Analisi della fagocitosi per le cellule apoptotiche in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Riepilogo

Qui descriviamo un test di fagocitosi usando le cellule embrionali disperse di Drosophila . Ci permette di quantificare con facilità e precisione i livelli di fagocitosi in vivo e di identificare nuove molecole necessarie per la fagocitosi delle cellule apoptotiche.

Abstract

I meccanismi molecolari alla base della fagocitosi delle cellule apoptotici devono essere chiariti in modo più dettagliato a causa del suo ruolo in malattie intractable e immunitarie e infiammatorie. Noi qui abbiamo sviluppato un metodo sperimentale per studiare la fagocitosi in modo quantitativo utilizzando la mosca Drosophila di frutta, in cui la rete genica che controlla le reazioni di engulfment è evolutamente conservata dai mammiferi. Al fine di rilevare e contare con precisione i fagociti inghiottiti e inattivi con animali interi, gli embrioni di Drosophila sono stati omogeneizzati per ottenere le cellule disperse, compresi i fagociti e le cellule apoptotiche. L'uso di cellule embrionali disperse ci permette di misurare i livelli di fagocitosi in vivo come se avessimo eseguito un test di fagocitosi in vitro in cui è possibile osservare tutti i fagociti e le cellule apoptotiche in embrioni interi e precisamente quantificare il livello di fagocitosi. Abbiamo confermato che questo metodo riproduce quelli di studi precedentiChe ha identificato i geni richiesti per la fagocitosi delle cellule apoptotiche. Questo metodo permette di analizzare l'engulfment di cellule morte e, in combinazione con la potente genetica di Drosophila , rivelerà le complesse reazioni fagocitiche che comprendono la migrazione, il riconoscimento, l'engulfment e il degrado delle cellule apoptotiche mediante fagociti.

Introduzione

Negli animali metazoi, ad es. Il nematode Caenorhabditis elegans , la mosca di frutta Drosophila melanogaster , e topi e umani, un gran numero di cellule subiscono apoptosi durante lo sviluppo per modellare i loro corpi e in età adulta per mantenere l'omeostasi ^{1 , 2} . Le cellule apoptotiche devono essere rapidamente rimosse perché inducono l'infiammazione nei tessuti circostanti liberando materiali intracellulari immunogenici se non completamente rimossi ³ . Al fine di facilitare la rimozione rapida, le cellule apoptotiche presentano i cosiddetti segnali alimentari riconosciuti dai recettori di engagement dei fagociti e vengono eliminati dalla fagocitosi ^{3 , 4 , 5 , 6} . Pertanto, la fagocitosi svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi ospite e, dunque, illustra la molecola Lar meccanismi alla base della fagocitosi delle cellule apoptotiche è di importanza.

I meccanismi responsabili della fagocitosi delle cellule apoptotici sembrano evoluzionalmente conservati tra le specie nei nematodi, mosche e topi ⁷ . Attualmente sono disponibili diversi dosaggi di fagocitosi per valutare l'ingrasso di cellule apoptotiche in questi animali modello. In C. elegans , 131 cellule somatiche subiscono una morte cellulare programmata durante lo sviluppo, ei cadaveri cellulari sono fagocitati dalle cellule vicine, che sono fagociti non professionali ⁸ . Quindi, contando il numero di restanti cellule di cellule in C. elegans indica il livello di fagocitosi in vivo . Cercando mutanti di nematodi che mostrano un numero crescente di cellule morte, sono stati identificati diversi geni richiesti per la fagocitosi e caratterizzati geneticamente da ^{9 , 10 ,}S = "xref"> 11 ^{, 12} .

