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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier einen Phagozytose-Assay unter Verwendung der dispergierten embryonalen Zellen von Drosophila . Es ermöglicht uns, in vivo Phagozytose Ebenen einfach und präzise zu quantifizieren und neue Moleküle zu identifizieren, die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erforderlich sind.

Zusammenfassung

Die molekularen Mechanismen, die der Phagozytose von apoptotischen Zellen zugrunde liegen, müssen aufgrund ihrer Rolle bei immunen und entzündlichen, nicht beherrschbaren Krankheiten genauer aufgeklärt werden. Wir haben hier eine experimentelle Methode entwickelt, um die Phagozytose quantitativ unter Verwendung der Fruchtfliege Drosophila zu untersuchen , bei der das Gennetz, das die Verschlingungsreaktionen kontrolliert, evolutionär von Säugetieren konserviert wird. Um die Phagozyten mit ganzen Tieren genau zu erfassen und zu zerlegen, wurden Drosophila- Embryos homogenisiert, um dispergierte Zellen einschließlich Phagozyten und apoptotischen Zellen zu erhalten. Die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen ermöglicht es uns, in vivo Phagozytose Ebenen zu messen, als ob wir einen in vitro Phagozytose-Assay durchgeführt haben, in dem es möglich ist, alle Phagozyten und apoptotischen Zellen in ganzen Embryonen zu beobachten und genau das Niveau der Phagozytose zu quantifizieren. Wir bestätigten, dass diese Methode die früheren Studien wiedergibtDie die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen benötigten Gene identifizierten. Diese Methode erlaubt es, die Verschlüsselung von toten Zellen zu analysieren und in Kombination mit der mächtigen Genetik von Drosophila die komplexen phagozytischen Reaktionen aufzudecken, die die Migration, die Erkennung, die Verschlußung und den Abbau von apoptotischen Zellen durch Phagozyten umfassen.

Einleitung

In Metazoan-Tieren, z. B. die Nematoden Caenorhabditis elegans , die Fruchtfliege Drosophila melanogaster und Mäuse und Menschen, eine große Anzahl von Zellen unterziehen Apoptose während der Entwicklung, um ihre Körper und im Erwachsenenalter zu pflegen Homöostase 1 , 2 . Apoptotische Zellen müssen schnell entfernt werden, weil sie eine Entzündung in den umliegenden Geweben durch Freisetzung von immunogenen intrazellulären Materialien induzieren, wenn sie nicht vollständig entfernt werden 3 . Um die schnelle Entfernung zu erleichtern, stellen apoptotische Zellen so genannte eat-me-Signale dar, die von den Engulfierungsrezeptoren von Phagozyten erkannt werden und durch Phagozytose 3 , 4 , 5 , 6 eliminiert werden. So spielt die Phagozytose eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Wirtshomöostase und damit der Aufklärung des Moleküls Die der Phagozytose von apoptotischen Zellen zugrunde liegen, ist von Bedeutung.

Die Mechanismen , die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erscheinen evolutionär zwischen den Arten in den Nematoden, Fliegen und Mäuse 7 konserviert werden. Mehrere Phagozytose-Assays sind derzeit verfügbar, um die Verschlußung von apoptotischen Zellen in diesen Modelltieren zu beurteilen. In C. elegans werden 131 somatische Zellen während der Entwicklung einem programmierten Zelltod unterzogen, und Zellkerzen werden durch benachbarte Zellen phagozytiert, die nicht professionelle Phagozyten sind 8 . So zeigt das Zählen der Anzahl der verbleibenden Zellleichen in C. elegans den Grad der Phagozytose in vivo an . Durch die Suche nach Nematoden-Mutanten, die eine erhöhte Anzahl von toten Zellen zeigen, wurden mehrere für die Phagozytose benötigte Gene identifiziert und genetisch charakterisiert 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .

