Alzheimer hastalığı Composited amiloid Beta protein Intracerebroventricular enjeksiyonla sıçan hayvan modelinde değerli bir taklit kurulması

Özet

Bu Alzheimer hastalığı Rat mekansal hafıza bozukluğu, nöronal patolojik değişiklikler, nöronal amiloid beta protein (Aβ) yük değerlendirilmesi tarafından taklit etmek için bir protokol ve neurofibrillary tangles toplama, Aβ25-35 iğne ile indüklenen kombine Alüminyum trichloride ve rekombinant insan büyüme faktörü-β1 dönüştürme.

Özet

Alzheimer hastalığı (Ah) yavaş yavaş bellek yok eder ve nöron kaybı ve yapı değişikliği eşliğinde bir geri dönüşü olmayan, progressive beyin hastalığıdır. Reklam hasta dünya çapında bir artış ile patoloji ve hastalığın tedavisinde uluslararası ilaç sektöründe bir odak noktası haline gelmiştir. Bu nedenle, reklam laboratuvar olarak taklit etmek için hayvan modeli kurulması büyük önem taşıyor.

Burada, biz reklam taklit bir sıçan hayvan kurmak için detaylı bir protokol tarif olsa da intracerebroventricular enjeksiyon amiloid beta protein 25-35 (Aβ25-35) alüminyum trichloride (AlCl₃) ve anterodorsal talamik çekirdeği ile birlikte model Enjeksiyon rekombinant insan büyüme faktörü-β1 (RHTGF-β1) fareler için dönüştürme. Dahil olmak üzere reklam ilgili işaretleri ölçüldü: kayma bellek, nöronal yapısı ve alt yapı, nöronal Aβ ve neurofibrillary tangles (NFT) üretim. Bu fare modeli mekansal hafıza bozukluğu, nöronal yapısı ve alt yapı patolojik değişiklikler, nöron hücre içi Aβ yük ve NFT toplama gösterir ve nöronal yapısı ve fonksiyonu bozukluğu olan klinik için yakın bir taklit sağlar Reklam hastalar. Böylece, sunulan reklam sıçan modelprovides nöronal fonksiyon, nöronal patoloji ve uyuşturucu testi ile taranması reklam keşfetmek için değerli vivo içinde aracı.

Giriş

İyi reklam Ana klinik sendrom olarak kademeli hafıza kaybı ile bir kronik ve ilerleyici nörodejeneratif hastalık olduğu bilinmektedir. Genel Patoloji sinir doku atrofi, nöron ve synapse kaybı yanı sıra tüm geliştirme ve reklam^1,2klinik tezahürü ve yer nöronal hücre altı yapı ve işlev bozuklukları, işte. Bu hayvanlar intracerebroventricularly Aβ ile enjekte edildi nörotoksik bazı olaylar nöron kaybı, kalsiyum homeostazı bozulma, nöron apoptozis ve reaktif oksijen türleri aşırı üretimi³içeren beyinde oluşur bildirilmektedir. Ancak, reklam patogenezinde multipl faktörler söz konusu ve böylece reklam daha iyi bir model kurmak için önemlidir.

Detaylı bir protokol vivo içinde kopyalama reklam modeli RHTGF-β1 anterodorsal talamik çekirdeği enjeksiyon e doğru rats ile birlikte Aβ25-35 ve AlCl₃, intracerebroventricular enjeksiyonuyla oluşturmak üzere burada açıklanmıştır. Bu sıçan modelhighly insan nöronal fonksiyon ve bellek bozukluğu, nöron kaybı ve yapısı hasar, apoptozis, hücre içi Aβ yük ve NFT toplama^4,5,6 dahil olmak üzere reklam, histopathogenesis taklit eder ^{, 7 , 8 , 9}. AlCl₃ engeller yatırılan Aβ çözünür Aβ şekillendirme ve RHTGF-β1 yatırılan Aβ üretim teşvik etmek ve reklam oluşumu¹⁰kolaylaştırmak. Çeşitli faktörler bu saldırı için neuron uygun olarak reklam Patogenez çok var.

86 gün tüm deney yayılmış: Şekil 1 gösterir zaman çizelgesi deneysel tasarım, hayvan cerrahi, hayvan modeli tarama, hayvan mekansal hafıza testi ve numune hazırlama zaman amacı ile. Operasyonun ilk gününde, RHTGF-β1 anterodorsal talamik çekirdek microinjected. İkinci işlem gününde, Aβ25-35 ve AlCl₃ lateral ventrikül her gün 14 gün üst üste sabah ve öğleden sonra 5 gün üst üste için sırasıyla microinjected. Bütün fareler için 45 gün ameliyat sonrası kurtarmak için izin verildi. Morris su labirent bellek bozukluğu olan başarılı modeli fareler için ekran ve rats mekansal hafıza değerlendirmek için kullanıldı. Fareler 4 gün üst üste günde 2 deneme ile eğitim su labirent uygulandı ve üzerinde gün 4 eğitim, fareler Morris su labirent performans için bellek bozukluğu ile değerlendirildi. Bütün fareler 37 gün hayvan modeli tarama sonra beslenmeleri devam etti. Sıçan mekansal hafıza Morris su labirentinde üzerinde 7 gün üst üste gün 79 gün 85 ameliyat sonrası için test edildi. Bütün fareler gün 86 beyin numune hazırlama için işten çıkarma tarafından kurban edildi.

Şekil 1. Deneysel tasarım zaman çizelgesi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protokol

Bu yordamı düzenlemeler, deneysel hayvan devlet komite bilim ve teknoloji Çin tarafından 31 Ekim 1988'de verilen yönetim olduğunu¹¹. Bilim adamları kurulan ve kendi kurumsal ve ulusal hayvan düzenleyici kuruluşları tarafından onaylanmış yönergeleri takip etmelidir.

