Mise en place d’un imitateur précieux de la maladie d’Alzheimer dans le modèle Animal Rat par Injection intracérébroventriculaire de protéine bêta-amyloïde composite

Résumé

Il s’agit d’un protocole pour imiter la maladie d’Alzheimer chez des rats par l’évaluation des troubles de la mémoire spatiale, des changements pathologiques neuronales, fardeau de protéine (Aβ) bêta-amyloïde neuronale et l’agrégation enchevêtrements neurofibrillaires, induite par l’injection d’AB25-35 combiné Trichlorure d’aluminium et recombinantes humaines transformant le facteur de croissance-β1.

Résumé

La maladie d’Alzheimer (ma) est une maladie cérébrale irréversible progressive qui détruit la mémoire lentement et qui s’accompagne de changements de structure et de la perte de neurone. Avec l’augmentation d’Alzheimer dans le monde entier, la pathologie et le traitement de la maladie est devenue un foyer dans l’industrie pharmaceutique internationale. Ainsi, la mise en place du modèle animal pour imiter les AD en laboratoire est de grande importance.

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’établissement d’un imitateur de la ma chez un animal rat modèle cependant une injection intracérébroventriculaire d’amyloïde bêta protéine 25-35 (AB25-35) combiné avec le trichlorure d’aluminium (AlCl₃) et le noyau thalamique antérodorsale injection d’humain recombinant, transformant le facteur de croissance-β1 (RHTGF-β1) à des rats. Les marqueurs liés de l’AD ont été mesurés, y compris : la mémoire spatiale, structure neuronale et sous-structure, Aβ neuronale et la production d’enchevêtrements neurofibrillaires (NFT). Ce modèle de rat démontre des troubles de la mémoire spatiale, la structure neuronale et des changements pathologiques de sous-structure, fardeau Aβ intracellulaire de neurone et agrégation NFT et fournit un imitateur étroit du désordre structure et la fonction neuronal à celle de la clinique Patients atteints de ma. Ainsi, le présenté AD rat modelprovides un outil précieux en vivo pour explorer la fonction neuronale, pathologie neuronale et dépistage des drogues d’AD.

Introduction

Il est bien connu que l’AD est une maladie neurodégénérative chronique et progressive, avec perte de mémoire progressive comme le syndrome clinique principal. Il y a dans la pathologie générale, atrophie des tissus du système nerveux, neurones et perte de synapse, ainsi que subcellulaire structure et la fonction troubles neuronaux, qui sont tous impliqués dans le développement et la manifestation clinique de AD^1,2. Il est signalé que, lorsque les animaux était intracerebroventricularly injecté avec bêta-amyloïdes, certains événements neurotoxiques se produisent dans le cerveau impliquant la perte de neurone, perturbation de l’homéostasie du calcium, l’apoptose neuronale et de surproduction espèces réactives de l’oxygène³. Toutefois, plusieurs facteurs sont impliqués dans la pathogenèse de la ma, et il est donc essentiel d’établir un meilleur modèle d’annonce.

Un protocole détaillé est décrit ici pour établir une en vivo mimique AD modèle grâce à une injection intracérébroventriculaire AB25-35 et AlCl₃, combiné avec l’injection de noyau thalamique antérodorsale RHTGF-β1 aux rats. Cette modelhighly de rat imite la fonction neuronale humaine et histopathogenesis de la ma, y compris les troubles de la mémoire, la perte de neurone et dommage de structure, apoptose, fardeau d’Aβ intracellulaire et NFT agrégation^{4,5,6 , 7 , 8 , 9}. l’AlCl₃ empêche l’Aβ déposé formant Aβ soluble, et le RHTGF-β1 peut promouvoir la production d’Aß déposée et faciliter AD occurrence¹⁰. Cette attaque de plusieurs facteurs, le neurone est conformément à la pathogenèse multiples de AD.

L’expérience entière s’étend sur 82 jours : la Figure 1 présente une chronologie de la conception expérimentale, avec le point de temps de chirurgie animale, modèle animal dépistage, test de la mémoire spatiale animaux et préparation des échantillons. Le premier jour de l’opération, RHTGF-β1 a micro dans le noyau thalamique antérodorsale. Le deuxième jour d’opération, AB25-35 et AlCl₃ ont été microinjected dans le ventricule latéral quotidiennement pour 14 jours consécutifs, le matin et 5 jours consécutifs dans l’après-midi, respectivement. Tous les rats ont été autorisés à récupérer pendant 45 jours après l’opération. Le labyrinthe de l’eau de Morris a été utilisé pour dépister les rats modèle réussi avec troubles de la mémoire et pour évaluer la mémoire spatiale des rats. Les rats ont subi 4 jours consécutifs de labyrinthe aquatique de formation avec 2 essais par jour et le jour 4 de la formation, les rats ont été évalués avec la performance de labyrinthe d’eau Morris pour troubles de la mémoire. Tous les rats ont continué d’être nourri de 37 jours après la projection de modèle animal. La mémoire spatiale des rats a été testée dans le labyrinthe de l’eau de Morris à plus de 7 jours consécutifs, du 79 au jour 85 après l’opération. Tous les rats ont été sacrifiés par décapitation jour 86 pour la préparation d’échantillons de cerveau.

La figure 1. Chronologie de la conception expérimentale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocole

Cette procédure était conforme à la réglementation d’Administration de Animal expérimental émis par le Comité d’état de la Science et technologie de la Chine le 31 octobre 1988¹¹. Les scientifiques suivent les directives établies et approuvées par leurs organismes de réglementation animales institutionnels et nationales.

