アポトーシス細胞の食作用アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

要約

本明細書では、 ショウジョウバエの分散胚細胞を用いた食作用アッセイを記載する。これにより、in vivoでの貪食レベルを簡単かつ正確に定量化し 、アポトーシス細胞の貪食に必要な新しい分子を同定することができます。

要約

アポトーシス細胞の食作用の根底にある分子メカニズムは、免疫および炎症性難治性疾患におけるその役割のために、より詳細に解明される必要がある。本発明者らは、本明細書において 、エンザイムリアクションを制御する遺伝子ネットワークが哺乳動物から進化的に保存されているショウジョウバエを用いて、貪食を定量的に調べる実験的方法を開発した。全動物を用いて貪食細胞および貪食細胞を正確に検出および計数するために、 ショウジョウバエ胚をホモジナイズして、貪食細胞およびアポトーシス細胞を含む分散細胞を得た。分散胚細胞の使用は、我々は全体の胚では、すべての食細胞およびアポトーシス細胞を観察し、正確に食作用のレベルを定量化することも可能であるインビトロ食作用アッセイを行ったかのようにin vivoでの食作用のレベルを測定することが可能になります。この方法が以前の研究のものを再現することを確認したアポトーシス細胞の貪食に必要な遺伝子を同定した。この方法は、死細胞の貪食を分析することができ、 ショウジョウバエの強力な遺伝学と組み合わせると、貪食細胞によるアポトーシス細胞の遊走、認識、貪食、分解からなる複合貪食反応を明らかにする。

概要

後生動物では、 例えば 、線虫線虫（Caenorhabditis elegans）、果実はキイロショウジョウバエ 、マウスやヒトを飛ぶ、細胞の大多数は、自分の体を形作るために開発中のアポトーシスを受けるし、成人期に恒常性^1、2を維持します。アポトーシス細胞は、完全に除去されなければ免疫原性細胞内物質を放出することによって周囲の組織に炎症を誘発するため、迅速に除去する必要がある³ 。食細胞の貪食受容体によって認識され、貪食^{3、4、5、6}によって除去される迅速な除去を容易にするために、本アポトーシス細胞いわゆる食べる-MEを信号。このように、食作用は宿主恒常性の維持に重要な役割を果たし、従って、分子の解明アポトーシス細胞の食作用の根底にある機構が重要である。

アポトーシス細胞の食作用に関与する機構は、線虫、ハエ、およびマウスの種間で進化的に保存されているようである⁷ 。いくつかの食作用アッセイが、現在、これらのモデル動物におけるアポトーシス細胞の貪食を評価するために利用可能である。 線虫では 、131体細胞は発達中にプログラム細胞死を起こし、細胞死体は非専門食細胞である隣接細胞によって貪食される⁸ 。したがって、 C.エレガンスの残りの細胞死体の数を数えることは、インビボでの食作用のレベルを示す。死細胞数の増加を示し、線虫の変異体を探索することにより、食作用のために必要ないくつかの遺伝子が同定されており、遺伝的に^10、9特徴付け^、S = "外部参照"> ^11、12。

初代培養食細胞、一般にマクロファージを用いたエクスビボ食作用アッセイは、しばしばマウスにおいて利用される。アポトーシス細胞は、Jurkat細胞のような細胞系を用いて調製され、一次貪食細胞と混合される。数時間のインキュベーションの後、ファゴサイトーシスのレベルを評価するために、ファゴサイトおよび貪食ファゴサイトの総数を数える。この方法の洗練された改変として、Nagataのグループは、アポトーシス細胞がアポトーシスDNA断片化を起こさないカスパーゼ耐性ICAD（カスパーゼ活性化DNアーゼ阻害剤）を発現する細胞を用いたex vivo食作用アッセイを開発したが、細胞は貪食される。これらの細胞を食作用アッセイにおいてアポトーシス標的として使用する場合、貪食されたアポトーシス細胞のDNAのみが断片化され、TdT媒介dUTPニック末端標識（TUNEL）によって染色される。したがって、アポトーシス細胞の貪食は、食細胞とアポトーシス細胞の混合物中のTUNELシグナルを計数することによって測定される¹³ 。