Not: Hayvan ve vekiller: dört aylık erkek Sprague-Dawley rat (300-350 g) bu deneme için girildi. Bütün fareler grupları (dört ya da beş kafes başına) bir sıcaklık 23 ± 1 ° C 12-h koyu döngüsü ile yer alan. Gıda ve su kullanılabilir ad libitumidi. Fareler için 7 gün önce yordamı gerçekleştirilen konut koşullarını acclimatized. Aβ25-%35 1 DMSO tuz 1 mg/ml içinde çözünmüş ve 5 dakika içinde tamamen eriyene kadar ultrasonik osilatör için sonicated. AlCl₃ ve RHTGF-β1 sırasıyla % 1 ve 0.1 mg/mL, serum fizyolojik içinde çözünmüş. Kongo kırmızısı, gümüş nitrat ve diğer kimyasalların analitik nitelikte olduğunu ve sıradan ticari kaynaklardan satın alındı.

1. cerrahi müdahale

Not: 20 erkek Sprague-Dawley rat ile birleştirilmiş Aβ anterodorsal talamik çekirdeği ve lateral ventrikül microinjected ve bileşik Aβ tedavi grubu olarak belirlenmiş. Başka bir 20 sıçan için aynı işlemi tabi tutuldu ama % 0,1 DMSO tuzlu mikroenjeksiyon alınan ve sham çalışan grup olarak belirlenmiş.

1. İnhalasyon tarafından % 100 isoflurane farelerle uyuşturan ve bir beyin stereotaksik aparatı hakim ol.
2. Cerrahi makas ile başın tepe üzerinde kürk tıraş ve iodophor ile dezenfekte. Sonra tek kullanımlık cerrahi havlu kafa kapağı.
3. Medyan boyuna calvaria cerrahi bisturi ve makas ile birlikte baş cilt üzerinde bir kesi yapmak.
4. Subkutan doku ve fasya ayrı, kanamayı durdurmak için steril bir kuru pamuk ile kafatası hasta silin ve bregma bir marker kalemle işaretlemek.
5. Fare bakın beyin stereotaksik harita¹²; başlangıç noktası olarak bregma göz önüne alındığında, üç puan, anterodorsal talamik çekirdeği (reklam) işareti (arka (P): bregma için 2.0 mm; lateral (L): orta hat için 1.4 mm) RHTGF-β1 enjekte ve sabitleme bir vida, lateral ventrikül (LV) alan (için arka (P): 0.8 mm için bregma; lateral (L): orta hat için 2.0 mm) Aβ25-35 ve AlCl3 ve yer sabitleme ikinci vida enjekte için (açık (F): bregma için 2.0 mm; lateral (L): orta hat için 1.5 mm).
6. Hafifçe üç 1 mm çapı ile kafatası Yukarıdaki üç puan belirlenmiş bir esnek kemik matkap delik (1.5. adım). Beyin dokusu bıçaklama önlemek gerekli daha derin yatmayacaksın.
7. Kanamayı durdurmak ve art arda ile steril kuru pamuklu kafatası yüzeyi temizleyin.
8. Mikro-enjeksiyon pompası, 4.6 mm derinlikte beyne bağlı bir iğne yerleştirin ve nazikçe 1 μL enjekte RHTGF-β1 (10 ng) ad alanı içine. İğne 2 dk sonra enjeksiyon kalın ve yavaş yavaş iğne (ek dosya 1) çekin.
9. Ad ve yer kafatası sabitleme ikinci vida puan belirlenmiş kafatası içine iki vidayı düzeltmek (1,5 özel içilir. adım) küçük bir tornavida ile. Beyin dokusu bıçaklama önlemek gerekli daha derin yatmayacaksın.
10. Kanül implantasyon sistemi (ek dosya 2) montajı, kukla kanül Kılavuzu kanülü dezenfeksiyon işleminden sonra yüksek basınç tarafından Ekle.
11. Paslanmaz çelik boru Kılavuzu kanül 4.6 mm, beyne rats stereotaksik aparatı sahibinin kanül yardımıyla LV alanı (ek dosya 3), kafatası delikten takın.
12. Takma diş temel malzemesi Kılavuzu kanül plastik ayaklı ve iki vidayı Kılavuzu kanül immobilizing için ve kapak deri enfeksiyonu önlemek için tüm cilt kesi kadar kapsayacak şekilde ezmesi koy 1 mL başına 1.5 g oranında takma diş temel su ile karıştırın.
13. Günü 2 işlem, fareler küçük hayvan anestezi makinesi kullanarak isoflurane inhalasyon ile uyuşturan. Kukla kanül çizmek, iç kanül Kılavuzu kanül yerleştirin ve iç kanül hareketsiz için sabitleme vida canı cehenneme.
14. Polietilen boru bağlantı yapan mikroenjeksiyon pompa iç kanül ayarla ve 1 μL/dak Microinject Aβ25-35 veya AlCl3 LV için enjeksiyon hızını düzenleyen
15. 4 μg (1 μL) microinject Aβ25-35 günlük sabah ve 3 μL AlCl₃ (% 1) 14 gün öğleden sonra isoflurane anestezi altında 5 gün boyunca her gün için.
16. Enjeksiyon bittikten sonra 5 dakika bekleyin, yavaşça iç kanül çizmek ve kukla kanül yeniden Kılavuzu kanül ekleyin.
17. Gün 15 yazı üzerine (ki son Aβ25-35 enjeksiyon gün karşılık gelir) cerrahi kanül implantasyon sistemi ortadan kaldırmak. Yavaşça takma diş temel malzeme katı cerrahi makas ve forseps ile kaldırmak sabitleyen iki vidayı sökün, Kılavuzu kanül çekin ve betadin yarayla dezenfekte edin. Delik kafatası kemik çimentosu ile doldurun ve bir basit kesintiye uğramış dikiş yöntemiyle deri dikiş.
18. Sham işletilen grubu ile aynı işlemi gerçekleştirmek ve % 0.1 DMSO serum microinject.
19. Ameliyat sonrası bakım
    1. Kafes başına 2 fareler işleminden sonra ev ve 30 gün için yiyecek sağlamak.
       Not: sahte ile çalışan grup hayatta (% 90 başarı oranı işlem) 18 fareler ve hayatta composited tedavi Aβ grubunda (% 95 başarı oranı işlem) 19 sıçanlar.

