Essai de phagocytose pour les cellules apoptotiques dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Résumé

Nous décrivons ici un test de phagocytose utilisant les cellules embryonnaires dispersées de Drosophila . Il nous permet de quantifier facilement et précisément les niveaux de phagocytose in vivo et d'identifier de nouvelles molécules requises pour la phagocytose des cellules apoptotiques.

Résumé

Les mécanismes moléculaires sous-jacents à la phagocytose des cellules apoptotiques doivent être élucidés plus en détail en raison de leur rôle dans les maladies immunitaires et intrathables. Nous avons développé ici une méthode expérimentale pour étudier quantitativement la phagocytose à l'aide de la Drosophila de la mouche des fruits, dans laquelle le réseau de gènes contrôlant les réactions d'absorption est conservé d'évolution des mammifères. Afin de détecter et compter avec précision les phagocytes englobants et non absorbants utilisant des animaux entiers, les embryons de Drosophila ont été homogénéisés pour obtenir des cellules dispersées comprenant des phagocytes et des cellules apoptotiques. L'utilisation de cellules embryonnaires dispersées nous permet de mesurer les niveaux de phagocytose in vivo comme si nous avons effectué un test de phagocytose in vitro dans lequel il est possible d'observer tous les phagocytes et cellules apoptotiques dans des embryons entiers et quantifier précisément le niveau de phagocytose. Nous avons confirmé que cette méthode reproduit celles d'études antérieuresQui a identifié les gènes requis pour la phagocytose des cellules apoptotiques. Cette méthode permet d'analyser l'engourdissement des cellules mortes et, combinée à la génétique puissante de Drosophila , révélera les réactions phagocytaires complexes qui composent la migration, la reconnaissance, l'engorgement et la dégradation des cellules apoptotiques par des phagocytes.

Introduction

Dans les animaux métazoaires, par exemple, le nématode Caenorhabditis elegans , la mouche à fruits Drosophila melanogaster , et les souris et les humains, un grand nombre de cellules subissent une apoptose au cours du développement pour façonner leur corps et à l'âge adulte pour maintenir l'homéostasie ^{1 , 2} . Les cellules apoptotiques doivent être rapidement éliminées car elles induisent une inflammation dans les tissus environnants en libérant des matériaux intracellulaires immunogènes, sinon complètement éliminés ³ . Afin de faciliter l'élimination rapide, les cellules apoptotiques présentent les signaux dits "eat-me" qui sont reconnus par les récepteurs d'engulfment des phagocytes et sont éliminés par phagocytose ^{3 , 4 , 5 , 6} . Ainsi, la phagocytose joue un rôle crucial dans le maintien de l'homéostasie de l'hôte et donc, l'élucidation de la molécule Les mécanismes marquants sous-jacents à la phagocytose des cellules apoptotiques sont importants.

Les mécanismes responsables de la phagocytose des cellules apoptotiques semblent être conservés d'une manière évolutive chez les espèces des nématodes, des mouches et des souris ⁷ . Plusieurs tests de phagocytose sont actuellement disponibles pour évaluer l'absorption de cellules apoptotiques dans ces modèles d'animaux. Dans C. elegans , 131 cellules somatiques subissent une mort cellulaire programmée pendant le développement, et les cadavres cellulaires sont phagocytés par des cellules voisines, qui sont des phagocytes non professionnels ⁸ . Ainsi, le nombre de cadavres de cellules restants dans C. elegans indique le niveau de phagocytose in vivo . En recherchant des mutants de nématodes qui montrent un nombre accru de cellules mortes, plusieurs gènes requis pour la phagocytose ont été identifiés et caractérisés génétiquement ^{9 , 10 ,}S = "xref"> 11 ^{, 12} .