NOTE : Animal et régents : quatre mois mâles Sprague-Dawley (300-350 g) ont été fournis pour cette expérience. Tous les rats étaient logés en groupes (quatre ou cinq par cage) à une température de 23 ± 1 ° C, avec un cycle lumière-obscurité de 12 h. Nourriture et l’eau étaient disponibles ad libitum. Les rats ont été acclimatés à des conditions de logement pendant 7 jours avant que la procédure a été effectuée. AB25-35 a été dissous dans une solution saline de DMSO de 1 % à 1 mg/mL et sonication pendant 5 min dans un oscillateur ultrasonique jusqu'à dissolution complète. AlCl₃ et RHTGF-β1 ont été dissous dans une solution saline à 1 % et 0,1 mg/mL, respectivement. Rouge Congo, nitrate d’argent et autres produits chimiques étaient purs et ont été achetées sur le marché ordinaire.

1. intervention chirurgicale

Remarque : 20 mâles Sprague-Dawley ont été micro avec Aβ composite dans le ventricule latéral et le noyau thalamique antérodorsale et désigné comme le groupe composite imprégnées par l’Aß. Un autre 20 rats ont été soumis à la même opération mais reçu saline microinjection de 0,1 % DMSO et désigné comme le groupe opérés.

1. Anesthésier les rats avec l’isoflurane 100 % par inhalation et ensuite freiner sur un appareil stéréotaxique du cerveau.
2. Raser la fourrure sur le sommet de la tête avec des ciseaux chirurgicaux et désinfecter avec iodophore. Ensuite, la couverture chirurgicale serviette jetable sur la tête.
3. Faites une incision sur la peau de tête le long de la calvaria longitudinal médian avec ciseaux et Bistouris chirurgicaux.
4. Séparer le tissu sous-cutané et le fascia, essuyer la voûte crânienne du crâne avec un coton sec stérile pour arrêter le saignement et marquez le bregma avec un marqueur.
5. Se référer au Rat Brain stéréotaxiques carte¹²; Si l'on considère le bregma comme point d’origine, marquer les trois points, le noyau thalamique antérodorsale (ad) (postérieur (P) : 2,0 mm pour le bregma ; latérale (L) : 1,4 mm à la ligne médiane) d’injection RHTGF-β1 et fixant une vis, la (zone de ventricule latéral (LV) postérieur (P) : 0,8 mm pour le bregma ; latérale (L) : 2. 0 mm à la ligne médiane) pour injecter AB25-35 et AlCl3 et la deuxième vis de fixation de lieu (Front (F) : 2,0 mm pour le bregma ; latérale (L) : 1,5 mm à la ligne médiane).
6. Doucement percer trois trous de 1 mm de diamètre avec une perceuse bone flexible, désignée aux trois points ci-dessus du crâne (1.5. étape). Ne pas visser à fond plus profond que nécessaire pour éviter les coups de couteau le tissu cérébral.
7. Arrêter le saignement et nettoyer la surface du crâne à plusieurs reprises avec du coton sec stérile.
8. Insérer une aiguille reliée à la pompe de la micro-injection, au cerveau à 4,6 mm de profondeur et doucement injecter 1 μL RHTGF-β1 (10 ng) dans le domaine de la publicité. Souhaitez-vous l’aiguille 2 min après l’injection et tirer lentement l’aiguille (supplémentaire 1 fichier).
9. Fixer les deux vis dans le crâne, désigné dans les points de l’annonce et la deuxième vis fixant le lieu du crâne (qui ont été désignées en 1.5. étape) avec un petit tournevis. Ne pas visser à fond plus profond que nécessaire pour éviter les coups de couteau le tissu cérébral.
10. Assemblage du système d’implantation de canule (2 fichier supplémentaire), insérer la canule factice dans la canule guide après désinfection par haute pression.
11. Insérer la canule guide de tubes en acier inoxydable au cerveau à 4,6 mm zone de LV dans le trou du crâne (Supplemental fichier 3), avec l’aide du titulaire de la canule d’appareil stéréotaxique rats'.
12. Mélanger le matériau de base de prothèse dentaire avec prothèse base eau au ratio de 1,5 g / mL 1, mettre la pâte pour couvrir le piédestal en plastique de canule guide et deux vis pour immobiliser la canule guide et jusqu'à la couverture de l’incision de la peau entière afin d’éviter l’infection de la peau.
13. Jour 2 de l’opération, anesthésier les rats avec l’isoflurane inhalation à l’aide de la petite Machine d’anesthésie Animal. Retirer la canule factice, insérer la canule interne dans la canule guide et visser la vis de fixation pour immobiliser la canule interne.
14. Mettre le tuyau de polyéthylène qui relie la pompe microinjection à la canule interne et régler la vitesse d’injection et 1 μL/min Microinject l’AB25-35 ou AlCl3 pour le LV.
15. Microinject 4 μg (1 μL) AB25-35 par jour pendant 14 jours le matin et 3 μL AlCl₃ (1 %) par jour pendant 5 jours dans l’après-midi sous anesthésie isoflurane.
16. Attendre 5 min après l’injection, délicatement retirer la canule interne et insérer la canule factice à nouveau dans la canule guide.
17. Sur la chirurgie post 15 jours (ce qui correspond au dernier jour d’injection d’AB25-35), démonter le système d’implantation de canule. Retirez doucement le solide matière base de prothèse dentaire avec ciseaux chirurgicaux et forceps, dévisser les deux vis, retirer la canule guide et désinfecter la plaie avec betadine. Remplir le trou du crâne avec ciment osseux et suture de la peau avec une méthode simple suture interrompu.
18. Effectuer la même opération avec le groupe opérés et microinject salin de DMSO de 0,1 %.
19. Soins infirmiers postopératoires
    1. Maison 2 rats par cage après opération et fournir de la nourriture pendant 30 jours.
       Remarque : 18 rats du groupe opérés ont survécu (90 % taux de réussite de l’opération) et 19 rats dans le composite Aβ groupe traité ont survécu (taux de réussite de 95 % de l’opération).