Ex-vivo- Phagozytose-Assays mit Primärkultur-Phagozyten, im allgemeinen Makrophagen, werden häufig bei Mäusen verwendet. Apoptotische Zellen werden unter Verwendung von Zelllinien wie Jurkat-Zellen hergestellt und mit primären Phagozyten vermischt. Nach einer Inkubation für mehrere Stunden werden die Gesamtzahl der Phagozyten und Verschlingungsphagozyten gezählt, um den Grad der Phagozytose zu bestimmen. Als eine ausgeklügelte Modifikation dieser Methode entwickelte die Nagata-Gruppe einen Ex-vivo- Phagozytose-Assay mit Zellen, die ein Caspase-resistentes ICAD (Inhibitor von Caspase-aktivierter DNase) exprimieren, bei dem apoptotische Zellen keine apoptotische DNA-Fragmentierung erfahren, aber die DNA wird immer noch gespalten Zellen sind phagozytiert. Wenn diese Zellen als apoptotische Targets in einem Phagozytose-Assay verwendet werden, wird nur die DNA von verschlungenen apoptotischen Zellen fragmentiert und durch TdT-vermittelte DUTP-Nick-Etikettierung (TUNEL) gefärbt. Also die leveL des apoptotischen Zellverschlusses wird durch Zählen von TUNEL-Signalen in einer Mischung von Phagozyten und apoptotischen Zellen gemessen 13 .

In D. melanogaster sind professionelle Phagozyten namens Hämocyten, Drosophila Makrophagen, verantwortlich für die Phagozytose von apoptotischen Zellen 14 , 15 . Zusätzlich zu in vitro Phagozytose-Assays mit Kulturzelllinien sind in vivo Phagozytose-Assays mit ganzen Drosophila- Embryonen verfügbar. Drosophila- Embryos sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Niveau der apoptotischen Zellverschlüsselung zu untersuchen, da viele Zellen einer Apoptose unterliegen und durch die Hämocyten während der embryonalen Entwicklung phagozytiert werden 14 , 15 , 16 . Ein Beispiel für einen in vivo Phagozytose-Assay ist die Methode, die von der Gruppe des Franc entwickelt wurde. In ihrer Methode sind die Hämocyten deDurch die Immunfärbung von Peroxidasin, einem Hämozytenmarker, werden die apoptotischen Zellen unter Verwendung des Kernfarbstoffs 7-Aminoaktinomycin D in ganzen Drosophila- Embryonen gefärbt, und die Anzahl der doppelten positiven Zellen wird als ein Signal der Phagozytose 17 gezählt . Ein weiteres Beispiel für einen Phagozytose-Assay auf Embryonen basiert auf dem oben beschriebenen Konzept der Nagata-Methode; In vivo wird jedoch die Phagozytose unter Verwendung der Embryonen von dCAD ( Drosophila caspase-aktivierten DNase) Mutantenfliegen 18 , 19 ausgewertet. Diese in vivo Phagozytose-Assays sind nützlich für die direkte Beobachtung der Phagozytose in situ . Allerdings sind Schwierigkeiten mit dem Ausschluss irgendeiner möglichen Vorspannung in dem Schritt des Zählens von Phagozytosierungszellen verbunden, da es schwierig ist, alle Phagozyten und apoptotischen Zellen in ganzen Embryonen aufgrund ihrer Dicke zu beobachten.

Um diese Einschränkung zu überwinden, entwickeln wirEinen neuen Phagozytose-Assay in Drosophila- Embryonen. In unserer Methode, um leicht phagozytierende Hämocyten zu zählen, werden ganze Embryos homogenisiert, um dispergierte embryonale Zellen herzustellen. Phagozyten werden durch die Immunfärbung eines Phagozytenmarkers nachgewiesen und apoptotische Zellen werden von TUNEL mit diesen dispergierten embryonalen Zellen nachgewiesen. Die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen ermöglicht es uns, in vivo Phagozytose Ebenen zu messen, als ob wir einen in vitro Phagozytose-Assay, dass genau quantifiziert das Niveau der Phagozytose durchgeführt. Alle Genotypen von Fliegen können in diesem Assay angewendet werden, wenn sie sich auf Stufe 16 der Embryos 20 entwickeln , die Entwicklungsstufe, bei der die apoptotische Zellabtrennung durch Phagozytose am häufigsten ist. Diese Methode hat den Vorteil, den Grad der Phagozytose quantitativ zu beurteilen und kann somit zur Identifizierung neuer Moleküle beitragen, die an der Phagozytose von apoptotischen Zellen in vivo beteiligt sind .