Des tests de phagocytose ex vivo avec des phagocytes de culture primaire, généralement des macrophages, sont souvent utilisés chez la souris. Les cellules apoptotiques sont préparées en utilisant des lignées cellulaires telles que des cellules Jurkat, et sont mélangées avec des phagocytes primaires. Après une incubation pendant plusieurs heures, le nombre total de phagocytes et de phagocytes engloutis sont comptés afin d'évaluer le niveau de phagocytose. En tant que modification sophistiquée de cette méthode, le groupe de Nagata a développé un test de phagocytose ex vivo avec des cellules exprimant une ICAD résistante aux caspases (inhibiteur de la DNase activée par caspase), dans laquelle les cellules apoptotiques ne subissent pas de fragmentation de l'ADN apoptotique, mais l'ADN est encore clivé lorsque Les cellules sont phagocytées. Lorsque ces cellules sont utilisées comme cibles apoptotiques dans un test de phagocytose, seul l'ADN des cellules apoptotiques englouties est fragmenté et coloré par un marquage de l'extrémité du DUTP médié par TdT (TUNEL). Par conséquent, le niveauL de l'absorption de cellule apoptotique est mesurée en comptant les signaux TUNEL dans un mélange de phagocytes et de cellules apoptotiques ¹³ .

Dans D. melanogaster , les phagocytes professionnels appelés hémocytes, les macrophages de Drosophila , sont responsables de la phagocytose des cellules apoptotiques ^{14 , 15} . En plus des essais de phagocytose in vitro avec des lignées cellulaires de culture, des tests de phagocytose in vivo avec des embryons complets de Drosophila sont disponibles. Les embryons de Drosophila sont un outil puissant pour examiner le niveau d'absorption des cellules apoptotiques car de nombreuses cellules subissent une apoptose et sont phagocytées par des hémocytes pendant le développement embryonnaire ^{14 , 15 , 16} . Un exemple d'un test de phagocytose in vivo est la méthode développée par le groupe de Franc. Dans leur méthode, les hémocytes sont lesProtégés par l'immunocoloration de la peroxidasine, un marqueur d'hémocyte, des cellules apoptotiques sont colorées en utilisant le colorant nucléaire, la 7-amino actinomycine D dans des embryons de Drosophila entiers, et le nombre de cellules posologiques doubles est considéré comme un signal de phagocytose ¹⁷ . Un autre exemple d'un test de phagocytose sur des embryons est basé sur le concept de la méthode de Nagata décrit ci-dessus; Cependant, la phagocytose in vivo est évaluée à l'aide des embryons de DNC ( Drosophila caspase-activase DNase) mutants flies ^{18 , 19} . Ces tests de phagocytose in vivo sont utiles pour observer directement la phagocytose in situ . Cependant, des difficultés sont associées à exclure tout biais possible dans l'étape de compter les cellules phagocytes car il est difficile d'observer tous les phagocytes et les cellules apoptotiques dans les embryons entiers en raison de leur épaisseur.

Pour surmonter cette limitation, nous développonsUn nouvel essai de phagocytose dans des embryons de Drosophila . Dans notre méthode, afin de compter facilement les hémocytes phagocytants, les embryons entiers sont homogénéisés pour préparer des cellules embryonnaires dispersées. Les phagocytes sont détectés par l'immunocoloration d'un marqueur de phagocytes, et les cellules apoptotiques sont détectées par TUNEL avec ces cellules embryonnaires dispersées. L'utilisation de cellules embryonnaires dispersées nous permet de mesurer les niveaux de phagocytose in vivo comme si nous avons effectué un test de phagocytose in vitro qui quantifie précisément le niveau de phagocytose. Tous les génotypes de mouches peuvent être utilisés dans ce dosage si elles se développent au stade 16 des embryons ²⁰ , le stade de développement au cours duquel la clairance cellulaire apoptotique par phagocytose est la plus abondante. Cette méthode présente l'avantage d'évaluer quantitativement le niveau de phagocytose et peut donc contribuer à l'identification de nouvelles molécules impliquées dans la phagocytose des cellules apoptotiques in vivo .