2. tarama başarılı modeli fareler ve mekansal hafıza Morris su labirent ile değerlendirilmesi için

1. Morris su labirent
   Not: Morris su labirent fare kayma bellek¹³değerlendirmek için kullanıldı. Morris su paslanmaz çelik dairesel tank ile 120 cm çapında ve 50 cm derinlik labirentidir. Davranışsal Nöroloji J. Nunez¹⁴tarafından açıklanan "altın standart" paradigma dayalı su labirent testi gerçekleştirildi.
   1. Havuz suyu birkaç damla gıda boyası ile kendisine.
   2. Su 31,5 cm ve 23 ± sıcaklığında derinliği korumak 1 ° C.
   3. 1,5 cm dairesel şeffaf Pleksiglas platformu su yüzeyinin altında ayarlayın.
   4. Tüm kayma sinyaller su labirent çevresinde su labirent testler sırasında değişmez olduğunu savunuyor.
   5. Havuzun açıklayıcı veri toplama hayali hatlarında 4 eşit çeyrek daire bölün.
   6. Gizli platformu su labirent ilk çeyreğinde (Q1) yerleştirin.
   7. (Gecikme süresi, yörünge veya geçişi numarası tarafından ölçülen) davranışları yüzme sıçan bir video kameradan bilgisayar tabanlı grafik analitik yazılım bağlı su labirent üzerinden yakalamak.
2. Bileşik Aβ tedavi grubuna başarılı modeli fareler için eleme
   1. Gün cerrahi 45, bellek bozukluğu olan başarılı modeli fareler için ekran ve tarama oranı (SR) toplamak 4 gün üst üste için eğitim Morris su labirent gerçekleştirin.
      Not: SR her bileşik Aβ tedavi sıçan ortalama gecikme süresi tanımlanır ve suyun altında gizli platformu bul Rats'in sham çalışan grup üzerinde gün 4 su yüzey labirent eğitim. "Bir" gizli platformu bulmak için birleştirilmiş her Aβ tedavi sıçan ortalama gecikme süresi ve "B" sıçan gizli platformu, eğitim, aşağıdaki denklemde su labirent 4 gününde bulmak için sahte işletilen grubunun ortalama gecikme süresi:
      
      SR 0,2 bir bileşik Aβ tedavi fare için daha büyük zaman, fareyi bir başarılı model fare ile birleştirilmiş Aβ tedavi sıçan¹⁵Engelli bellek kadar kabul edildi. Gün içi bellek performansı 2 denemeler veri için ortalama değerini gizli platformu bulmak için fareler tarafından hesaplanır. Öyle ki fareler su labirent deposu ve arama 60 içinde gizli platformu için yüzmek için izin Morris su labirent test sürecinin tasarlanmıştır s. Bir sıçan 60 içinde gizli platformu dışarı bulamadık Eğer s, daha sonra fareyi deneyci el ile platformda konulmuştur. Bir sıçan gizli platformda dolduğunda (bağımsız olarak veya destekli), fare izin oldu orada kalmak için 20 s. O zaman, fareyi tankından kaldırıldı ve 10 için fiziksel bir kurtarma izin s 2 denemeler arasında.

3. nöron muayene

1. İsoflurane anestezi altında gün 86 sonrası cerrahi olarak işten çıkarma (Şekil 1) tarafından fareler ötenazi.
2. Beyin buza koy ve yavaşça raphe adlı iki hemisferlerin ayrı. Optik chiasma ve % 4 formaldehit nöron Hematoksilen ve eozin (HE), Kongo kırmızısı veya gümüş nitrat ışık microcopy gözlenmesi için düzeltme sol hemisfer leke (bkz. Bölüm 4-6) almak. Elektron microcopy gözlem (Bölüm 7) için % 2.5 oxazolidin sağ hemisfer hipokampus CA1 alanında düzeltmek.
3. Beyin için ışık/elektron microcopy numune hazırlama, yukarıda açıklanan^16,17olarak işlemek.

4. nöron o boyama

1. Her slayt (20 dk her) degrade alkol (% 100, % 95, % 90'ı, % 80 ve % 70 alkol) ile distile su duman Hood için deparaffinize.
2. Hematoksilen (% 0,5 w/v) ile 3 min için leke ve ilişkisiz boya slaytlardan kaldırmak için dokunun su ile durulayın.
3. Durulama ile % 0,1 hidroklorik asit alkol 1 için s günahı nükleuslar rengini kaldırmak için.
4. % 0.5 amonyak çözüm 2 min için arka plan döner açık mavi kadar bırakın.
5. Leke % 1 eozin ile 1 dk için.
6. Degrade alkol (% 70, %80, % 90, %95 ve % 100 alkol) ile 5 min için kurutmak.
7. Ksilen içinde temizleyin ve reçine montaj orta ile monte edin.
8. Gözlemlemek ve deneysel tasarım kör bir kişi tarafından bir optik mikroskobu ile o leke hipokampüs orta CA1 0,125 mm ve 400 x büyütme, serebral korteks 0.0352 mm² başına oturma nöronlar say.