2. dépistage des Rats modèle réussi et l’évaluation de la mémoire spatiale avec Morris Water Maze

1. Labyrinthe aquatique de Morris
   Remarque : Le labyrinthe de l’eau de Morris a servi à évaluer les rat mémoire spatiale¹³. Le labyrinthe de l’eau de Morris est un réservoir circulaire en acier inoxydable avec 120 cm de diamètre et 50 cm de profondeur. Le test de labyrinthe de l’eau a été réalisé, basée sur le paradigme de « règles d’or » décrit en neurosciences comportementales par J. Nunez¹⁴.
   1. Noircir l’eau de la piscine avec quelques gouttes de colorant alimentaire.
   2. Maintenir la profondeur de l’eau à 31,5 cm et la température à 23 ± 1 ° C.
   3. Définir une plate-forme circulaire plexiglass transparent de 1,5 cm sous la surface de l’eau.
   4. Soutiennent que tous les signaux spatiales dans le labyrinthe de l’eau sont invariables pendant les essais de labyrinthe de l’eau.
   5. Diviser la piscine en 4 quadrants égales par des lignes imaginaires pour la collecte de données descriptives.
   6. Placez la plateforme cachée dans le premier quadrant (Q1) du labyrinthe aquatique.
   7. Capturer le rat nage des comportements (mesurées en latence, trajectoire ou passage) grâce à une caméra vidéo, sur le labyrinthe de l’eau lié à un logiciel analyse graphique sur ordinateur.
2. Dépistage des rats modèle réussi au groupe imprégnées d’Aβ composite
   1. Jour 45 de chirurgie, effectuer le labyrinthe de l’eau de Morris formation pendant 4 jours consécutifs dépister les rats modèle réussi avec troubles de la mémoire et de collecter le ratio de projection (SR).
      Note : Le SR est défini comme la latence moyenne de chaque rat imprégnées d’Aβ composite et le groupe opérés de rats pour trouver la plate-forme cachée sous l’eau de surface sur J4 d’eau formation de labyrinthe. « A » est la latence moyenne de chaque rat imprégnées d’Aβ composite pour trouver la plate-forme cachée et « B » est la latence moyenne du groupe opérés des rats pour trouver la plate-forme cachée, jour 4 de labyrinthe aquatique de formation, dans l’équation suivante :
      
      Quand SR était supérieur à 0,2 pour un composite imprégnées d’Aβ rat, le rat était considéré comme un rat de modèle réussi avec troubles de la mémoire de composite imprégnées d’Aβ rat¹⁵. Les performances de la mémoire intraday a été calculée pour les données de 2 essais par la valeur moyenne des rats pour trouver la plate-forme cachée. Le processus de l’épreuve de labyrinthe de l’eau de Morris a été conçu de sorte que les rats étaient autorisés à nager dans le réservoir de labyrinthe d’eau et de la recherche pour la plate-forme cachée dans les 60 s. Si un rat n’a pas trouvé la plate-forme cachée dans les 60 s, puis le rat a été mis sur la plate-forme avec la main de l’expérimentateur. Quand un rat atteint sur la plate-forme cachée (indépendamment ou assistée), le rat a été loué y rester pendant 20 s. Ensuite, le rat a été retiré de la cuve et permet une récupération physique pour 10 s entre les 2 épreuves.

3. examen de neurone

1. Sur la chirurgie post jour 86, sous anesthésie isoflurane, euthanasier les rats par décapitation (Figure 1).
2. Mettre le cerveau sur la glace et séparer délicatement les deux hémisphères dans le raphé. Prenez l’hémisphère gauche du chiasma optique et le fixer à 4 % de formaldéhyde pour l’observation de la lumière microcopy de l’hématoxyline neurone et éosine (HE), rouge Congo ou de nitrate d’argent stain (voir Sections 4-6). Difficulté de la zone de hippocampe CA1 hémisphère droit au glutaraldéhyde à 2,5 % pour l’observation de microcopy électronique (Section 7).
3. Traiter le cerveau pour la préparation des échantillons microcopy lumière/electron, comme précédemment décrit^16,17.

4. neurone HE coloration

1. Déparaffiner chaque diapositive (20 min chacun) avec gradient alcool (100 %, 95 %, 90 %, 80 % et 70 %) à l’eau distillée dans une hotte aspirante.
2. Détachant pendant 3 min avec l’hématoxyline (0,5 % p/v) et puis les rincer à l’eau du robinet pour enlever la teinture indépendante de diapositives.
3. Rincer avec de l’acide chlorhydrique 0,1 % dans l’alcool pour 1 s pour enlever la couleur des noyaux non colorés.
4. Plonger dans la solution d’ammoniaque de 0,5 % pendant 2 min jusqu'à ce que le bleu clair de tours de fond.
5. Détachant pendant 1 min avec 1 % éosine.
6. Déshydrater pendant 5 min avec dégradé (alcool 70 %, 80 %, 90 %, 95 % et 100 %).
7. Claire dans le xylène et monter avec milieu de montage résineuse.
8. Observer et compter les neurones vivants de la tache d’HE par 0,125 mm dans le milieu CA1 de l’hippocampe et par 0,0352 mm² dans le cortex cérébral à un grossissement de x 400 avec un microscope optique par une personne aveuglé à la conception expérimentale.