Protocole

1. Préparation

1. Préparation de plaques d'agar de jus de raisin frais
   1. Ajouter 100 ml d'eau à 4,4 g d'agar et chauffer le mélange dans un four à micro-ondes pour dissoudre l'agar.
   2. Ajouter 80 ml de jus de raisin frais, 5 mL d'acide acétique et 5 mL d'éthanol à la solution d'agar.
   3. Verser environ 1,5 ml de la solution avec une pipette sur chaque glissière de verre, et la laisser solidifier.
2. Préparation de plaques d'agarose à plat de 6 cm
   1. Ajouter 50 ml d'eau à 0,5 g d'agarose et chauffer le mélange dans un four à micro-ondes pour dissoudre l'agarose.
   2. Verser environ 2,5 ml de solution d'agarose sur un plat de 6 cm avec une pipette.

2. Phase 16 Collection d'embryons

1. Recueillir des mouches adultes et ajouter 200 femelles et 200 mâles dans un tube conique de 50 ml.
2. Mettez une assiette d'agar de jus de raisin frais sur la levure dans le tube de 50 ml et fermez avec une éponge caP.
3. Incuber les mouches à 16 ° C dans la lumière pendant 2 à 3 jours. Changez la plaque une fois par jour.
4. Déplacez les mouches vers le noir à 25 ° C pendant 1 h.
5. Changez la vieille plaque en une nouvelle sans levure. Laisser moucher des œufs pendant 2 h.
6. Recueillir la plaque et incuber à 16 ° C pendant 26 h.
7. Recueillir des embryons de la plaque avec un pinceau dans 1 mL de PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100.
8. Laver les embryons deux fois avec 1 ml de PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100.
9. Afin d'éliminer le chorion, ajouter 1,2 ml de solution d'hypochlorite de sodium (2,2 à 3,4% Cl) aux embryons pendant 3 min.
10. Laver les embryons 4 fois avec 1 ml de PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100.
11. Placer les embryons sur des assiettes à l'agarose de 6 cm. Ramassez les embryons au stade 16 sous un microscope tel que décrit par Roberts ²⁰ . Recueillir environ 50 embryons dans un tube de test micro Treff de 1,5 ml avec une micropipette.

3. PrepaRation des cellules embryonnaires

1. Laver les embryons deux fois avec 150 μL de PBS.
2. Homogénéiser les embryons 30 fois dans un tube à micro-essai de 1,5 ml et un mélangeur de pastilles en présence de 200 μl de collagénase (0,25% (p / v)) dans du PBS.
3. Dispersez les cellules embryonnaires en pipettant 10 fois et déplacez la suspension cellulaire vers un tube de 1,5 ml. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 min dans un bain d'eau. Répétez cette étape deux fois.
4. Ajouter 800 μL de PBS à la suspension cellulaire et centrifuger à 1400 x g à 4 ° C pendant 5 min.
5. Enlever le surnageant et ajouter 200 μL de trypsine (0,25% (p / v)) dans du PBS aux cellules. Disperse les cellules embryonnaires en pipetant 50 fois.
6. Filtrer la suspension cellulaire avec un filtre cellulaire de 70 μm.
7. Afin d'arrêter l'activité de la trypsine, ajouter 40 μL de sérum de bovin fœtal inactivé par la chaleur à la suspension de cellules filtrées. Ajouter 800 μL de PBS et centrifuger à 1 400 x g à 4 ° C pendant 5 min.
8. Supprimer les supernataNt, suspendre les cellules précipitées dans 200 ul de PBS et centrifuger à 1400 x g à 4 ° C pendant 5 min.
9. Enlever le surnageant et suspendre les cellules précipitées dans 30 μL de PBS.
10. Monter la suspension cellulaire préparée sur des lames de verre recouvertes de triéthoxysilane aminopropylique et attendre de 10 à 15 minutes jusqu'à ce que les cellules soient fixées aux glissières de verre.
11. Retirez la solution restante sur les diapositives en verre avec une pipette. Montez 60 - 70 μL de PBS contenant 4% (p / v) de PFA (paraformaldéhyde) sur les cellules pendant 10 à 15 minutes pour la fixation.
12. Retirez la solution de fixation et placez les diapositives de verre dans du PBS pendant plus d'une minute.

