에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

요약

우리는 여기에 Drosophila 의 분산 배아 세포를 사용하여 식균 작용 분석을 설명합니다. 그것은 우리가 생체 내 식균 작용 수준을 쉽고 정확하게 정량화 할 수있게하며, 세포 사멸 세포의 식균 작용에 필요한 새로운 분자를 확인합니다.

초록

세포 사멸 세포의 탐식 작용을하는 분자 기작은 면역 및 염증성 난치병에서의 역할 때문에 더 자세하게 밝혀야한다. 우리는 여기에 과일 파리 Drosophila를 사용하여 정량적으로 식균 작용을 조사하는 실험적 방법을 개발했다.이 방법은 삼투 반응을 조절하는 유전자 네트워크가 포유 동물로부터 진화 적으로 보존되어있다. 전체 동물을 사용하여 삼투 및 삼투 식각 세포를 정확하게 검출하고 계산하기 위해 Drosophila 배아를 균질화하여 식균 및 아폽토시스 세포를 포함한 분산 된 세포를 얻었다. 분산 된 배아 세포의 사용은 마치 전체 배아에서 모든 식세포와 세포 사멸 세포를 관찰하고 식균 작용의 수준을 정량화 할 수 있는 시험 관내 식균 작용을 수행하는 것처럼 생체 내 식균 작용 수준을 측정 할 수있게한다. 이 방법이 이전 연구의 결과를 재현한다는 것을 확인했습니다.apoptotic 세포의 phagocytosis에 필요한 유전자를 확인했다. 이 방법은 죽은 세포의 삼투를 분석하고, 강력한 유전학 인 Drosophila 와 결합하면 식세포에 의한 세포 사멸 (apoptotic) 세포의 이동, 인식, 삼투 및 분해로 구성된 복잡한 식균 반응을 나타냅니다.

서문

예를 들어 선충류 Caenorhabditis elegans , 초파리 Drosophila melanogaster 및 생쥐와 인간과 같은 전이 동물의 경우 많은 수의 세포가 발달 중에 체내를 형성하고 성인기에 항상성을 유지하기 위해 세포 사멸을 경험합니다 ^{1 , 2} . 세포 사멸 세포는 완전히 제거되지 않으면 면역 원성 세포 내 물질을 방출하여 주변 조직에 염증을 유도하기 때문에 신속하게 제거해야합니다 ³ . 신속한 제거를 촉진하기 위해 세포 사멸 세포는 식세포의 삼투 수용체에 의해 인식되고 식균 작용에 의해 제거되는 소위 먹기름 신호를 나타냅니다 ^{3 , 4 , 5 , 6} . 따라서, 식균 작용은 숙주 항상성의 유지에 결정적인 역할을하므로, apoptotic 세포의 phagocytosis의 밑에 lar 기계 장치는 중요하다.

세포 사멸 세포의 식균 작용을 담당하는 메커니즘은 진화 적 선충, 초파리, 생쥐 ⁷ 종에 보존 한 것으로 나타났습니다. 여러 가지 식균 작용 분석법이 현재이 모델 동물에서 사멸 세포의 웅덩이를 평가하기 위해 이용 가능하다. C. 엘레 간스 에서 131 체세포는 발달 중에 프로그램 된 세포 사멸을 겪고 세포 시체는 비 전문적인 식세포 ^{8 인} 이웃 세포에 의해 탐식된다. 따라서, C. elegans 의 잔류 세포 시체 수를 세는 것은 생체 내에서 의 식균 작용의 정도를 나타낸다 . 증가 된 사멸 세포 수를 나타내는 선충 돌연변이를 탐색함으로써, 식균 작용에 필요한 여러 유전자가 동정되었고 유전 학적으로 ^{9 , 10 ,}s = "xref"> 11 ^{, 12} .

일차 배양 식세포, 일반적으로 대 식세포를 사용한 생체 외 탐식 작용은 마우스에서 종종 이용된다. 아폽토시스 (apoptotic) 세포는 Jurkat 세포와 같은 세포주를 사용하여 준비되며 1 차 식균과 혼합됩니다. 수 시간 동안 배양 한 후, 식균 작용의 수준을 평가하기 위해 식세포와 삼투 식세포의 총 수를 세었다. 이 방법을 정교하게 변형시킨 Nagata의 연구팀은 apoptotic cell이 apoptotic DNA 단편화를 일으키지 않고 caspase-resistant ICAD (caspase-activated DNase의 억제제)를 발현하는 세포를 이용한 ex vivo 식균 작용 분석을 개발했다. 세포는 식균된다. 이러한 세포가 식균 작용 분석에서 세포 사멸 목표로 사용될 때, 삼투 된 세포 사멸 세포의 DNA 만 단편화되고 TdT 매개 dUTP 닉 엔드 라벨링 (TUNEL)에 의해 염색된다. 따라서,사멸 세포의 말림 (L)는 식세포 사멸 세포 및 ^13의 혼합물 TUNEL 신호를 카운트함으로써 측정된다.