5. Kongo kırmızısı nöron Aβ yük raporlaması için boyama

1. Her slayt (20 dk) degrade alkol (% 100, % 95, % 90'ı, % 80 ve % 70 alkol) ile distile su duman Hood için deparaffinize.
2. 20 dakikadır Kongo kırmızısı ile çözüm (0.5 g Kongo kırmızısı, 80 mL metil alkol, 20 mL glycerinum) çalışma leke.
3. 5 min için distile suda yıkayın.
4. Hızlı bir şekilde alkali % 80 alkol çözümü (0.2 g alkol/100 mL potasyum hidroksit) için 3 ile ayırt s.
5. İki kez, her biri için 5 min distile su ile durulayın.
6. Gill'in hematoksilen 3 dakika içinde counterstain.
7. 2 min için musluk suyundaki durulayın.
8. Amonyak suya daldırma (amonyum hidroksit musluk suyu ve iyice karıştırın birkaç damla eklemek) için 30 s veya bölümleri maviye kadar.
9. 5 min için musluk suyundaki durulayın.
10. Degrade alkol (% 70, %80, % 90, %95 ve % 100 alkol) ile kurutmak.
11. Ksilen içinde temizleyin ve reçine montaj orta ile monte edin.
12. Gözlemlemek ve deneysel tasarım kör bir kişi tarafından bir optik mikroskobu ile Kongo kırmızısı, 400 x büyütme ile lekeli hücreleri saymak.

6. gümüş nitrat nöron NFT oluşumu raporlaması için boyama

1. Her slayt (20 dk) degrade alkol (% 100, % 95, % 90'ı, % 80 ve % 70 alkol) ile distile su duman Hood için deparaffinize.
2. % 20 gümüş nitrat çözümü ve kapatma aracı için 20 dk karanlıkta bırakın.
3. Distile suda iki kez, her zaman için 5 dakika yıkayın.
4. Gümüş amonyak çözümde bırakın. Amonyak çözüm % 20 gümüş nitrat çözümü haline bırakın ve çözüm için açıklama bulanıklık gidene eklemek. Aynı anda, çözüm için 15 dk bir cam çubuk ile karıştırın ve %1 seyreltilmiş amonyum hidroksit 2 min için içine koymak.
5. Axon siyah bloğunda gözlenen kadar slayt 3-7 dk için gelişmekte olan çalışma çözüm içine koyun.
6. %0,1 sulandırılmış amonyak çözüm 1 dk. için bırakın ve 1 dk. için su ile durulayın.
7. 2 min için % 5 sodyum thiosulfate ile atın ve 5 min için su ile durulayın.
8. Degrade alkol (% 70, %80, % 90, %95 ve % 100 alkol) ile kurutmak.
9. Ksilen içinde temizleyin ve reçine montaj orta ile monte edin.
10. Gözlemlemek ve deneysel tasarım kör bir kişi tarafından bir optik mikroskobu ile hücre 400 x büyütme, gümüş nitrat leke için kayıt.

7. hipokampal nöron Ultrastructure ölçüm

1. Çeşitli küpleri (1 x 1 x 1 mm³) farenin hipokampus CA1 oyulmuş ve % 2.5 oxazolidin 4 ° C'de 2 h için yer
2. Küpleri ile PBS üç kez (pH 7.2, her zaman 10 dakikadır) durulayın.
3. Küpleri % 1 osmic asit 4 ° C'de 2 h için fix
4. Çift Kişilik distile su 3 küplerinde durulama x (10 dakika) her zaman için.
5. Degrade alkol % 50, % 70 ve % 90'ı (her biri için 10 dk), iki kez (15dk için her zaman) % 100 kurutmak.
6. Propilen oksit iki kez (her saat 15 dakikadır), propilen oksit: reçine 1:1 (60 dk) için her zaman oda sıcaklığında ve propilen oksit: reçine 1:4 (için her zaman oda sıcaklığında 60 dk) yerine. Reçine (120 dk, oda sıcaklığında) içinde bekletin.
7. EPON 812 katıştırabilir ve polimerize (5 h/35 ° C, 5 h/60 ° C, 5 h/80 ° C).
8. Semithin bölümler (1 µm) kesmek, metilen mavisi tarafından leke ve mikroskop altında yerelleştirilmesine.
9. Ultra-ince kesitler leke (50 nm) uranyl-o-asetat ve kurşun sitrat ile.
10. JEM-1400 elektron mikroskop altında ve toplamak görüntüleri inceleyin.

Sonuçlar

Tüm verileri SEM SAS/STAT paket istatistiksel analiz hesaplamak için kullanılan ortalama ± sunulmaktadır. Bellek edinme ve hafıza yeniden öğrenme testi gizli platformu bulmak için gecikme süresi Grup farklılıkları iki yönlü varyans analizi (ANOVA) ile tekrarlanan önlemleri tarafından analiz edildi. Sonda deneme ve neurons sayısını grup farklılıkları tek yönlü ANOVA Duncan'ın birden çok aralığı test tarafından takip tarafından analiz edildi. p < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı¹⁸olarak kabul edildi.

Tarama için başarılı modeli Rats Composited Aβ tedavi grubu için bellek bozukluğu olan:

Sıçan sham çalışan grup her zaman serbestçe yüzerek Şekil 2AA1 ve 2AA2 göstermek ve bileşik Aβ tedavi grubu fareler (Şekil 2AB1, AB2) sonuçlarında her zaman adaptif yüzme havuzu çevre etrafında yüzerek Morris su labirent. 4 gün tarama için bellek bozukluğu modeli rats, aşamalı olarak azalan kez gizli platformu (gecikme) (Şekil 2B) bulmak için tüm fareler vardı. Gün SR (Bu gecikme süresi her bileşik Aβ tedavi fare ve sıçan gizli platformu bulmak için sahte işletilen grubu dayalı) 0,2 daha olsaydı 4 Morris su eğitim, labirent, sonra birleştirilmiş Aβ tedavi sıçan bir başarılı olarak kabul edildi bellek bozukluğu olan modeli sıçan. 18 başarılı modeli tarama. 6 fareler her grubun geçirilen işlem hayatta 19 sıçan (%94.70) aşağıdaki deneyler için seçilmiştir.