Protokoll

1. Vorbereitung

  1. Vorbereitung von frischen Traubensaft-Agarplatten
    1. 100 ml Wasser zu 4,4 g Agar geben und die Mischung in einem Mikrowellenofen erhitzen, um Agar aufzulösen.
    2. Füge 80 ml frischen Traubensaft, 5 ml Essigsäure und 5 ml Ethanol zu Agar-Lösung hinzu.
    3. Gießen Sie ca. 1,5 mL der Lösung mit einer Pipette auf jede Glasrutsche und lassen Sie sie verfestigen.
  2. Vorbereitung von 6 cm Schalen-Agarose-Platten
    1. Füge 50 ml Wasser zu 0,5 g Agarose hinzu und erhitze die Mischung in einem Mikrowellenofen, um Agarose aufzulösen.
    2. Gießen Sie ca. 2,5 ml Agarose-Lösung auf eine 6 cm Schale mit einer Pipette.

2. Stage 16 Embryo-Sammlung

  1. Sammeln Sie erwachsene Fliegen und fügen Sie 200 Frauen und 200 Männer in eine 50 ml konische Röhre.
  2. Setzen Sie einen Teller mit frischem Traubensaft-Agar auf Hefe in die 50-ml-Röhre und schließen Sie mit einem Schwamm caP.
  3. Inkubieren Sie die Fliegen bei 16 ° C im Licht für 2 - 3 Tage. Ändern Sie die Platte einmal pro Tag.
  4. Die Fliegen bei 25 ° C für 1 h zur Dunkelheit bringen.
  5. Ändern Sie die alte Platte zu einem neuen ohne Hefe. Lassen Sie Fliegen Eier für 2 Stunden legen.
  6. Sammeln Sie die Platte und inkubieren bei 16 ° C für 26 h.
  7. Sammle Embryos aus der Platte mit einem Pinsel in 1 ml PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100.
  8. Waschen Sie Embryos zweimal mit 1 ml PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100.
  9. Um das Chorion zu entfernen, füge 1,2 mL Natriumhypochloritlösung (2,2 - 3,4% Cl) zu Embryonen für 3 min hinzu.
  10. Waschen Sie Embryos 4 mal mit 1 ml PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100.
  11. Legen Sie Embryonen auf 6-cm-Schalen-Agarose-Platten. Hebe die Embryonen der Stufe 16 unter einem Mikroskop auf, wie von Roberts 20 beschrieben . Sammle etwa 50 Embryos in einem 1,5-mL Treff Mikro-Reagenzglas mit einer Mikropipette.

3. PrepaRation von embryonalen Zellen

  1. Waschen Sie Embryos zweimal mit 150 μl PBS.
  2. Homogenisieren Sie Embryos 30 Mal in einem 1,5 mL Mikro-Teströhrchen und Pellet-Mischer in Gegenwart von 200 & mgr; l Collagenase (0,25% (w / v)) in PBS.
  3. Embryonale Zellen durch 10-minütiges Pipettieren dispergieren und die Zellsuspension auf ein 1,5 mL-Röhrchen bewegen. Inkubieren von Zellen bei 37 ° C für 1 min in einem Wasserbad. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
  4. Füge 800 μl PBS zur Zellsuspension hinzu und zentrifugiere bei 1400 x g bei 4 ° C für 5 min.
  5. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 200 μl Trypsin (0,25% (w / v)) in PBS zu den Zellen hinzu. Embryonale Zellen durch mehrmaliges Pipettieren empergieren.
  6. Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einem 70 μm Zell-Sieb.
  7. Um die Trypsin-Aktivität zu stoppen, füge 40 μl hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum zu der filtrierten Zellsuspension hinzu. Füge 800 μl PBS zu und zentrifugiere bei 1.400 x g bei 4 ° C für 5 min.
  8. Entfernen Sie die Supernatant, suspendieren für 5 min - Zellen in 200 ul PBS und Zentrifugation bei 1400 x g bei 4 ° C ausgefällt.
  9. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie ausgefällte Zellen in 30 μl PBS.
  10. Montieren Sie die vorbereitete Zellsuspension auf Aminopropyltriethoxysilan-beschichteten Glasscheiben und warten Sie 10 - 15 min, bis die Zellen an den Glasscheiben anhaften.
  11. Entfernen Sie die restliche Lösung auf den Glasscheiben mit einer Pipette. Montieren Sie 60 - 70 μl PBS mit 4% (w / v) PFA (Paraformaldehyd) auf Zellen für 10 - 15 min zur Fixierung.
  12. Entfernen Sie die Fixierlösung und legen Sie Glasscheiben in PBS für mehr als 1 min.