I campioni di fagocitosi ex vivo con fagociti di coltura primaria, generalmente macrofagi, vengono spesso utilizzati nei topi. Le cellule apoptotiche vengono preparate utilizzando linee cellulari come le cellule Jurkat e sono mescolate con fagociti primari. Dopo un'incubazione per diverse ore, il numero totale di fagociti e fagociti inghiottiti vengono contati per valutare il livello della fagocitosi. Come una sofisticata modifica di questo metodo, il gruppo di Nagata ha sviluppato un test di fagocitosi ex vivo con le cellule che esprimono un ICAD resistente alla caspasi (inibitore della DNasi attivata da caspasi), in cui le cellule apoptotiche non subiscono la frammentazione del DNA apoptotica, ma il DNA è ancora ceduto quando Le cellule sono fagocitose. Quando queste cellule vengono utilizzate come obiettivi apoptotici in un dosaggio di fagocitosi, solo il DNA delle cellule apoptotiche inghiottite viene frammentato e macchiato mediante etichettatura TUTT-mediata di dUTP (TUNEL). Pertanto, la levaL di ingrasso cellulare apoptotico è misurato contando i segnali TUNEL in una miscela di fagociti e di cellule apoptotiche ¹³ .

In D. melanogaster , fagociti professionali chiamati emociti, macrofagi Drosophila , sono responsabili della fagocitosi delle cellule apoptotiche ^{14 , 15} . Oltre ai dosaggi di fagocitosi in vitro con linee di cellule di coltura, sono disponibili test di fagocitosi in vivo con tutti gli embrioni Drosophila . Gli embrioni di Drosophila sono un potente strumento per esaminare il livello di induzione di cellule apoptotiche perché molte cellule subiscono l'apoptosi e sono fagocitate da emociti durante lo sviluppo embrionale ^{14 , 15 , 16} . Un esempio di un test di fagocitosi in vivo è il metodo sviluppato dal gruppo di Franc. Nel loro metodo, gli emociti sono deTossicodipendente perossidasina, un marker emocitico, le cellule apoptotiche vengono colorate utilizzando il colorante nucleare, 7-amino actinomicina D negli embrioni interi Drosophila e il numero di cellule doppie positive viene contato come segnale di fagocitosi ¹⁷ . Un altro esempio di un test di fagocitosi sugli embrioni si basa sul concetto del metodo di Nagata descritto in precedenza; tuttavia, fagocitosi in vivo è valutata utilizzando gli embrioni di DCAD (Drosophila caspasi-attivato DNasi) mutante vola ^{18, 19.} Questi test di fagocitosi in vivo sono utili per osservare direttamente la fagocitosi in situ . Tuttavia, le difficoltà sono associate ad escludere ogni possibile polarizzazione nella fase di conteggio delle cellule fagocitose perché è difficile osservare tutti i fagociti e le cellule apoptotiche in embrioni interi a causa dello spessore.

Al fine di superare questa limitazione, ci sviluppiamoEd un nuovo dosaggio di fagocitosi negli embrioni di Drosophila . Nel nostro metodo, per poter facilmente contare gli emociti fagocitosi, tutti gli embrioni vengono omogeneizzati per preparare cellule embrionali disperse. I fagociti sono rilevati mediante l'immunostaining di un marker di fagocita e le cellule apoptotiche sono rilevate da TUNEL con queste cellule embrionali disperse. L'uso di cellule embrionali disperse ci permette di misurare i livelli di fagocitosi in vivo come se abbiamo effettuato un test di fagocitosi in vitro che precisamente quantifica il livello della fagocitosi. Tutti i genotipi di mosche possono essere impiegati in questo saggio se si sviluppano allo stadio 16 degli embrioni ²⁰ , lo stadio di sviluppo in cui la clearance delle cellule apoptotiche mediante la fagocitosi è la più abbondante. Questo metodo ha il vantaggio di valutare quantitativamente il livello della fagocitosi e, quindi, può contribuire all'identificazione di nuove molecole coinvolte nella fagocitosi delle cellule apoptotiche in vivo .