Resim 2 . Bellek bozukluğu composited Aβ tedavi grubunda olan başarılı modeli fareler için eleme Morris su kullanarak labirent eğitim. (A) Adaptif yüzme yörüngesini Morris su labirentteki fareler. (AA1-AA2) Sham işletilen grubu; (AB1-AB2) Bileşik Aβ tedavi grubu. (B) ortalama gecikmesi gizli platform 4 gün üst üste tarama deneme Morris suda bulmak için eğitim sham işletilen grubu ve bileşik Aβ tedavi grubu için labirent.  Şekil başvuru 4 ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Bileşik Aβ sıçan bellek edinme ve bozuklukları yeniden öğrenme bellek nedeniyle:

Sıçan bellek edinme konumlandırma gezinti duruşma gününde 1 ve 2 gün 79 ve 80 sonrası cerrahi için denk Morris su labirent testi tarafından tespit edilmiştir. Bellek satın deneme 2 gün boyunca tüm rats gizli platformu bulmak için giderek azalan gecikme süresi sergiledi. Şekil 3' te gösterildiği gibi gizli platformu bulmak için birleştirilmiş Aβ tedavi grubu gecikmeleri ve %360.67 %558.28 edildi (F (1, 5) = 238.67, p < 0,01) o gün 1 ve 2 Morris su sham işletilen grubunun daha büyük test, sırasıyla labirent. Bu bileşik Aβ sıçanlarda bellek satın alma bozukluğu tetikleyebilir gösterir.

Sıçan bellek yeniden öğrenme deneme günde 4, 5 ve 6 gün 82, 83, 84 ve sonrası cerrahi için denk Morris su labirent testi ters tarafından denetlesinler. Şekil 3' te gösterildiği gibi gizli platformu bulmak için birleştirilmiş Aβ tedavi grubu gecikmeleri sham işletilen grubunun daha %306.20, %650.16 ve %936.92 uzun zaman olduğunu (F (1, 5) = 138.76, p < 0,01). Bu bileşik Aβ bozukluğu içinde rats (Şekil 3) yeniden öğrenme bellek yükseltebilir gösterir.

Şekil 3 . Bileşik Aβ neden fare bellek edinme ve bellek bozuklukları yeniden öğrenme. Konumlandırma gezinti deneme bellek edinme Morris su labirent testinde başarı günde 1 ve 2 yüzme 2 gün üst üste tarafından değerlendirmek için kullanıldı. Bunlar gün 79 ve 80 sonrası ameliyat yapıldı. Tersine çevirme deneme skoru 82, 83 ve 84 toplam işlem gününe denk Morris su labirent testi, 4, 5 ve 6 günü Yüzme 3 gün üst üste tarafından yeniden öğrenme bellek değerlendirmek için kullanıldı. Çizgi grafik araziler gizli platformu her grup için 1, 2, 4, 5 ve 6 gün Morris su labirent testinde bulmak için ortalama gecikmesi göster. Veriler iki yönlü ANOVA tarafından analiz (Grup x gün) ile tekrarlanan önlemleri. ± Sem n demek = 6. ^** p < 0,01, Sham çalışan grup vs. Şekil başvuru 4 ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bileşik Aβ sıçan bellek saklama bozukluğu nedeniyle:

Sıçan bellek saklama sonda deneme gün 3 gün 81 sonrası cerrahi için denk Morris su labirent testi tarafından ölçüldü. 1 gün bellek saklama deneme, bileşik Aβ tedavi grubu daha az zaman yüzme, mesafe yüzme ve 60 içinde Q1 numarası geçiş aldı %32.14, %30.11 ve %78,95 (p < 0,01), sırasıyla, bu daha denk s Grup Sham işletilen (Şekil 4A, 4B). Bu sonuçlar birleştirilmiş Aβ bellek saklama bozukluğu sıçanlarda üretebilir göster.

Şekil 4 . Bileşik Aβ üretilen sıçan bellek saklama bozukluğu. Sonda deneme 1 gün 81 mesaj ameliyat yapılmıştır Morris su labirent testi başarı günde 3 yüzme gün tarafından bellek saklama değerlendirmek için kullanıldı. (A)saat yüzme, mesafe yüzme ve Q1 sayısı 60 içinde geçiş s sonda davasının (platform). Veri birden çok aralığı test ile tek yönlü ANOVA tarafından analiz edildi. ± Sem n demek = 6. ^** p < 0,01, Sham çalışan grup vs. (B) Yüzme yörünge sonda davasının sıçan. Büyük yüzme zaman ve mesafe hedef çeyreğinde (Q1) gösterilen(a)Sham çalışan grup. Daha az yüzme zaman ve mesafe hedef çeyreğinde (Q1) gösterilen (B) bileşik Aβ tedavi grubu. Şekil başvuru 4 ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bileşik Aβ sıçan yüzme hızı etkilenir:

Hız yüzme sıçan deneme görünür platformu tarafından 7 gün 85 denk Morris su labirent testi, ameliyat sonrası gün hesaplanır. Hız, mesafe ve zaman platformunda, havuzun her grupta adım için yüzme hesaplama temel yüzme sıçan önemli ölçüde farklı değildi. Bu nedenle, hızlı yüzme fare bireysel farklılıkları, motivasyon ve motor becerileri aslında tüm rats (Şekil 5) sağlam idi gösterir dışarıda.