D. melanogaster에서 , hemocytes, Drosophila macrophages라는 전문 식세포가 세포 사멸 세포의 탐식 작용을 담당합니다 ^{14 , 15} . 배양 세포주를 이용한 in vitro phagocytosis assay 에 더하여, 전체 Drosophila 배아를 이용한 in vivo phagocytosis assay가 가능합니다. 초파리 배아는 많은 세포가 사멸을 받아야하고 배아 발달 ^{14, 15, 16시} 혈구에 의해 포식하기 때문에 세포 사멸 세포 말림의 수준을 조사하기위한 강력한 도구입니다. 생체 내 식균 작용의 예는 프랑 그룹이 개발 한 방법입니다. 그들의 방법에서는, hemocytes는이다 deperoxidasin, 혈구 마커의 면역 염색에 의해 tected, 사멸 세포는 핵 염색 전체 초파리 배아 티노 마이신 D (7) 아미노산을 이용하여 염색하고, 이중 양성 세포의 수는 탐식 ^(17)의 신호로 간주된다. 배아에 대한 식균 작용 분석의 또 다른 예는 위에 기술 된 Nagata의 방법의 개념에 기초한다. 그러나, 생체 내 식균 작용은 dCAD ( Drosophila caspase-activated DNase) 돌연변이 파리 ^{18 , 19} 의 배아를 사용하여 평가됩니다. 이러한 in vivo phagocytosis assay는 in situ에서 phagocytosis를 직접 관찰하는데 유용합니다. 그러나, 어려움은 식균 세포를 계수하는 단계에서 가능한 모든 편향을 배제하는 것과 관련이 있는데, 그 이유는 그것의 두께로 인해 전체 배아에서 모든 식세포와 세포 사멸 세포를 관찰하기가 어렵 기 때문이다.

이 한계를 극복하기 위해 우리는Drosophila 배아에서 새로운 식균 작용을 분석했다. 우리의 방법에서는 식균 가능한 혈구를 쉽게 계산하기 위해 전체 배아를 균질화하여 분산 된 배아 세포를 준비한다. 식세포는 식세포 마커의 면역 염색에 의해 검출되며, 아폽토시스 세포는 이들 배아 세포가 분산 된 TUNEL에 의해 검출된다. 분산 된 배아 세포의 사용은 우리가 정확하게 식세포 증의 수준을 정량화하는 시험 관내 식균 작용을 수행하는 것처럼 생체 내 식균 작용 수준을 측정 할 수있게한다. phagocytosis에 의한 세포 사멸 (apoptotic cell clearance)이 가장 많은 발달 단계 인 배아 ^20의 16 단계로 발전하면 파리의 모든 유전형이이 분석에 사용될 수 있습니다. 이 방법은 식균 작용의 양을 정량적으로 평가할 수있는 장점이 있어 생체 내 apoptotic 세포의 식균 작용에 관여하는 새로운 분자의 동정에 기여할 수있다.

프로토콜

1. 준비

1. 신선한 포도 주스 한천 접시 준비
   1. 한천 4.4g에 물 100mL를 넣고 전자 레인지로 가열하여 한천을 녹인다.
   2. 한천 용액에 신선한 포도 주스 80 mL, 아세트산 5 mL 및 에탄올 5 mL를 넣는다.
   3. 각 유리 슬라이드 위에 피펫으로 약 1.5 mL의 용액을 부어 응고시킵니다.
2. 6 cm 접시 아가로 오스 플레이트 준비
   1. 아가로 오스 0.5g에 물 50mL를 넣고 전자 레인지로 혼합물을 가열하여 아가 로스를 녹인다.
   2. 피펫으로 6cm 요리에 약 2.5 ML 아가로 오스 솔루션을 부어.