4. Coloration des hémocytes

1. L'immunocoloration avec un anticorps anti-Croquemort
   1. Tremper en série les lames de verre dans du methanol pendant 10 minutes, dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 min, puis dans du PBS pendant 10 min.
   2. Monter 20 μL de sérum de porc entier entier à 5% (v / v) dans PBS contenirNg 0,2% (v / v) Triton X-100 sur les cellules pour le blocage. Incuber les lames à température ambiante pendant 20 min.
   3. Retirez la solution des glissières en verre et montez 20 μL d'antiserès anti-Croquemort ^{19 , 21} (0,1% (v / v)) dans du PBS contenant Triton X-100 à 0,2% (v / v) sur les cellules. Incuber les lames à 4 ° C pendant la nuit.
   4. Faire tremper les lames de verre dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 minutes 5 fois.
   5. Faire tremper les glissières de verre en PBS pendant 10 min.
   6. Monter 20 μL d'IgG anti-rat marqué à la phosphatase alcaline (0,5% (v / v)) dans du PBS contenant du Triton X-100 à 0,2% (v / v) et du sérum de porc entier entier à 5% (v / v) sur les cellules dans la pièce Température pendant 1 h.
   7. Faire tremper les lames de verre dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 minutes 5 fois.
   8. Faire tremper les lames de verre dans un tampon contenant 100 mM de Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM de NaCl et 50 mM de _MgCl2 pendant 10 minutes.
   9. Solution de substrat de phosphate de Mount contenant 0,23 mg / ml de 5-bromo-4chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP), 0,35 mg / mL nitro bleu de tétrazolium (NBT), Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, 100 mM de NaCl et 50 mM de MgCl ₂ sur les cellules.
   10. Observez les cellules sous un microscope pour une coloration appropriée. Lorsque des signaux violets forts apparaissent dans les granules d'hémocytes, éliminer la solution de substrat et tremper les glissières de verre dans un tampon constitué de 10 mM de Tris-HCl, pH 8,5 et 1 mM d'EDTA. On recommande de colorer environ 5 à 10 min.
2. L'immunocoloration avec un anticorps anti-GFP (une autre option pour la coloration des hémocytes)
   1. Tremper en série les lames de verre dans du methanol pendant 10 minutes, PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 min et PBS pendant 10 min.
   2. Monter 20 μL de sérum de porc entier complet à 5% (v / v) dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 sur les cellules pour le blocage. Incuber les lames à température ambiante pendant 20 min.
   3. Retirez la solution sur les lames de verre et montez 20 μL de l'anticorps anti-GFP de souris (1% (v / v)) / PBS cAtteignant 0,2% (v / v) de Triton X-100 sur les cellules. Incuber les glissières à température ambiante pendant une nuit.
   4. Faire tremper les lames de verre dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 minutes 5 fois.
   5. Faire tremper les glissières de verre en PBS pendant 10 min.
   6. Montez 20 μl d'IgG anti-souris marquée par la phosphatase alcaline (0,5% (v / v)) dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 et 5% (v / v) de sérum de porc entier sur les cellules dans la pièce Température pendant 1 h.
   7. Faire tremper les lames de verre dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 minutes 5 fois.
   8. Faire tremper les lames de verre dans un tampon constitué de Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, 100 mM de NaCl et 50 mM de _MgCl2 pendant 10 minutes.
   9. Monter la solution de substrat de phosphatase contenant 0,23 mg / ml de BCIP, 0,35 mg / ml de NBT, Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, 100 mM de NaCl et 50 mM de _MgCl2 sur les cellules.
   10. Observez les cellules sous un microscope pour une coloration appropriée. Lorsque les signaux violets apparaissent dans des hémocytes entiers, enlevez la solution de substrat et trempez les glissières dans un tampon constituéDe Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 et EDTA 1 mM. Il est recommandé de colorer environ 10 à 15 minutes.