5. Congo une coloration rouge pour doser le neurone Aβ fardeau

1. Déparaffiner chaque diapositive (20 min) avec gradient alcool (100 %, 95 %, 90 %, 80 % et 70 %) à l’eau distillée dans une hotte aspirante.
2. Détachant pendant 20 min avec le rouge Congo solution (rouge Congo 0,5 g, alcool méthylique 80 mL, 20 mL glycerinum) de travail.
3. Rincer à l’eau distillée pendant 5 min.
4. Différencier rapidement avec une solution alcaline de 80 % d’alcool (hydroxyde de potassium 0,2 g d’alcool/100 mL) pour 3 s.
5. Rincer deux fois, pendant 5 min avec de l’eau distillée.
6. Contre-coloration à l’hématoxyline Gill pendant 3 min.
7. Rincer à l’eau du robinet pendant 2 min.
8. Tremper dans de l’eau ammoniaque (ajouter quelques gouttes d’hydroxyde d’ammonium pour l’eau du robinet et bien mélanger) pendant 30 s ou jusqu'à ce que les sections vire au bleues.
9. Rincer à l’eau du robinet pendant 5 min.
10. Déshydrater avec dégradé (alcool 70 %, 80 %, 90 %, 95 % et 100 %).
11. Claire dans le xylène et monter avec milieu de montage résineuse.
12. Observer et compter les cellules colorées au rouge Congo à un grossissement de x 400, avec un microscope optique par une personne aveuglé à la conception expérimentale.

6. Nitrate d’argent souillant pour doser le neurone NFT Formation

1. Déparaffiner chaque diapositive (20 min) avec gradient alcool (100 %, 95 %, 90 %, 80 % et 70 %) à l’eau distillée dans une hotte aspirante.
2. Plonger dans la solution de nitrate d’argent de 20 % et de capsulage agent pendant 20 min dans le noir.
3. Laver à l’eau distillée deux fois, 5 min à chaque fois.
4. Plonger dans la solution d’ammoniaque argent. Déposez l’ammoniac en solution dans 20 % solution de nitrate d’argent et ajouter jusqu'à ce que la solution va de turbidité de clarification. Simultanément, agiter la solution avec un agitateur en verre pendant 15 min et puis mis dans l’hydroxyde d’ammonium 1 % dilué pendant 2 min.
5. Placez la lame dans la solution de travail en développement pour les 3-7 min jusqu'à ce que le bloc noir dans l’axone peut être observé.
6. Plonger dans la solution d’ammoniaque de 0,1 % dilué pendant 1 min, puis rincer avec de l’eau pendant 1 min.
7. Disposer avec thiosulfate de sodium 5 % pendant 2 min et puis rincez à l’eau pendant 5 min.
8. Déshydrater avec dégradé (alcool 70 %, 80 %, 90 %, 95 % et 100 %).
9. Claire dans le xylène et monter avec milieu de montage résineuse.
10. Observer et de consigner la cellule pour les taches de nitrate d’argent à un grossissement de x 400 avec un microscope optique par une personne aveuglé à la conception expérimentale.

7. hippocampe neurone Ultrastructure mesure

1. Couper l’hippocampe du rat CA1 en plusieurs cubes (1 x 1 x 1 mm³) et les déposer au glutaraldéhyde à 2,5 % pendant 2 h à 4 ° C.
2. Rincer les cubes avec du PBS trois fois (pH 7,2, 10 min à chaque fois).
3. Difficulté les cubes en acide osmique à 1 % pendant 2 h à 4 ° C.
4. Rincer les cubes dans l’eau bidistillée 3 x (10 min à chaque fois).
5. Déshydrater avec gradient alcool 50 %, 70 % et 90 % (10 min pour chacun), 100 % deux fois (15 min à chaque fois).
6. Remplacer par l’oxyde de propylène deux fois (15 min à chaque fois), propylène oxyde : résine au 1:1 (60 min à chaque fois à température ambiante) et l’oxyde de propylène : résine 1:4 (60 min à chaque fois à température ambiante). Faire tremper dans de la résine (120 minutes, à température ambiante).
7. Incorporer l’EPON 812 et polymériser (5 h/35 ° C, 60 ° C/5 h, 5 h/80 ° C).
8. Les coupes semi-fines (1 µm), tache de bleu de méthylène et localiser sous le microscope.
9. Tacher les sections ultra-minces (50 nm) avec du citrate-o-acétate d’uranyle et de plomb.
10. Examiner sous un microscope électronique à JEM-1400 et de recueillir des images.

Résultats

Toutes les données sont présentées comme moyenne ± SEM. SAS/STAT package a été utilisé pour calculer l’analyse statistique. Les différences de groupe de latence pour trouver la plate-forme cachée dans l’acquisition de la mémoire et test de ré-apprentissage de mémoire ont été analysés par deux voies d’analyse de variance (ANOVA) avec mesures répétées. Les différences de groupe dans le procès de la sonde et le nombre de neurones ont été analysés par ANOVA à suivie d’essai gamme multiple de Duncan. p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative¹⁸.

Screening for Rats modèle réussi avec troubles de la mémoire pour le groupe composite imprégnées d’Aβ :

Les résultats dans la Figure 2AA1 et 2AA2 spectacle que le groupe opérés des rats toujours nagé librement et les rats du groupe Aβ composite (Figure 2AB1, AB2) toujours nagé autour du périmètre de la piscine de natation d’adaptation dans la Labyrinthe aquatique de Morris. Au cours des 4 jours de dépistage pour les rats de modèle mémoire atteinte, tous les rats avaient baisse progressivement reprises pour trouver la plate-forme cachée (latence) (Figure 2B). Jour 4 de l’eau de Morris labyrinthe formation, si le SR a été plus de 0,2 (qui reposait sur la latence de chaque rat imprégnées d’Aβ composite et le groupe opérés des rats pour trouver la plate-forme cachée), puis le rat imprégnées d’Aβ composite était considéré comme un succès rat de modèle avec troubles de la mémoire. 18 des 19 rats (94,70 %) qui ont survécu à l’exploitation passée du modèle réussi dépistage. 6 rats de chaque groupe ont été choisis pour les expériences suivantes.