キイロショウジョウバエでは、血球、 ショウジョウバエマクロファージ、名前のプロの食細胞がアポトーシスを起こした細胞^14、15の食作用を担当しています。培養細胞系を用いたin vitro食作用アッセイに加えて、 ショウジョウバエの全胚を用いたin vivo食作用アッセイが利用可能である。 ショウジョウバエの胚は、多くの細胞がアポトーシスを受けるし、胚発生^14、15、16の間に血球によって貪食されているので、アポトーシス細胞の貪食のレベルを調べるための強力なツールです。 インビボ貪食アッセイの一例は、フランのグループによって開発された方法である。彼らの方法では、血球は、ペルオキシダの免疫染色、血球マーカーによってtected、アポトーシス細胞を核染料を用いて染色し、7-アミノアクチノマイシンD全体ショウジョウバエ胚において、二重陽性細胞の数は、貪食¹⁷の信号としてカウントされます。胚に対する食作用アッセイの別の例は、上記の永田の方法の概念に基づいている。しかしながら、 インビボで食作用は、（ ショウジョウバエカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ）突然変異体は^18、19ハエDCADの胚を用いて評価されます。これらのインビボ食作用アッセイは、インサイチューで食作用を直接観察するのに有用である。しかしながら、貪食細胞の計数段階において可能な偏りを除外することには困難が伴う。なぜなら、その厚さのために全胚細胞中の全ての食細胞およびアポトーシス細胞を観察することが困難であるからである。

この制限を克服するために、我々はショウジョウバエの胚における新しい食作用アッセイを編集した。我々の方法では、貪食細胞を容易に計数するために、全胚を均質化して分散胚細胞を調製する。貪食細胞は食細胞マーカーの免疫染色により検出され、アポトーシス細胞はこれらの分散した胚細胞を有するTUNELによって検出される。分散された胚細胞の使用は、私たちが食作用のレベルを正確に定量するインビトロ貪食アッセイを行ったかのようにインビボ貪食レベルを測定することを可能にする。食作用によるアポトーシス細胞クリアランスが最も豊富な発生段階である、胚^20の段階16に発展する場合、このアッセイでは、全ての遺伝子型のハエを用いることができる。この方法は、食作用のレベルを定量的に評価する利点を有し、したがって、 インビボでのアポトーシス細胞の食作用に関与する新しい分子の同定に寄与し得る 。

プロトコル

1.準備

1. 新鮮なブドウジュース寒天プレートの調製
   1. 寒天4.4gに水100mLを加え、電子レンジで混合物を加熱して寒天を溶解する。
   2. 80mLの新鮮なブドウ果汁、5mLの酢酸、および5mLのエタノールを寒天溶液に加える。
   3. 約1.5 mLの溶液をピペットで各スライドガラスに注ぎ、凝固させます。
2. 6cm皿アガロースプレートの調製
   1. アガロース0.5gに水50mLを加え、電子レンジで混合物を加熱してアガロースを溶解する。
   2. 約2.5 mLのアガロース溶液を6 cmディッシュにピペットで注ぎます。

ステージ16胚コレクション

1. 大人のハエを収集し、200匹の雌と200匹の雄を50 mLコニカルチューブに加える。
2. 酵母に新鮮なブドウ果汁寒天のプレートを50 mLのチューブに入れ、スポンジcaで閉じますp。
3. 2〜3日間、16℃で軽くインキュベートします。プレートを1日1回交換してください。
4. ハエを25℃で1時間動かします。
5. 古いプレートを酵母のない新しいプレートに交換してください。飛行機に2時間卵を産むことを許可する。
6. プレートを集め、16℃で26時間インキュベートする。
7. 0.2％（v / v）トリトンX - 100を含むPBS 1mLにペイントブラシでプレートから胚を収集します。
8. 0.2％（v / v）のトリトンX-100を含有する1mLのPBSで胚を2回洗浄する。
9. 絨毛膜を除去するために、1.2mLの次亜塩素酸ナトリウム溶液（2.2〜3.4％Cl）を3分間胚に加える。
10. 0.2％（v / v）Triton X-100を含む1mLのPBSで胚を4回洗浄する。
11. 6cmのディッシュのアガロースプレートに胚を置きます。 Roberts ²⁰によって記載されているように、顕微鏡下で第16段階胚を採取する。マイクロピペットを備えた1.5mLのTreffマイクロ試験管に約50個の胚を収集する。