5. Tacher les cellules apoptotiques par TUNEL

1. Faire tremper les glissières en verre dans PBS pendant 5 min.
2. Répétez avec un nouveau PBS.
3. Mount Equilibration buffer (Voir la Table des matériaux) sur les cellules pendant 10 min.
4. Retirez la solution des glissières en verre et montez 20 μL de solution TdT contenant 5 μL de désoxynucléotidyl transferase terminale et 15 μL de tampon réactionnel sur les cellules à 37 ° C pendant 1 h.
5. Retirez la solution des glissières de verre et trempez les glissières dans un tampon constitué de 0,5 ml de STOP / tampon de lavage et 17 ml d'eau.
6. Faire tremper les diapositives dans PBS pendant 5 minutes 3 fois.
7. Monter 20 μL de Anti-Digoxigenine-Peroxydase sur les cellules à température ambiante pendant 30 min.
8. Tremper les glissières en verre dans PBS pendant 5 minutes 4 fois.
9. Faire tremper les lames de verre dans une solution de substrat de peroxydase consistant en 30 ml de Tris-HCl 50 mM, contenant pH7,5La micro spatule complète de 3,3'-diaminobenzidine tétrahydro-chlorure (DAB) et 0,002% (v / v) d'H ₂ O ₂ pendant 30 s.
10. Répétez l'étape 5.9 jusqu'à ce que les cellules apoptotiques soient colorées au brun. Tremper les lames de verre dans l'eau pour arrêter la réaction de la peroxydase.
11. Entourez les cellules avec de l'eau pour l'observation.

6. Mesurer le niveau de phagocytose des cellules apoptotiques

1. Observer les échantillons sous microscope optique afin d'évaluer le niveau de phagocytose. Les cellules positives de Count Croquemort ou les cellules positives pour la GFP comme hémocytes, les cellules TUNEL positives comme cellules apoptotiques et les cellules positives doubles comme phococytes des hémocytes.
2. L'indice phagocytaire est défini comme le nombre de cellules double positives pour le nombre total de cellules positives à Croquemort ou de cellules GFP positives. Il est recommandé d'observer plus de 300 hémocytes.

Résultats

Afin d'examiner la phagocytose des cellules apoptotiques, les embryons de Drosophila du stade de développement 16 ont été recueillis et préparés sous forme de cellules dispersées. Les hémocytes, les macrophages de Drosophila , ont été colorés par immunocytochimie pour le marqueur hémocytaire "Croquemort" ^{17 , 22 en} utilisant un anticorps spécifique ^{19 ,}

Discussion

Nous avons décrit ici un test de phagocytose en utilisant des embryons de Drosophila . En utilisant des cellules embryonnaires dispersées pour mesurer quantitativement la phagocytose, les hémocytes, les phagocytes professionnels de Drosophila , sont immunostained pour le marqueur de l'hémocyte Croquemort ou le GFP axé sur la MA , et les cellules apoptotiques sont détectées par TUNEL dans ce protocole. Le niveau de phagocytose est exprimé sous forme d'indice phagocytaire e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
whole swine serum	MP Biomedicals	55993	For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL	TreffLab	96. 4625. 9. 01	For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL	TreffLab	96. 7339. 9. 03	For  homogenization
Collagenase	Sigma-Aldrich	C-0130	For preparation of embryonic cells
Trypsin	Thermo Fisher SCIENTIFIC	27250-018	For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPL	475-1612	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate	Roche	11383221001	BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium	Roche	11383213001	NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody			described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1)	Roche	11814460001	For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate	Bio-Rad	170-6520	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit	Millipore	S7100	For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride	nacalai tesque	11009-41	DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name	Stock center	Stock ID	Comments
w1118			Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5			drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2			Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP			described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR	VDRC	4833	-
UAS-Itgbn-IR	NIG-fly	1762R-1	-