Şekil 5 . Bileşik Aβ sıçan yüzme hızı etkilemiştir. Hız yüzme fare gün 7 gün 85 ameliyat sonrası yapılmıştır Morris su labirent testi deneme görünür platformu tarafından hesaplanır. Her grup hızını yüzme sıçan önemli ölçüde farklı değildi. Veri birden çok aralığı test ile tek yönlü ANOVA tarafından analiz edildi. ± Sem n demek = 6. Şekil başvuru 4 ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bileşik Aβ sıçan nöronal morfolojik değişiklik nedeniyle:

Bütün fareler işten çıkarma cerrahi tarafından gün 86 öldürüldü. Görsel denetim sarı bir yüzey veya ince veya daraltılmış serebral korteks birkaç bileşik Aβ tedavi fareler ortaya bulundu. Sham çalışan grup ile (Şekil 6AA2) karşılaştırıldığında, optik mikroskobu gözlem composited Aβ tedavi Group by o lekeli, hipokampal nöron neurofibrillary dejenerasyon, neuronophagia gibi patolojik değişiklikler buldu, Nükleer pyknosis ve nükleer margination (Şekil 6AB2). Ayrıca, bileşik Aβ tedavi grubunda serebral korteks parçası kesintiye hücre zarlarında, parçalanmış çekirdeği ve nekrotik bölge (geniş inflamatuar hücre infiltrasyonu ile karakterize tipik colliquative nekrozu ortaya Şekil 6A B3). Bu bileşik Aβ sıçanlarda nöronal yapısal patolojik yaralanmalara neden olabilir gösterir.

Sham işletilen grubuyla karşılaştırıldığında nöronal yapısının patolojik değişiklikler yanı sıra nöron sayısı de önemli ölçüde hipokampus ve serebral korteks (hariç colliquative nekroz örnek) bileşik azalma Aβ tedavi grubu. %63.86 (p < 0,01) sham çalışan grup hipokampal CA1 bölümlerde 0,125 mm daha düşük ve %55.46 (p < 0,01) düşük 0.0352 mm2 bölümlerini serebral korteks nöron numaraydı (Şekil 6B), hangi öneriyor composited Aβ, neden olabilir azalan nöron sayısı.

Şekil 6 . Bileşik Aβ neden fare nöronal morfolojik değişim. (A)ile o lekeli hipokampal ve Serebral kortikal nöronların temsilcisi görüntüler. (A1-B1) Hippocampus 40 x; (A2-B2) Hippocampus CA1 400 x; (A3-B3) Serebral korteks 400 x. (A1-A3) Sham işletilen grubu; (B1-B3) Bileşik Aβ tedavi grubu; gösterir işaretlenmiş nöron kaybı, neurofibrillary dejenerasyon (→), neuronophagia (←), nükleer pyknosis (↗), bozulduğu, nükleer margination (↙), hipokampus, tipik colliquative nekroz (★), hücresel zarları, enflamatuar hücrelerinin infiltre büyük sayılar kısmen grubunun composited Aβ tedavi serebral korteks. Ölçek çubuğu A1 , B1 10 µm; = Ölçek çubuğu A2, B2, A3 , B3 = 100 µm. (B) numaraları nöronların bir ışık mikroskobunda (400 x) sayıldı hipokampus ve serebral korteks, o leke ile. Her birim ortalama ± SEM 3 bağımsız örnekleri 9 visual alanlardan temsil eder (n = 3). ^** p < 0,01, Sham çalışan grup vs.  Şekil başvuru 4 ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Elektron mikroskobu hipokampus nöron hücre altı ultrastructure görülmektedir. Bileşik Aβ tedavi grubunda (Şekil 7B1-B4) hipokampal nöronların alt yapı önemli ölçüde yok edildi, mitokondrial şişme gösterilen ve cristae kırılma, artan mitokondrial elektron yoğunluğu, kaba büyümüş endoplazmik retikulum, depolymerized polyribosomes ve polymicrotubules, bazı postsinaptik yoğunluğu (PSD), birçok ikincil organellerin ve lipofuscin tortu sitoplazma, sham çalışan grup (Şekil 7A1-A4) karşılaştırıldığında içinde. Ham ve batık nükleer membran, euchromatin konsantre ve denatüre, miyelin kılıf katmanları gevşek veya dejenerasyon ve iç akson ve lifleri zayıflatılmış.  Bu sonuçlar birleştirilmiş Aβ nöron alt yapısı hasar sıçanlarda üretebilir gösterilmektedir.

Şekil 7 . Hipokampal nöron elektron mikroskobik gözlem tarafından değerlendirilen hücre altı yapısı. A1 -A4: Sham çalışan grup. Ölçek çubuğunun A1 = 4 µm, 12, 000 x; Ölçek çubuğu a2 = 3 µm, 15, 000 x; Ölçek çubuğu A3 = 5 mikron, 10, 000 x; Ölçek çubuğu a4 = 1 µm, 35, 000 x. (B1-B4) Bileşik Aβ tedavi grubu. (B1) Nöron ve nükleer pyknosis (←), euchromatin yoğunlaşma veya dejenerasyon (#), astrocyte ayak deniz seviyesi (*), yüksek elektron yoğunluğu mitokondri (▲), miyelin kılıf katmanları gevşek veya zayıflama (→); (B2) Büyük GFAP'nin, yüksek elektron yoğunluğu mitokondri (▲), miyelin kılıf katmanları gevşek veya zayıflama (), daha fazla ikincil organellerin (↑), perisitlerden pyknosis, perisitlerden euchromatin yoğunlaşma veya dejenerasyon (☆), astrocyte ayak deniz seviyesi (*), yüksek elektron yoğunluğu mitokondri (▲), daha fazla lipofuscin (↓), miyelin kılıf katmanları gevşek veya zayıflama (→). B4: daha fazla eksitatör nörotransmitter (#), yüksek elektron yoğunluğu veya yaralanma daha az synapsis zar mitokondri (▲),. Ölçek çubuğu B1 , B2 = 10 µm, 5, 000 x; Ölçek çubuğu B3 = 5 mikron, 8, 000 x; Ölçek çubuğu B4 , = 1 µm, 40, 000 x. Şekil başvuru 4 ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bileşik Aβ sıçan nöronlarda Aβ yük nedeniyle:

Kongo kırmızısı boyama nöronlar Aβ yükünü tespit etmek için kullanıldı. Sonuçlar birleştirilmiş Aβ özellikle farenin hipokampus ve serebral korteks (Şekil 8A) hücre içi Aβ yükü neden olabilir gösterir. Kongo kırmızısı hipokampus ve serebral korteks composited Aβ tedavi grubu tarafından lekeli pozitif sayı Aβ kırmızı içeren hücrelerin 8,05 - ve 4.09 - kat (p < 0,01) bu sahte ile çalışan grup (Şekil 8B) daha büyük olan. Bu bileşik Aβ nöron Aβ yük sıçanlarda artırabilir göstermektedir.