4. Färbung von Hämozyten

  1. Immunfärbung mit einem Anti-Croquemort-Antikörper
    1. Die Glasscheiben in 10 Minuten in Methanol gießen, in PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min und dann in PBS für 10 min.
    2. 20 μl 5% (v / v) vollständiges Schweine-Serum in PBS enthaltenNg 0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen zum Blockieren. Inkubieren von Objektträgern bei Raumtemperatur für 20 min.
    3. Entfernen Sie die Lösung aus Glasscheiben und montieren Sie 20 μl Anti-Croquemort-Antiserum 19 , 21 (0,1% (v / v)) in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen. Inkubieren Sie die Objektträger bei 4 ° C über Nacht.
    4. Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen.
    5. Glasscheiben in PBS für 10 min einweichen.
    6. Mischen Sie 20 μl alkalisches Phosphatase-markiertes Anti-Ratten-IgG (0,5% (v / v)) in PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 und 5% (v / v) ganzes Schweine-Serum auf Zellen im Raum Temperatur für 1 Stunde.
    7. Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen.
    8. Einweichen von Glasrutschen in Puffer, enthaltend 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 für 10 min.
    9. Mount-Phosphatase-Substratlösung, enthaltend 0,23 mg / ml 5-Brom-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP), 0,35 mg / ml Nitroblau-Tetrazolium (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 auf Zellen.
    10. Beobachten Sie Zellen unter einem Mikroskop für die richtige Färbung. Wenn starke lila Signale in den Granulaten der Hämocyten auftreten, entfernen Sie die Substratlösung und tränken Glasscheiben in Puffer, bestehend aus 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 und 1 mM EDTA. Färbung für ca. 5 - 10 min wird empfohlen.
  2. Immunfärbung mit einem Anti-GFP-Antikörper (eine weitere Option zur Färbung von Hämocyten)
    1. Manche Glasscheiben in Methanol für 10 min einwirken lassen, PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min und PBS für 10 min.
    2. 20 μl von 5% (v / v) Gesamtschweine-Serum in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen zum Blockieren auftragen. Inkubieren von Objektträgern bei Raumtemperatur für 20 min.
    3. Entfernen Sie die Lösung auf Glasplättchen und montieren Sie 20 μl des Maus-Anti-GFP-Antikörpers (1% (v / v)) / PBS c0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen zu erhalten. Inkubieren von Objektträgern bei Raumtemperatur über Nacht.
    4. Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen.
    5. Glasscheiben in PBS für 10 min einweichen.
    6. 20 μl alkalisches Phosphatase-markiertes Anti-Maus-IgG (0,5% (v / v)) in PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 und 5% (v / v) Gesamt-Schweine-Serum auf Zellen im Raum Temperatur für 1 Stunde.
    7. Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen.
    8. Einweichen von Glasrutschen in Puffer bestehend aus 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 für 10 min.
    9. Montieren Sie die Phosphatase-Substratlösung, die 0,23 mg / ml BCIP, 0,35 mg / ml NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 enthält.
    10. Beobachten Sie Zellen unter einem Mikroskop für die richtige Färbung. Wenn lila Signale in ganzen Hämocyten auftreten, entfernen Sie die Substratlösung und tränken Sie Folien in Puffer, bestehend ausVon 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 und 1 mM EDTA. Die Färbung für ca. 10 - 15 min wird empfohlen.