Figure 2 . Dépistage des rats modèle réussi avec troubles de la mémoire dans le groupe composite imprégnées d’Aβ à l’aide de l’eau de Morris labyrinthe formation. (A) la natation d’adaptation trajectoire des rats dans le labyrinthe de l’eau de Morris. (–De l'AA1AA2) Groupe opérés ; (–DuAB1,AB2) Composite groupe traité Aβ. Latence moyenne (B) pour trouver la plate-forme cachée pendant 4 jours consécutifs de l’essai de dépistage dans l’eau de Morris labyrinthe en formation pour le groupe opérés et le groupe composite imprégnées par l’Aß.  La figure a été modifiée par référence 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Composite Aβ causé Rat Acquisition de mémoire et mémoire réapprentissage de déficiences :

L’acquisition de mémoire de rat a été déterminée par l’essai de navigation positionnement jour 1 et 2 de l’épreuve de labyrinthe d’eau Morris, qui correspondait au post chirurgie d’un jour 79 et 80. Pendant les 2 jours de l’acquisition de la mémoire du procès, tous les rats présentaient latence baisse progressivement pour trouver la plate-forme cachée. Comme illustré à la Figure 3, les latences du groupe imprégnées d’Aβ composite pour trouver la plate-forme cachée ont été de 360.67 % et 558.28 % (F (1, 5) = 238.67, p < 0,01) supérieures à celles du groupe opérés le jour 1 et 2 de l’eau de Morris labyrinthe de test, respectivement. Cela indique que l’Aβ composite peut induire mnésique acquisition chez le rat.

La mémoire de rat ré-apprentissage a été mesurée par la reprise du procès le jour 4, 5 et 6 de l’épreuve de labyrinthe d’eau Morris, qui correspondait au post chirurgie d’un jour 82, 83 et 84. Comme illustré à la Figure 3, les latences du groupe imprégnées d’Aβ composite pour trouver la plate-forme cachée ont été 306,20 %, 650.16 % et 936.92 % plus longtemps que ceux du groupe opérés (F (1, 5) = 138,76, p < 0,01). Cela démontre que l’Aβ composite peut élever la mémoire réapprentissage déficience chez les rats (Figure 3).

Figure 3 . Composite Aβ causé acquisition de mémoire de rat et de la mémoire, ré-apprentissage des déficiences. Le procès de navigation positionnement a permis d’évaluer l’acquisition de la mémoire de 2 jours consécutifs natation réalisation le jour 1 et 2 dans le test de labyrinthe de l’eau de Morris. Ceux-ci ont été réalisés sur post chirurgie d’un jour 79 et 80. La reprise du procès a permis d’évaluer la mémoire ré-apprentissage de 3 jours consécutifs, natation score le jour 4, 5 et 6 dans le test de labyrinthe de l’eau Morris, qui correspondait au jour 82, 83 et 84 de l’opération. Les parcelles de graphique ligne montrent la latence moyenne de trouver la plate-forme cachée pour chaque groupe le jour 1, 2, 4, 5 et 6 dans le test du labyrinthe eau Morris. Données ont été analysées par ANOVA bidirectionnelle (jour x groupe) avec des mesures répétées. Moyenne ± SEM. n = 6. ^** p < 0,01, vs groupe opérés. La figure a été modifiée par référence 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Composite Aβ causé Rat rétention mnésique :

La rétention de mémoire de rat a été mesurée en procès de la sonde au jour 3 de l’épreuve de labyrinthe d’eau Morris, qui correspondait au post chirurgie d’un jour 81. Dans la rétention de mémoire 1 jour du procès, le groupe composite imprégnées d’Aβ a pris moins temps de natation, natation de distance et franchissement numéro au 1er trimestre dans les 60 s, ce qui correspondait à 32.14 %, 30,11 % et 78,95 % (p < 0,01), respectivement, que ceux de la Groupe opérés (Figure 4A, 4 b). Ces résultats montrent que l’Aβ composite peut produire des troubles rétention de la mémoire chez les rats.

Figure 4 . Aβ composite produit rat rétention mnésique. Le procès de la sonde a été utilisé pour évaluer la rétention de la mémoire en 1 jour réalisation le jour 3 de natation dans l’épreuve de labyrinthe d’eau Morris, qui a été menée sur post chirurgie d’un jour 81. (A) temps de natation, natation de distance et un passage numéro au 1er trimestre dans les 60 s dans le procès de la sonde (pas de plate-forme). Données ont été analysées par ANOVA à avec l’essai de la gamme multiple. Moyenne ± SEM. n = 6. ^** p < 0,01, vs le groupe opérés. (B) la natation trajectoire des rats dans le procès de la sonde. (A) opérés group, en montrant le grand temps de natation et de la distance dans le quadrant de la cible (Q1). (B) imprégnées d’Aβ composite group, en montrant le moins de temps de baignade et distance dans quadrant cible (Q1). La figure a été modifiée par référence 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Composite Aβ influencé la vitesse de nage de Rat :

Le rat, la vitesse de nage a été calculé par la plateforme visible du procès le jour 7 d’épreuve de labyrinthe de l’eau de Morris, qui correspondait au jour 85 après l’intervention chirurgicale. Le rat nage vitesse, basé sur le calcul de la distance et le temps de marcher sur la plate-forme, de chaque groupe dans la piscine de natation n’était pas significativement différent. Par conséquent, les différences individuelles chez le rat, la vitesse de nage pouvaient être exclus, ce qui indique que la motivation et les habiletés motrices étaient essentiellement intactes chez tous les rats (Figure 5).