Şekil 8 . Bileşik Aβ neden Aβ yük köstebeğiyle nöronlar. (A)temsilcisi görüntülerini olumlu Aβ nöron hipokampüs Kongo kırmızı lekeli ve Serebral kortikal. (A1-B1) Hippocampus CA1 400 x; (A2-B2) Serebral korteks 400 x. (A1-A2) Sham işletilen grubu; (B1-B2) Bileşik Aβ tedavi grubu, daha fazla Aβ hücreleri tarafından Kongo kırmızısı lekeli pozitif gösterilir. Ölçek çubuğu = 10 µm, 400 x. (B) pozitif sayılar Aβ nöronların Kongo kırmızı bir ışık mikroskobunda (400 x) sayıldı hipokampus ve serebral korteks, lekeli. Her birim ortalama ± SEM 3 bağımsız örnekleri 9 visual alanlardan temsil eder (n = 3). ^** p < 0,01, Sham çalışan grup vs. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bileşik Aβ NFT ifade sıçan nöronlarda nedeni:

Gümüş nitrat boyama NFT ifade nöronlarda algılamak için kullanıldı. Sonuçlar birleştirilmiş Aβ belirgin hücre içi NFT ifade içinde Sıçan hipokampus ve serebral korteks (Şekil 9A) neden olabileceğini gösterir. Gümüş nitrat hipokampus ve serebral korteks composited Aβ tedavi grubu tarafından lekeli olumlu NFT kahverengi hücrelerle 9,75 - ve 4.82 - kat (p < 0,01) bu sahte işletilen grubu (Şekil 9B daha büyük vardır ). Bu bileşik Aβ nöron NFT toplama sıçanlarda artırabilir göstermektedir.

Şekil 9 . Bileşik Aβ neden NFT toplama köstebeğiyle nöronlar. Gümüş nitrat hipokampus ve beyin korteksi tarafından lekeli olumlu NFT nöronların(a)temsilcisi görüntüler. (A1-B1) Hippocampus CA1 400 x; (A2-B2) Serebral korteks 400 x. (A1-A2) Sham işletilen grubu; (B1-B2) Bileşik Aβ tedavi grubu. daha fazla NFT tarafından gümüş nitrat composited tedavi grubunda hücre lekeli olumlu gösterilen. Ölçek çubuğu = 10 µm, 400 x. (B) pozitif NFT nöronlar tarafından sayıda lekeli gümüş nitrat hipokampus ve serebral korteks, bir ışık mikroskobunda (400 x) sayıldı. Her birim ortalama ± SEM 3 bağımsız örnekleri 9 visual alanlardan temsil eder (n = 3). ^** p < 0,01, Sham çalışan grup vs. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

İyi öğrenme ve hafıza kaybı reklam hastaların²' deki başlıca klinik belirtileri vardır bilinmektedir. Burada açıklanan yordamı reklam çalışmaya vivo içinde bir yöntemdir; bellek açıkları ve nöronal yaralanma bir fare modeli⁴hafifletmek için bir ilaç test daha önce yayımlanmış bir protokol adapte olması. Bizim iletişim kuralı başarıyla işlemi, bellek açıklar, nöron yaralanmaları, Aβ yük ve NFT biriktirme, reklam (mevcut denemede, hayatta kalma oranı taklit etmek için model hayvanların yüksek sağkalım oranı yanı sıra değerli veri elde etmek için önemli ayrıntılar sağlar ve işlem başarılı modeli oranı fazla % 90). Bu başarılı modeli fareleri kayma onların bellek Morris su labirent testi ile ölçmek için kullanılmıştır. Konumlandırma gezinti deneme composited Aβ sıçan bellek satın alma bozukluğu neden olabilir bulundu; sonda deneme composited Aβ sıçan bellek saklama düşürebilir bulundu; ve deneme ters composited Aβ öğrenme bozukluğu yeniden köstebeğiyle yol açabilir bulundu. Bu Morris su labirent test verileri birleştirilmiş Aβ fare kayma bellek tetikleyebilir göster. Genel olarak, fareler intracerebroventricularly AlCl₃ ve TGF-β1 ile birlikte Aβ25-35 ile enjekte mümkün ve güvenilir vivo içinde reklam gibi hayvan modeli laboratuvar için oluşturulan.

Önceki çalışmalar reklam hastalarda beyin birimin sağlıklı bireylerin daha az % 10 olduğunu göstermiştir. Çeşitli atrophies serebral hemisfer görsel gözlem tarafından bulunabilir. Kortikal atrofi derecesi olumlu için bellek bozukluğu¹⁹ilgilidir. Histoloji, çok sayıda nöron kaybı ve şiddetli morfolojik patoloji doğrudan AD hastaların²⁰bellek işlevinde rahatsız. Bu da çalışmanın, ışık/elektron mikroskobik gözlem ile birleştirilmiş Aβ microinjected fareler nöron kaybı ve nöronal ve hücre altı yapısı bozulma dahil dramatik neuropathological değişiklikleri, görüntülenen buldum. Bu sonuç composited Aβ tarafından indüklenen fare kayma bellek bozukluğu doğruluyor ve reklam hastaların durumuna benzer.