5. Fleck apoptotische Zellen von TUNEL

  1. Glasscheiben in PBS für 5 min einweichen.
  2. Wiederholen Sie mit neuem PBS.
  3. Mount Equilibration Puffer (siehe Material Tabelle) auf Zellen für 10 min.
  4. Entfernen Sie die Lösung aus Glasplättchen und montieren Sie 20 & mgr; l TdT-Lösung, die 5 & mgr; l endständige Deoxynukleotidyltransferase und 15 & mgr; l Reaktionspuffer auf Zellen bei 37 ° C für 1 h enthält.
  5. Die Lösung aus den Glasscheiben entfernen und die Objektträger in Puffer aus 0,5 ml STOP / Waschpuffer und 17 ml Wasser einweichen.
  6. Läuft in PBS für 5 min 3 mal ein.
  7. 20 μl Anti-Digoxigenin-Peroxidase auf Zellen bei Raumtemperatur für 30 min auftragen.
  8. Glasscheiben in PBS für 5 min 4 mal einweichen.
  9. Einweichen von Glasscheiben in Peroxidase-Substratlösung, bestehend aus 30 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 enthaltendGa vollständiger Mikrospatel aus 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrichlorid (DAB) und 0,002% (v / v) H 2 O 2 für 30 s.
  10. Wiederholen Sie Schritt 5.9, bis apoptotische Zellen braun gefärbt sind. Einweichen Glas gleitet in Wasser, um die Peroxidase-Reaktion zu stoppen.
  11. Enthält Zellen mit Wasser zur Beobachtung.

6. Messen Sie den Grad der Phagozytose von apoptotischen Zellen

  1. Beobachten Sie Proben unter einem Lichtmikroskop, um das Niveau der Phagozytose zu beurteilen. Graf Croquemort-positive Zellen oder GFP-positive Zellen als Hämocyten, TUNEL-positive Zellen als apoptotische Zellen und doppelte positive Zellen als phagozytierende Hämocyten.
  2. Der phagozytische Index ist definiert als die Anzahl der doppelten positiven Zellen zur Gesamtzahl der Croquemort-positiven Zellen oder GFP-positiven Zellen. Es wird empfohlen, dass mehr als 300 Hämocyten beobachtet werden.

Ergebnisse

Um die Phagozytose von apoptotischen Zellen zu untersuchen, wurden Drosophila- Embryos der Entwicklungsstufe 16 gesammelt und als dispergierte Zellen hergestellt. Hemocyten, Drosophila- Makrophagen wurden durch Immunzytochemie für den Hämocytenmarker "Croquemort" 17 , 22 unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers 19 , 21 gefärbt und ap...

Diskussion

Wir haben hierin einen Phagozytose-Assay unter Verwendung von Drosophila- Embryonen beschrieben. Durch die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen zur quantitativen Messung der Phagozytose werden Hämocyten, Drosophila- Profi-Phagozyten für den Hämocytenmarker Croquemort oder srpHemo- getriebenen GFP immunostainiert und apoptotische Zellen werden von TUNEL in diesem Protokoll nachgewiesen. Der Grad der Phagozytose wird als phagozytischer Index ausgedrückt, indem die G...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken Kaz Nagaosa und Akiko Shiratsuchi für ihren Rat.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
whole swine serumMP Biomedicals55993For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mLTreffLab96. 4625. 9. 01For  homogenization
pellet mixer  1.5 mLTreffLab96. 7339. 9. 03For  homogenization
CollagenaseSigma-AldrichC-0130For preparation of embryonic cells
TrypsinThermo Fisher SCIENTIFIC27250-018For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, APKPL475-1612secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate		Roche11383221001BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazoliumRoche11383213001NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibodydescribed previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 		Roche11814460001For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP ConjugateBio-Rad170-6520secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection KitMilliporeS7100For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride		nacalai tesque11009-41DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
NameStock centerStock IDComments
w1118Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFPdescribed in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IRVDRC4833-
UAS-Itgbn-IRNIG-fly1762R-1-

Referenzen

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