3.準備胚細胞の分化

1. 150μLのPBSで胚を2回洗浄する。
2. PBS中の200μLのコラゲナーゼ（0.25％（w / v））の存在下で、1.5mLマイクロ試験管およびペレットミキサー中で胚を30回均質化する。
3. ピペットで10回胚細胞を分散させ、細胞懸濁液を1.5mLチューブに移す。 37℃で1分間水浴中で細胞をインキュベートする。この手順を2回繰り返します。
4. 細胞懸濁液にPBS800μLを添加し、1400× gで4℃で5分間遠心分離する。
5. 上清を除去し、PBSに200μLのトリプシン（0.25％（w / v））を細胞に加える。 50回ピペッティングすることにより胚細胞を分散させる。
6. 細胞懸濁液を70μm細胞ストレーナーでろ過する。
7. トリプシン活性を停止させるために、濾過した細胞懸濁液に熱不活性化ウシ胎仔血清40μLを添加する。 800μLのPBSを添加し、4℃で1400× gで5分間遠心分離する。
8. スーパーナタを削除する沈殿した細胞を200μLのPBSに懸濁し、1400× gで4℃で5分間遠心分離する。
9. 上清を除去し、沈殿した細胞を30μLのPBSに懸濁する。
10. 調製した細胞懸濁液をアミノプロピルトリエトキシシランでコーティングしたガラススライドにマウントし、細胞がスライドガラスに付着するまで10〜15分間待つ。
11. ガラススライド上の残りの溶液をピペットで除去する。固定のために10〜15分間細胞に4％（w / v）PFA（パラホルムアルデヒド）を含む60〜70μLのPBSをマウントする。
12. 固定溶液を除去し、ガラススライドをPBSに1分以上置きます。

4.血球の染色

1. 抗クロキモト抗体による免疫染色
   1. 0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBS中で10分間メタノールを連続的に浸漬し、10分間PBSでスライドさせる。
   2. 5％（v / v）の全ブタ血清をPBS中に20μL詰めるブロッキングのために0.2％（v / v）Triton X-100を細胞に添加する。スライドを室温で20分間インキュベートする。
   3. ガラススライドから液を除去し、PBS、0.2％を含有する抗Croquemort抗血清^{19、21（0.1％（V} / V））の20μLマウント（v / v）のトリトンX-100細胞上。スライドを4℃で一晩インキュベートする。
   4. ガラススライドを0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSに10分間5回浸漬する。
   5. ガラススライドをPBSに10分間浸します。
   6. 0.2％（v / v）Triton X-100および5％（v / v）ブタ血清を含むPBS中の20μLのアルカリホスファターゼ標識抗ラットIgG（0.5％（v / v） 1時間撹拌した。
   7. ガラススライドを0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSに10分間5回浸漬する。
   8. 100 mM Tris-HCl、pH 9.5,100 mM NaCl、50 mM MgCl ₂を含むバッファーに10分間スライドガラスを浸します。
   9. 0.23mg / mLの5-ブロモ-4を含有するホスファターゼ基質基質溶液（BCIP）、0.35mg / mLのニトロブルーテトラゾリウム（NBT）、100mM Tris-HCl、pH9.5,100mM NaCl、および50mM MgCl ₂を細胞に添加した。
   10. 適切な染色のために顕微鏡下で細胞を観察する。血球の顆粒中に強い紫色のシグナルが現れた場合、基質溶液を除去し、ガラススライドを10mM Tris-HCl、pH 8.5および1mM EDTAからなる緩衝液に浸す。約5〜10分間の染色が推奨される。
2. 抗GFP抗体による免疫染色（血球の染色のための別の選択肢）
   1. ガラススライドをメタノール中で10分間、0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSを10分間、PBSを10分間浸漬する。
   2. ブロッキングのために0.2％（v / v）のTriton X-100を含有するPBSに5％（v / v）ブタ血清20μLをマウントする。スライドを室温で20分間インキュベートする。
   3. ガラススライド上の溶液を除去し、20μLのマウス抗GFP抗体（1％（v / v））/ PBS cをマウントする。細胞上の0.2％（v / v）Triton X-100を含む。スライドを室温で一晩インキュベートする。
   4. ガラススライドを0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSに10分間5回浸漬する。
   5. ガラススライドをPBSに10分間浸します。
   6. 0.2％（v / v）トリトンX-100および5％（v / v）全ブタ血清を含有するPBS中の20μLのアルカリホスファターゼ標識抗マウスIgG（0.5％（v / v） 1時間撹拌した。
   7. ガラススライドを0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSに10分間5回浸漬する。
   8. 100mM Tris-HCl、pH9.5,100mM NaCl、および50mM MgCl ₂からなる緩衝液中に10分間ガラススライドを浸漬する。
   9. 細胞に0.23mg / mL BCIP、0.35mg / mL NBT、100mM Tris-HCl、pH9.5,100mM NaCl、および50mM MgCl ₂を含むホスファターゼ基質溶液をマウントする。
   10. 適切な染色のために顕微鏡下で細胞を観察する。紫色のシグナルが全血球に現れると、基質溶液を除去し、10mMのトリス-HCl、pH8.5および1mMのEDTAを含む。約10〜15分間の染色が推奨される。