İyi beyin Aβ yük ve NFT toplama en önemli histopathogenic özellikleri reklam kabul edilir bilinmektedir. Onlar nöronal yapısı yok, sinirsel sinyal rahatsız, nöronal işlevini bozabilir ve gelişmiş demans¹⁷' neden. Mevcut hayvan modeli AD hastanın durumuyla katılıyorum beyin Aβ yük ve NFT toplama bulundu. Bu nedenle, mevcut nöron yaralanmaları composited Aβ tarafından indüklenen sıçanlarda bir model olarak nöronal patoloji ve reklam tedavi stratejisi eğitim için kullanılabilir.

Uyuşturucu etkileri AD fare modellerinde eleme örnekleri şunlardır: her iki flavonoidler Scutellaria dan kaynaklanıyor ve (SSF) yaprakları ve Scutellaria barbata (SBF) azaltmak fare bellek bozukluğu ve tarafından indüklenen apoptosis bildirdi Zhao vd., bileşik Aβ^8,9. Guo vd., Ayrıca rapor SBF NFT toplama ve Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 ve Thr231 yanında tau protein aşırı fosforilasyon inhibe ve GSK-3β, CDK5 ve PKA protein ve mRNA ifade sıçanlarda composited Aβ tedavi^{21 azaltmak} . Aynı anda, Shang vd., ayrıca SBF bastırmak nükleer silahların yayılmasına karşı astrocyte ve microglia ve alt Aβ1-40, Aβ1-42 ve β-site APP fizyon enzim 1 (BACE1) beyindeki mRNA ifadesidir composited Aβ²²sıçanlar bildirdin. Yukarıdaki sonuçlarına göre bizim hayvan modeli daha fazla nöronal işlevi ve yapısı bozukluğu dahil diğer AD benzeri modeli üzerinde avantajlıdır.

Diğer AD benzeri modeli ile ilgili Aβ tek intracerebroventricular enjeksiyon fareler için fare bellek açıkları, nöron kaybı ve neurogliocyte yaygın, neden olabilir ama olabilir veya Aβ ve NFT ifade²³olmayabilir. Yüksek doz Al maruz fareler yüksek başarı oranı, taklit reklam ve bellek bozukluğu, nöron kaybı, neurogliocyte yayılması ve senil plak (SP) ve NFT toplama ile düşük maliyetli bir hayvan modeli beyinde gibi görünüyor. Ancak, Al yüksek doz sıçan karaciğer yaralanmalara neden ve anoreksiya ile eşlik, ağırlık²⁴düşmüştür. Yaşlı fare başka bir reklam gibi modelidir. Yaşlı fareler göstermek bellek açıkları, nöronal yapısı/alt yapı patolojik değişiklikler, lipofuscin birikimi, ama Aβ yük ve NFT toplama olmadan. Fareler 24 aydan daha yaş yaşlı bu model için kabul edilir ve bu nedenle beslenme daha uzun bir süre gerektirir ve böylece maliyeti daha yüksek^17,25. SAMP8 ve APP transgenik fareler reklam için en yakın taklit ve reklam soruşturma için en ideal modelleri vardır. Ama hayvan her iki modelde daha yüksek fiyatlandırılır ve laboratuvar^26,27' kullanmak için sınırlıdır. Yukarıdaki hayvan modelleri ile karşılaştırıldığında, bizim model Aβ tedavi composited hayvan modeli daha düşük maliyet ve yüksek performans, reklam çalışmak için ideal bir araç yapma vardır.

Sonuç olarak, Aβ25-35 intracerebroventricular enjeksiyon AlCl₃ ile kombine ve TGF-β1 fareler için mekansal hafıza bozukluğu, nöronal yaralanma, Aβ yük ve NFT ifade daha iyi anlamak için bir değerli in vivo hayvan modeli sunar temel AD. Bu model bir hızlı sağlar ve yüksek bir hayvanla birlikte nispeten basit Deneysel protokol hayatta oranı ve yüksek model işlemi başarılı oranı yanı sıra daha ekonomik olmak gösterdi çoğaltılması, yüksek orandaki. Mevcut hayvan modeli AD taklit etmek için etkili bir model ve daha fazla kendini çeşitli diğer hastalıkları taklit eskiden tarafından doğrulayabilirsiniz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rat	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China	SCXK(Jing) 2012-0001	300–350 g
Morris water maze	Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China	No
Movable small animal anesthesi	RWD Life Science Co., Ltd. China	R580
Brain Stereotaxic Apparatus	RWD Life Science Co., Ltd. China	68001
Flexible bone drill	Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China	BW-sD908
Transmission electron microscope	Japan Co., Ltd. Japan	JEM-1400
Two channel microinjection pump	RWD Life Science Co., Ltd. China	RWD202
EM microtome	Hitachi Co., Ltd. China	H-7650
Dummy cannula	RWD Life Science Co., Ltd. China	62001	0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html
Guide cannula	RWD Life Science Co., Ltd. China	62101	0.D.0.40mm/M3.5
Internal cannula	RWD Life Science Co., Ltd. China	62201	0.D.0.41×I.D.0.25mm/M3.5
Tighten the nut	RWD Life Science Co., Ltd. China	62501	0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5
Fixing screw	RWD Life Science Co., Ltd. China	62514	M1.2×L2.0mm(100BAO)
The screwdriver	RWD Life Science Co., Ltd. China	62999	45*1mm
PE Tubing	RWD Life Science Co., Ltd. China	62302
Amyloid beta 25-35	Sigma Aldrich Co. USA	SCP0002-5MG
Recombinant human transforming growth factor-β1	PeproTech Inc. USA	100-21
Aluminium trichloride	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China	3011080
Congo red	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China	3010016
Silver nitrate	Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China	20150720
Zinc phosphate dental cement	Dental Material of Factory Shanghai Medical Instruments Co., Ltd. China	201311