Protocollo

1. Preparazione

1. Preparazione di piatti di agar freschi di uva
   1. Aggiungere 100 ml di acqua a 4,4 g di agar e riscaldare la miscela in un forno a microonde per sciogliere l'agar.
   2. Aggiungere 80 ml di succo fresco di uva, 5 ml di acido acetico e 5 ml di etanolo alla soluzione agar.
   3. Versare circa 1,5 ml della soluzione con una pipetta su ogni vetretta di vetro e lasciarlo solidificare.
2. Preparazione di piastre da 6 cm di agarosio
   1. Aggiungere 50 ml di acqua a 0,5 g di agarosio e riscaldare la miscela in un forno a microonde per sciogliere l'agarosio.
   2. Versare circa 2,5 ml di soluzione agarosa su un piatto da 6 cm con una pipetta.

2. Stage 16 Embryo Collection

1. Raccogli le mosche adulte e aggiungete 200 femmine e 200 maschi in un tubo conico da 50 mL.
2. Mettere un piatto di agar di succo fresco di uva sul lievito nel tubo da 50 ml e chiudere con una spugna cap.
3. Incubare le mosche a 16 ° C in luce per 2 - 3 giorni. Cambiare la piastra una volta al giorno.
4. Spostare le mosche al buio a 25 ° C per 1 ora.
5. Cambiare la vecchia piastra in un nuovo senza lievito. Consentire alle mosche di gettare le uova per 2 ore.
6. Raccogliere la piastra e incubare a 16 ° C per 26 h.
7. Raccogliere gli embrioni dalla piastra con un pennello in 1 ml di PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100.
8. Lavare due embrioni con 1 ml di PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100.
9. Per rimuovere il corion, aggiungere 1,2 ml di soluzione di ipoclorito di sodio (2,2-3,4% Cl) agli embrioni per 3 min.
10. Lavare gli embrioni 4 volte con 1 ml di PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100.
11. Posizionare gli embrioni sulle piastre di agarosio da piatto da 6 cm. Prendi gli embrioni di stadio 16 sotto un microscopio come descritto da Roberts ²⁰ . Raccogliere circa 50 embrioni in un tubo da 1,5 ml di test Treff con una micropipetta.

3. PrepaRazione delle cellule embrionali

1. Lavare due embrioni con 150 μl di PBS.
2. Omogeneizzare gli embrioni 30 volte in un tubo di micropiastra da 1,5 mL e mescolatore di pellet in presenza di 200 μl di collagenasi (0,25% (w / v)) in PBS.
3. Disperse le cellule embrionali pipettando 10 volte e spostare la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 mL. Incubare le cellule a 37 ° C per 1 min in un bagno d'acqua. Ripetere due volte questo passaggio.
4. Aggiungere 800 μl di PBS alla sospensione cellulare e centrifugare a 1400 x g a 4 ° C per 5 min.
5. Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 μL di tripsina (0,25% (w / v)) in PBS alle cellule. Disperse le cellule embrionali pipettando 50 volte.
6. Filtrare la sospensione cellulare con un filtro cellulare da 70 μm.
7. Per interrompere l'attività della tripsina, aggiungere alla sospensione cellulare delle cellule filtrate 40 μL di siero fetale bovato inattivato. Aggiungere 800 μl di PBS e centrifugare a 1.400 x g a 4 ° C per 5 min.
8. Rimuova la supernataNt, sospendere le cellule precipitate in 200 μl di PBS e centrifugare a 1400 x g a 4 ° C per 5 min.
9. Rimuovere il surnatante e sospendere le cellule precipitate in 30 μl di PBS.
10. Montare la sospensione cellulare preparata su diapositive in vetro con trietossisilano aminopropilico e aspettare per 10 - 15 minuti fino a quando le cellule si agganciano alle vetrate.
11. Rimuovere la soluzione rimanente sui vetrini di vetro con una pipetta. Montare 60 - 70 μL di PBS contenente 4% (w / v) PFA (paraformaldeide) sulle cellule per 10-15 minuti per la fissazione.
12. Rimuovere la soluzione di fissazione e posizionare le diapositive di vetro in PBS per più di 1 minuto.