Figure 5 . Composite Aβ influencé la vitesse de nage de rat. Le rat, la vitesse de nage a été calculé par la plateforme visible du procès le jour 7 de l’épreuve de labyrinthe d’eau Morris, qui a eu lieu le lendemain de l’opération de 85. Le rat, la vitesse de chaque groupe de nage n’était pas significativement différent. Données ont été analysées par ANOVA à avec l’essai de la gamme multiple. Moyenne ± SEM. n = 6. La figure a été modifiée par référence 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Composite Aβ causé Rat neuronale changement morphologique :

Tous les rats ont été tués par décapitation jour 86 de la chirurgie. L’inspection visuelle a conclu qu’une surface jaune ou un mince ou réduit le cortex cérébral est apparu dans plusieurs composés Aβ chez les rats traités. Par rapport au groupe opérés (Figure 6 a,A2), observation de la microscopie optique du groupe composite Aβ traités par il tachée, trouvé des changements pathologiques de neurones hippocampiques, telles que la dégénérescence neurofibrillaire, neuronophagia, pyknosis nucléaire et nucléaire margination (Figure 6 a,B2). En outre, la partie du cortex cérébral dans le groupe composite imprégnées d’Aβ a révélé une nécrose colliquative typique, qui se caractérisait par des membranes cellulaires perturbés, noyaux fragmentées et l’infiltration des cellules inflammatoires dans la région nécrosée ( Figure 6 a ( B3). Cela indique que l’Aβ composite peut occasionner des blessures pathologiques structurels neuronales chez le rat.

En plus des changements pathologiques de structure neuronale, comparée au groupe opérés, le nombre de neurones est aussi significativement diminué dans l’hippocampe et le cortex cérébral (à l’exception de l’échantillon de nécrose colliquative) de la composite Groupe traité Aβ. Le nombre de neurones était 63,86 % (p < 0,01) inférieur à celui du groupe opérés dans les sections de CA1 hippocampe de 0,125 mm et 55,46 % (p < 0,01) dans les sections du cortex cérébral de mm2 0.0352 (Figure 6 b), ce qui suggère que l’Aβ composite peut entraîner un nombre de neurone a diminué.

Figure 6 . Composite Aβ causé changement morphologique neuronale rat. (A) les images représentatives des neurones corticaux hippocampiques et cérébrales colorées avec HE. (A1–B1) Hippocampe 40 x ; (–DuA2,B2) CA1 de l’hippocampe x 400 ; (–DuA3B3) Cortex cérébral x 400. (A1–A3) Groupe opérés ; (–DuB1,B3) Groupe de traité Aβ composite ; montre la dégénérescence neurofibrillaire (→), neuronophagia (←), pyknosis nucléaire (↗), nucléaire margination (↙) dans l’hippocampe, nécrose colliquative typique (★), perturbée les membranes cellulaires, perte de neurone marquée, un grand nombre de cellules inflammatoires infiltrés dans le cortex cérébral dans la partie du groupe composite imprégnées par l’Aß. Echelle de A1, B1 = 10 µm ; Echelle de A2, A3, B2, B3 = 100 µm. (B) nombre de neurones avec tache HE dans l’hippocampe et le cortex cérébral, qui ont été comptabilisés sous un microscope optique (x 400). Chaque volume représente la moyenne ± SEM de 9 champs visuels de 3 échantillons indépendants (n = 3). ^** p < 0,01, vs groupe opérés.  La figure a été modifiée par référence 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La microscopie électronique a observé l’ultrastructure cellulaire des neurones de l’hippocampe. La sous-structure des neurones de l’hippocampe dans le groupe d’imprégnées d’Aβ composite (Figure 7 b1 – B4) ont été significativement détruits, montrant un gonflement mitochondrique et bris de crêtes, densité électronique mitochondrial accrue dilatées rugueuse le réticulum endoplasmique, polyribosomes dépolymérisées et polymicrotubules, certains densité postsynaptique (PSD), nombreux lysosomes secondaires et sédiments de lipofuscine dans le cytoplasme, par rapport au groupe opérés (Figure 7 a1 – A4). La membrane nucléaire était brut et enfoncés, l’euchromatine est condensée et dénaturé, les couches de la gaine de myéline étaient desserrés ou la dégénérescence et les axones internes et les fibres ont été atténuées.  Ces résultats démontrent que l’Aβ composite peut produire des dommages de sous-structure de neurones chez les rats.

Figure 7 . Structure de subcellulaire des neurones hippocampal évaluées par observation au microscope électronique. A1 -A4: groupe opérés. Echelle de A1 = 4 µm, 12, 000 x ; Echelle de A2 = 3 µm, 15, 000 x ; Echelle de A3 = 5 µm, 10, 000 x ; Echelle de A4 = 1 µm, 35, 000 x. (B1–B4) Composite groupe traité Aβ. (B1) Neurone et pyknosis nucléaire (←), condensation d’euchromatine ou dégénérescence (#), houle de pied astrocyte (*), les mitochondries de densité électronique élevée (▲), couches de myéline gaine lâches ou atténuation (→) ; (B2) Grand GFAP, mitochondries de densité électronique élevée (▲), couches de myéline gaine lâches ou atténuation (), lysosomes secondaires supérieures (↑), péricytes pyknosis, péricytes euchromatine condensation ou dégénérescence (☆), houle de pied astrocyte (*), densité électronique haute mitochondries (▲), plus la lipofuscine (↓), couches de myéline gaine lâches ou atténuation (→). B4 : plusieurs neurotransmetteur excitateur (#), électrons haute densité ou blessure membrane mitochondries (▲), moins synapsis. Echelle de B1, B2 = 10 µm, 5, 000 x ; Echelle de B3 = 5 µm, 8, 000 x ; Echelle de B4 = 1 µm, 40, 000 x. La figure a été modifiée par référence 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Composite Aβ causé Aβ fardeau dans des neurones de Rat :