5.TUNELによるアポトーシス細胞の染色

1. ガラススライドをPBSに5分間浸します。
2. 新しいPBSで繰り返します。
3. 10分間、細胞上の平衡緩衝液（材料表を参照）をマウントする。
4. ガラススライドから溶液を取り出し、37℃で1時間、細胞に5μLの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび15μLのReaction Bufferを含む20μLのTdT溶液をマウントする。
5. ガラススライドから溶液を除去し、スライドを0.5 mLのSTOP / Washバッファーと17 mLの水で構成されたバッファーに浸します。
6. スライドを5分間3回PBSに浸す。
7. 抗ジゴキシゲニン - ペルオキシダーゼ20μLを室温で30分間細胞に添加する。
8. ガラススライドをPBSに5分間4回浸漬する。
9. 50mM Tris-HCl、pH7.5を含む30mLのペルオキシダーゼ基質溶液にガラススライドを浸します3,3'-ジアミノベンジジンテトラハイドロクロライド（DAB）、0.002％（v / v）H ₂ O ₂の30秒間の完全マイクロスパチュラである。
10. アポトーシス細胞が褐色に染色されるまで、ステップ5.9を繰り返す。ガラスを水に浸してペルオキシダーゼ反応を停止させる。
11. 観察のために細胞を水で囲む。

6.アポトーシス細胞の食作用のレベルを測定する。

1. ファゴサイトーシスのレベルを評価するために、サンプルを光学顕微鏡下で観察する。クロークポート陽性細胞または血球としてのGFP陽性細胞、アポトーシス細胞としてのTUNEL陽性細胞、および貪食血球としての二重陽性細胞を計数する。
2. 貪食指数は、Croquemort陽性細胞またはGFP陽性細胞の総数に対する二重陽性細胞の数として定義される。 300以上の血球が観察されることが推奨される。

結果

アポトーシス細胞の食作用を調べるために、発育段階16のショウジョウバエ胚を回収し、分散細胞として調製した。血球、 ショウジョウバエマクロファージは、特異的抗体^19、21を用いて、血球マーカー^{「Croquemort」17、22}のために免疫細胞化学により染色し、そしてア...

ディスカッション

本明細書では、 ショウジョウバエ胚を用いた食作用アッセイについて記載した。胚細胞を分散させて貪食量を定量的に測定することにより、血球マーカーであるCroquemortまたはsrpHemo-駆動GFPについて、血球、 ショウジョウバエプロフェッショナル貪食細胞を免疫染色し、アポトーシス細胞をこのプロトコールでTUNELによって検出する。食作用のレベルは、血球の総数お...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
whole swine serum	MP Biomedicals	55993	For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL	TreffLab	96. 4625. 9. 01	For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL	TreffLab	96. 7339. 9. 03	For  homogenization
Collagenase	Sigma-Aldrich	C-0130	For preparation of embryonic cells
Trypsin	Thermo Fisher SCIENTIFIC	27250-018	For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPL	475-1612	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate	Roche	11383221001	BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium	Roche	11383213001	NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody			described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1)	Roche	11814460001	For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate	Bio-Rad	170-6520	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit	Millipore	S7100	For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride	nacalai tesque	11009-41	DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name	Stock center	Stock ID	Comments
w1118			Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5			drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2			Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP			described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR	VDRC	4833	-
UAS-Itgbn-IR	NIG-fly	1762R-1	-