4. La colorazione degli emociti

1. Immunostaining con un anticorpo anti-Croquemort
   1. Tamponi vetrari in metallo per 10 minuti in 10 minuti, in PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100 per 10 minuti e poi in PBS per 10 minuti.
   2. Montare 20 μl di 5% (v / v) del siero di suini integrale contenuto in PBSNg 0,2% (v / v) Triton X-100 sulle cellule per il blocco. Incubare le diapositive a temperatura ambiente per 20 min.
   3. Rimuovere la soluzione da vetrate e montare 20 μl di antiserum anti-Croquemort ^{19 , 21} (0,1% (v / v) in PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100 sulle cellule. Incubare le diapositive a 4 ° C per una notte.
   4. Immergere le diapositive in vetro in PBS contenenti 0,2% (v / v) Triton X-100 per 10 min 5 volte.
   5. Far scorrere le vetrate di vetro in PBS per 10 min.
   6. Montare 20 μL di IgG anti-rat (0,5% (v / v)) con PST contenente 0,2% (v / v) Triton X-100 e 5% (v / v) Temperatura per 1 h.
   7. Immergere le diapositive in vetro in PBS contenenti 0,2% (v / v) Triton X-100 per 10 min 5 volte.
   8. Immergere vetrini in tampone contenente 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl e 50 mM MgCl ₂ per 10 min.
   9. Montare la soluzione di substrato di fosfatasi contenente 0,23 mg / ml di 5-bromo-4cloro-3-indolil fosfato (BCIP), 0,35 mg / mL nitro blu tetrazolio (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl ₂ sulle cellule.
   10. Osservare le cellule sotto un microscopio per una corretta colorazione. Quando i segnali violetti viola appaiono nei granuli degli emociti, rimuovere la soluzione di substrato e far scorrere le diapositive di vetro in tampone costituito da 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 e 1 mM EDTA. Si consiglia di colorare per circa 5-10 minuti.
2. Immunostaining con un anticorpo anti-GFP (un'altra opzione per la colorazione degli emociti)
   1. Tamponi vetrini in metallo per 10 min, PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100 per 10 minuti e PBS per 10 minuti.
   2. Montare 20 μl di siero di suini integrale del 5% (v / v) in PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100 sulle cellule per il bloccaggio. Incubare le diapositive a temperatura ambiente per 20 min.
   3. Rimuovere la soluzione sulle vetrini di vetro e montare 20 μL dell'anticorpo anti-GFP del mouse (1% (v / v)) / PBS cCon 0,2% (v / v) di Triton X-100 sulle cellule. Incubare le diapositive a temperatura ambiente durante la notte.
   4. Immergere le diapositive in vetro in PBS contenenti 0,2% (v / v) Triton X-100 per 10 min 5 volte.
   5. Far scorrere le vetrate di vetro in PBS per 10 min.
   6. Montare 20 μL di IgG anti-mouse IgM (0,5% (v / v) eterografato con fosfatasi alcalina in PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100 e 5% (v / v) Temperatura per 1 h.
   7. Immergere le diapositive in vetro in PBS contenenti 0,2% (v / v) Triton X-100 per 10 min 5 volte.
   8. Immergere vetrini in tampone costituito da 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl e 50 mM MgCl ₂ per 10 min.
   9. Montare la soluzione di substrato di fosfatasi contenente 0,23 mg / mL BCIP, 0,35 mg / ml NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl ₂ sulle cellule.
   10. Osservare le cellule sotto un microscopio per una corretta colorazione. Quando i segnali viola appaiono in emociti interi, rimuovere la soluzione del substrato e far scorrere le diapositive in tampone compostoDi 10 mM Tris-HCl, pH8.5 e 1 mM EDTA. Si consiglia di colorare per circa 10-15 minuti.