La coloration rouge Congo a été utilisée pour détecter le fardeau de bêta-amyloïdes sur les neurones. Les résultats montrent que l’Aβ composite peut induire notamment la charge de Aβ intracellulaire dans l’hippocampe du rat et le cortex cérébral (Figure 8A). Le nombre positif de cellules avec Aβ rouge teinté de rouge Congo dans l’hippocampe et le cortex cérébral du groupe composite imprégnées d’Aβ est 8.05 et 4.09 fois (p < 0,01) supérieur à celles du groupe opérés (Figure 8B). Cela démontre que Aβ composite peut alourdir neurone Aβ chez les rats.

Figure 8 . Aβ composite a causé fardeau de bêta-amyloïdes dans le rat neurones. (A) images représentatives de positif neurone de bêta-amyloïdes coloré par le rouge Congo dans l’hippocampe et cérébrale corticales. ()A1–B1) CA1 de l’hippocampe x 400 ; (–DuA2,B2) Cortex cérébral x 400. (A2A1–) Groupe opérés ; (–DuB1,B2) Composite groupe imprégnées d’Aβ, montre Aβ plus positive de cellules colorées par le rouge Congo. Echelle = 10 µm, x 400. (B) des nombres positifs des neurones de bêta-amyloïdes colorées par le rouge Congo dans l’hippocampe et le cortex cérébral, qui ont été comptabilisés sous un microscope optique (x 400). Chaque volume représente la moyenne ± SEM de 9 champs visuels de 3 échantillons indépendants (n = 3). ^** p < 0,01, vs groupe opérés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Composite Aβ causé NFT retombées dans les neurones de Rat :

Coloration au nitrate d’argent a été utilisée pour détecter les dépôts NFT dans les neurones. Les résultats montrent que Aβ composite peut causer sensiblement la déposition de NFT intracellulaire chez le rat hippocampe et du cortex cérébral (Figure 9A). Le nombre positif de cellules avec NFT brun teinté de nitrate d’argent dans l’hippocampe et le cortex cérébral du groupe composite imprégnées d’Aβ est 9,75 et 4.82 fois (p < 0,01) supérieur à celles du groupe opérés (Figure 9B ). Cela démontre que l’Aβ composite peut augmenter l’agrégation de NFT neurone chez les rats.

Figure 9 . Composite Aβ causé agrégation NFT en rat neurones. (A) les images représentatives des neurones NFT positifs tachés de nitrate d’argent dans l’hippocampe et le cortex cérébral. (A1–B1) CA1 de l’hippocampe x 400 ; (–DuA2,B2) Cortex cérébral x 400. (A2A1–) Groupe opérés ; (–DuB1,B2) Composite groupe traité Aβ. affichage de la NFT plus positive de cellules colorées par le nitrate d’argent dans le groupe composite traité. Echelle = 10 µm, x 400. (B) positif NFT neurones nombre de taches de nitrate d’argent dans l’hippocampe et le cortex cérébral, qui ont été comptabilisés sous un microscope optique (x 400). Chaque volume représente la moyenne ± SEM de 9 champs visuels de 3 échantillons indépendants (n = 3). ^** p < 0,01, vs groupe opérés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Il est bien connu que la perte de l’apprentissage et la mémoire sont les signes cliniques majeurs chez AD patients². La procédure décrite ici est une méthode in vivo pour étudier les AD ; Nous avons adapté un protocole déjà publié qui se sont avérés un médicament pour pallier les déficits de mémoire et des lésions neuronales dans un modèle de rat⁴. Notre protocole fournit des détails importants pour obtenir des données précieuses, ainsi qu’un taux de survie élevé des animaux qui modélisent avec succès des opération, déficits de mémoire, blessures de neurone, fardeau de bêta-amyloïdes et des dépôts de NFT, pour imiter les AD (dans la présente expérience, le taux de survie et modèle de fonctionnement sont plus de 90 %). Ces rats modèle fructueux ont été utilisés pour mesurer leur mémoire spatiale avec le test de labyrinthe de l’eau de Morris. Le procès de navigation positionnement trouvé que l’Aβ composite peut causer rat acquisition mnésique ; le procès de la sonde a trouvé que l’Aβ composite peut diminuer la rétention de rat de mémoire ; et la reprise du procès a trouvé que l’Aβ composite peut entraîner rat réapprentissage de déficience. Ces données d’essai Morris water maze montrent que l’Aβ composite peut induire la mémoire spatiale de rat. Dans l’ensemble, injectant des rats intracerebroventricularly AB25-35 en combinaison avec AlCl₃ et TGF-β1 créé un réalisable et crédible le in vivo AD-comme modèle animal pour le laboratoire.

Des études antérieures ont montré que le volume du cerveau chez les patients AD est de 10 % inférieur à celui des individus en bonne santé. Atrophies diverses se trouvent dans l’hémisphère cérébral par observation visuelle. Le degré d’atrophie corticale est positivement reliée à l' insuffisance de mémoire¹⁹. À l’histologie, le grand nombre de perte de neurone et grave pathologie morphologique dérange directement la fonction de mémoire dans AD patients²⁰. Dans la présente étude, l’observation microscopique de lumière/electron a trouvé que les rats micro avec Aβ composite affichent bouleversements neuropathologiques de la maladie, y compris la perte de neurones et la perturbation de la structure neuronale et subcellulaire. Ce résultat confirme le trouble de la mémoire spatiale de rat induit par l’Aß composite et est similaire à l’état des patients atteints de ma.

