamento de sonda encontrou que os compostos Aβ pode diminuir a retenção da memória de rato; e a julgamento de reversão encontrado que o Aβ composto pode resultar em re-aprendizagem imparidade de rato. Esses dados de teste de labirinto de Morris água mostram que os compostos Aβ pode induzir memória espacial de rato. Em geral, injetando ratos intracerebroventricularly com Aβ25-35, em combinação com AlCl₃ e TGF-β1 criou um viável e credível no vivo AD-como modelo animal para o laboratório.

Estudos anteriores mostraram que o volume do cérebro em pacientes AD é 10% inferior de indivíduos saudáveis. Atrofias vários podem ser encontradas no hemisfério cerebral por observação visual. O grau de atrofia cortical está positivamente relacionado com o comprometimento de memória¹⁹. A histologia, o grande número de perda de neurônio e grave patologia morfológica perturba diretamente a função de memória em pacientes de AD²⁰. No presente estudo, a observação microscópica de Luz/elétron encontrado que os ratos injetados com compostos Aβ exibido dramáticas alterações neuropatológicas, incluindo perda de neurônio e o rompimento de estrutura neuronal e subcellular. Este resultado corrobora o distúrbio de memória espacial de rato induzido por compostos Aβ e é semelhante ao estado de pacientes.

É sabido que a carga Aβ do cérebro e agregação de NFT são considerados os traços mais importantes do histopathogenic em AD. Eles podem destruir a estrutura neuronal, perturbar a sinalização neural, interromper a função neuronal e resultar em demência avançada¹⁷. O presente modelo animal encontrado fardo Aβ e agregação de NFT no cérebro, que de acordo com o estado de paciente de AD. Portanto, as lesões de neurônio presente em ratos induzidos por compostos Aβ podem ser usadas como um modelo para estudar patologia neuronal e estratégia de tratamento de AD.

Os seguintes são exemplos de efeitos de drogas em modelos do rato AD de triagem: Zhao et al, relatada que ambos os flavonoides de Scutellaria caules e folhas (SSF) e Scutellaria barbata (SBF) pode atenuar a perda de memória de rato e apoptose induzida por compostos Aβ^8,9. Guo et al, também relataram que SBF pode inibir a agregação de NFT e phosphorylation de excesso da proteína tau no lado Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 e Thr231 e diminuir a expressão de proteínas e RNAm GSK-3beta, CDK5 e PKA em ratos tratados com Aβ compostos²¹ . Simultaneamente, Shang et al, também relataram que SBF pode suprimir a proliferação de astrocyte e micróglia e inferior Aβ1-40, Aβ1-42, e β-site APP fendendo a enzima 1 (BACE1) a expressão de RNAm no cérebro de Aβ composto ratos²². Baseado nos resultados acima, nosso modelo animal é vantajoso sobre outro modelo AD-como, que envolvem mais função neuronal e desordem da estrutura.

Sobre outro modelo AD-como, injeção intracerebroventricular único de Aβ para ratos pode causar déficits de memória de rato, perda de neurônio e proliferação de neurogliocyte, mas pode ou não ter Aβ e NFT deposição²³. Ratos expostos a doses elevadas de Al parecem ter uma elevada taxa de sucesso, imitar AD e um econômico modelo animal, com deficiência de memória, perda de neurônio, proliferação de neurogliocyte e placa senil (SP) e agregação de NFT no cérebro. No entanto, a dose alta de Al pode causar lesões do fígado de ratos e anorexia, acompanhado com diminuição de peso²⁴. O rato envelhecido é outro AD-como modelo. Os ratos envelhecidos demonstram déficits de memória, as alterações patológicas da estrutura neuronal/subestrutura, deposição de lipofuscina, mas sem carga Aβ e agregação de NFT. Ratos de mais de 24 meses de idade são considerados idosos para este modelo e, portanto, requer um longo período de alimentação e, assim, o custo é maior de^17,25. SAMP8 e APP ratos transgénicos são os imitam mais próximo ao anúncio e eles são o mais ideais modelos para investigar AD. Mas ambos os modelos animais são fixados o preço mais alto e limitam-se a usar na laboratório^26,27. Em comparação com os modelos animais acima, nosso modelo de compostos modelo animal Aβ-Tratado tem um custo mais baixo e alto desempenho, tornando-se uma ferramenta ideal para estudar AD.

Em conclusão, injeção intracerebroventricular de Aβ25-35 combinado com AlCl₃ e TGF-β1 para ratos oferece um valioso na vivo modelo animal para entender melhor o comprometimento de memória espacial, lesões neuronais, fardo Aβ e deposição de NFT AD subjacente. Este modelo fornece um rápido e relativamente simples protocolo experimental com um animal de alto sobreviver taxa e taxa de sucesso alta modelo de operação, bem como uma alta taxa de duplicação, que mostrou ser mais económico. O presente modelo animal é um modelo eficaz para imitar AD e ainda mais pode validar-se por ser usado para imitar a várias outras doenças.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rat	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China	SCXK(Jing) 2012-0001	300–350 g
Morris water maze	Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China	No
Movable small animal anesthesi	RWD Life Science Co., Ltd. China	R580
Brain Stereotaxic Apparatus	RWD Life Science Co., Ltd. China	68001
Flexible bone drill	Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China	BW-sD908
Transmission electron microscope	Japan Co., Ltd. Japan	JEM-1400
Two channel microinjection pump	RWD Life Science Co., Ltd. China	RWD202
EM microtome	Hitachi Co., Ltd. China	H-7650
Dummy cannula	RWD Life Science Co., Ltd. China	62001	0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html
Guide cannula	RWD Life Science Co., Ltd. China	62101	0.D.0.40mm/M3.5
Internal cannula	RWD Life Science Co., Ltd. China	62201	0.D.0.41×I.D.0.25mm/M3.5
Tighten the nut	RWD Life Science Co., Ltd. China	62501	0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5
Fixing screw	RWD Life Science Co., Ltd. China	62514	M1.2×L2.0mm(100BAO)
The screwdriver	RWD Life Science Co., Ltd. China	62999	45*1mm
PE Tubing	RWD Life Science Co., Ltd. China	62302
Amyloid beta 25-35	Sigma Aldrich Co. USA	SCP0002-5MG
Recombinant human transforming growth factor-β1	PeproTech Inc. USA	100-21
Aluminium trichloride	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China	3011080
Congo red	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China	3010016
Silver nitrate	Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China	20150720
Denture base material	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. China	20170609