5. Staccare le cellule apoptotiche di TUNEL

1. Far scorrere le vetrate di vetro in PBS per 5 min.
2. Ripeti con il nuovo PBS.
3. Montare il buffer di equilibrazione (vedere tabella dei materiali) sulle cellule per 10 min.
4. Rimuovere la soluzione dalle vetrate e montare 20 μl di soluzione TdT contenente 5 μL di terminasi deossinucleotidil transferasi e 15 μl di Reaction Buffer sulle cellule a 37 ° C per 1 ora.
5. Rimuovere la soluzione da vetrate e immergere le diapositive in tampone composto da 0,5 mL di STOP / Wash buffer e 17 mL di acqua.
6. Immergere le diapositive in PBS per 5 min 3 volte.
7. Montare 20 μL di Anti-Digoxigenin-Peroxidase sulle cellule a temperatura ambiente per 30 min.
8. Far scorrere le vetrate di vetro in PBS per 5 min 4 volte.
9. Immergere le vetrate in soluzione di substrato perossidasi costituito da 30 mL di 50 mM Tris-HCl, contenente pH7,5Ga completa di spatola di 3,3'-diaminobenzidin-tetraidrichloruro (DAB) e di 0,002% (v / v) H ₂ O ₂ per 30 s.
10. Ripetere il passaggio 5.9 fino a quando le cellule apoptotiche sono colorate marrone. Far scivolare le vetrate in acqua per fermare la reazione della perossidasi.
11. Incollare le cellule con acqua per l'osservazione.

6. Misurare il livello di fagocitosi delle cellule apoptotiche

1. Osservare i campioni sotto un microscopio leggero per valutare il livello della fagocitosi. Contare le cellule positive di Croquemort o le cellule GFP positive come emociti, cellule TUNEL positive come cellule apoptotiche e doppie cellule positive come gli emociti fagocitosi.
2. L'indice fagocitico è definito come il numero di doppie cellule positive al numero totale di cellule Croquemort positive o cellule GFP positive. Si raccomanda di osservare più di 300 emociti.

Risultati

Al fine di esaminare la fagocitosi delle cellule apoptotiche, gli embrioni Drosophila dello stadio di sviluppo sono stati raccolti e preparati come cellule disperse. Gli emociti, i macrofagi Drosophila , sono stati macchiati mediante immunocitochimica per il marcatore emocitario "Croquemort" ^{17 , 22} utilizzando un anticorpo specifico ^{19 , 21} e ...

Discussione

Qui abbiamo descritto un test di fagocitosi usando embrioni di Drosophila . Utilizzando cellule embrionali disperse per misurare la fagocitosi quantitativamente, gli emociti, i fagociti professionali di Drosophila , sono immunociti per il marker Crohnemort o il GHP driven by SrHemo , e le cellule apoptotiche vengono rilevate da TUNEL in questo protocollo. Il livello di fagocitosi è espresso come indice fagocitico contando il numero totale di emociti e fegocitosi emociti. L'...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
whole swine serum	MP Biomedicals	55993	For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL	TreffLab	96. 4625. 9. 01	For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL	TreffLab	96. 7339. 9. 03	For  homogenization
Collagenase	Sigma-Aldrich	C-0130	For preparation of embryonic cells
Trypsin	Thermo Fisher SCIENTIFIC	27250-018	For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPL	475-1612	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate	Roche	11383221001	BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium	Roche	11383213001	NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody			described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1)	Roche	11814460001	For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate	Bio-Rad	170-6520	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit	Millipore	S7100	For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride	nacalai tesque	11009-41	DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name	Stock center	Stock ID	Comments
w1118			Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5			drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2			Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP			described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR	VDRC	4833	-
UAS-Itgbn-IR	NIG-fly	1762R-1	-