Il est bien connu que le fardeau de bêta-amyloïdes cérébrales et agrégation NFT sont considérés comme les principaux traits de histopathogenic en AD. Ils peuvent détruire la structure neuronale, perturber la signalisation neuronale, perturber la fonction neuronale et aboutir à la démence avancée¹⁷. Le présent modèle animal trouvé fardeau Aβ et agrégation NFT dans le cerveau, qui suis d’accord avec l’état de patients AD. Par conséquent, les blessures de neurones présents chez le rat induite par l’Aß composite peuvent servir comme modèle pour étudier la pathologie neuronale et la stratégie de traitement de la ma.

Voici des exemples des effets de la drogue dans les modèles de rat AD de dépistage : Zhao et al., a indiqué que les deux flavonoïdes de Scutellaria tiges et feuilles (SSF) et Scutellaria barbata (SBF) peut atténuer les troubles de la mémoire rat et l’apoptose induite par composite Aβ^8,9. Guo et al., a aussi déclaré que SBF peut inhiber l’agrégation NFT et phosphorylation excessive de protéines tau à côté de Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 et Thr231 et diminuer l’expression de GSK-3β, CDK5 et PKA ARNm et de protéines chez les rats traités Aβ compositées²¹ . Simultanément, Shang et al., ont également rapporté que SBF peut supprimer la prolifération des astrocytes et les cellules microgliales et l’inférieure Aβ1-40, la Aβ1-42, et β-site APP clivage enzymatique 1 (BACE1) expression de l’ARNm dans le cerveau d’Aβ compositée rats²². D’après ces résultats, notre modèle animal est avantageux sur autre modèle AD-like, qui impliquent plus de fonction neuronale et de structure et de trouble.

Pour autre modèle AD-like, injection unique intracérébroventriculaire de bêta-amyloïdes à des rats peut provoquer des déficits de mémoire de rat, la perte de neurone et prolifération de neurogliocyte, mais peut ou peut ne pas avoir de dépôts Aβ et NFT²³. Des rats exposés à des doses élevées Al semblent avoir un taux de réussite élevé, imitateur AD et un modèle animal rentable, avec troubles de la mémoire, perte de neurone, prolifération de neurogliocyte et plaque sénile (SP) et agrégation NFT dans le cerveau. Cependant, la forte dose d’Al peut provoquer des lésions du foie de rat et anorexie, accompagnée d’une diminution de poids²⁴. Le rat âgé est un autre modèle de type AD. Les rats âgés montrent des déficits de mémoire, des changements pathologiques de structure neuronale/sous-structure, des dépôts de lipofuscine, mais sans fardeau d’Aβ et agrégation NFT. Rats de plus de 24 mois d’âge sont considérés comme des personnes âgées pour ce modèle et donc il faut une plus longue période d’alimentation et donc le coût est supérieur de^17,25. Des souris transgéniques SAMP8 et APP sont les plus proche simulent à AD et ils sont des modèles le plus idéales pour enquêter sur les AD. Mais les deux modèles animaux sont plus chers et sont limités à utiliser dans le laboratoire^26,,²⁷. Comparaison avec les modèles animaux ci-dessus, notre modèle de composite modèle animal imprégnées d’Aβ a un moindre coût et haute performance, ce qui en fait un outil idéal pour l’étude AD.

En conclusion, une injection intracérébroventriculaire d’AB25-35 combiné avec AlCl₃ et TGF-β1 aux rats vous propose un modèle animal précieux in vivo afin de mieux comprendre les troubles de la mémoire spatiale, lésions neuronales, fardeau de bêta-amyloïdes et le dépôt de NFT AD sous-jacent. Ce modèle fournit un rapide et relativement simple protocole expérimental avec un animal élevé survivre taux et taux de succès élevé modèle de fonctionnement, ainsi qu’un taux élevé de chevauchement d’activités, qui ont montré pour être plus économique. Le présent modèle animal est un modèle efficace pour imiter les AD et peut valider davantage en étant utilisé pour imiter les diverses autres maladies.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rat	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China	SCXK(Jing) 2012-0001	300–350 g
Morris water maze	Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China	No
Movable small animal anesthesi	RWD Life Science Co., Ltd. China	R580
Brain Stereotaxic Apparatus	RWD Life Science Co., Ltd. China	68001
Flexible bone drill	Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China	BW-sD908
Transmission electron microscope	Japan Co., Ltd. Japan	JEM-1400
Two channel microinjection pump	RWD Life Science Co., Ltd. China	RWD202
EM microtome	Hitachi Co., Ltd. China	H-7650
Dummy cannula	RWD Life Science Co., Ltd. China	62001	0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html
Guide cannula	RWD Life Science Co., Ltd. China	62101	0.D.0.40mm/M3.5
Internal cannula	RWD Life Science Co., Ltd. China	62201	0.D.0.41×I.D.0.25mm/M3.5
Tighten the nut	RWD Life Science Co., Ltd. China	62501	0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5
Fixing screw	RWD Life Science Co., Ltd. China	62514	M1.2×L2.0mm(100BAO)
The screwdriver	RWD Life Science Co., Ltd. China	62999	45*1mm
PE Tubing	RWD Life Science Co., Ltd. China	62302
Amyloid beta 25-35	Sigma Aldrich Co. USA	SCP0002-5MG
Recombinant human transforming growth factor-β1	PeproTech Inc. USA	100-21
Aluminium trichloride	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China	3011080
Congo red	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China	3010016
Silver nitrate	Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China	20150720
Denture base material	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. China	20170609