2. 단계 16 태아 수집

1. 성인 파리를 모으고, 50 mL 원뿔 튜브에 200 명의 암컷과 200 마리의 수컷을 추가하십시오.
2. 효모에 신선한 포도 주스 한천 한 접시를 50 ML 튜브에 넣고 스폰지 CA와 함께 닫습니다피.
3. 2 ~ 3 일 동안 16 ° C에서 파리를 품어줍니다. 접시를 하루에 한 번씩 교체하십시오.
4. 파리를 25 ° C에서 1 시간 동안 어둠으로 이동시킵니다.
5. 오래된 접시를 효모가없는 새 접시로 바꾸십시오. 파리가 2 시간 동안 알을 낳도록하십시오.
6. 플레이트를 수집하고 26 ° C에서 16 ° C로 배양하십시오.
7. 0.2 % (V / V) 트리톤 X - 100을 포함하는 PBS 1 ML에 페인트 브러시로 접시에서 배아를 수집합니다.
8. 0.2 % (브이 / 브이) 트리톤 X - 100을 포함하는 1 ML PBS로 배를 씻으십시오.
9. chorion을 제거하기 위해 차아 ​​염소산 나트륨 용액 (2.2 ~ 3.4 % Cl) 1.2 mL를 3 분간 배양합니다.
10. 0.2 % (브이 / V) 트리톤 X - 100을 포함하는 1 ML PBS로 4 번 배아를 씻으십시오.
11. 6cm 접시 아가로 오스 판에 배아를 놓습니다. 로버트 ^20에 설명 된대로 현미경으로 무대 16 태아를 데리러. micropipette 1.5 ML Treff 마이크로 테스트 튜브에 약 50 개의 배아를 수집합니다.

3. 준비배아 세포의 배급

1. PBS 150 μL로 배아를 두 번 씻으십시오.
2. PBS에 collagenase (0.25 % (w / v)) 200 μL의 존재에 1.5 ML 마이크로 테스트 튜브와 펠렛 믹서에 30 배를 균질.
3. 10 배 pipetting하여 배아 세포를 분산하고, 1.5 ML 튜브에 세포 현탁액을 이동하십시오. 37에서 세포를 품어 ° C. 수 분이 1 분. 이 단계를 두 번 반복하십시오.
4. 세포 현탁액에 PBS 800 μL를 추가하고 1400 X g 에서 원심 분리 4 ° C 5 분.
5. 뜨는을 제거하고 세포에 PBS에서 트립신 (0.25 % (W / V)) 200 μL를 추가합니다. 50 배 pipetting하여 배아 세포를 분산시킵니다.
6. 70 μm Cell Strainer로 세포 현탁액을 여과합니다.
7. 트립신 활동을 중지하려면 여과 된 세포 현탁액에 열 불 활성화 된 태아 소 혈청 40 μL를 첨가합니다. PBS 800 μL를 첨가하고 1,400 x g 에서 4 분간 원심 분리하십시오 (5 분).
8. 슈퍼 맵 삭제PBS 200 μL에 침전 된 세포를 정지시키고 4 ℃에서 1400 x g 에서 5 분간 원심 분리한다.
9. 뜨는을 제거하고 PBS 30 μL에 침전 세포를 일시 중지합니다.
10. 아미노 프로필 triethoxysilane - 코팅 유리 슬라이드에 준비 세포 현탁액을 탑재하고 세포가 유리 슬라이드에 첨부 할 때까지 10-15 분 기다립니다.
11. 피펫으로 유리 슬라이드에 남아있는 솔루션을 제거합니다. PFA (파라 포름 알데히드) 4 % (w / v)를 함유 한 PBS 60 ~ 70 μL를 세포에 고정시킵니다.
12. 고정 솔루션을 제거하고 1 분 이상 동안 PBS에 유리 슬라이드를 놓으십시오.

4. 혈구의 염색

1. 항 Croquemort 항체로 면역 염색
   1. 10 분 동안 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에서 10 분 동안 10 분 동안 메탄올에서 글라스 슬라이드를 적신 다음, 10 분 동안 PBS에서 슬라이드시킨다.
   2. PBS containi에있는 5 % (v / v) 전체 돼지 혈청 20 μL를 넣습니다.블로킹을 위해 0.2 % (v / v) 트리톤 X-100 세포에. 슬라이드를 20 분 동안 실온에서 인큐베이션한다.
   3. 유리 슬라이드에서 솔루션을 제거하고 세포에 0.2 % (V / V) 트리톤 X - 100을 포함하는 PBS에 안티 Croquemort 항혈청 ^{19 , 21} (0.1 % (V / V)) 20 μL를 탑재. 슬라이드를 4 ° C에서 밤새 품어주십시오.
   4. 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에 유리 슬라이드를 10 분간 5 번 담근다.
   5. 유리를 PBS에 10 분 동안 담근다.
   6. 0.2 % (v / v) Triton X-100 및 5 % (v / v) 전체 돼지 혈청을 함유 한 PBS에 알칼라인 포스파타제로 표지 된 항 - 랫트 IgG (0.5 % (v / v) 1 시간 동안 온도.
   7. 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에 유리 슬라이드를 10 분간 5 번 담근다.
   8. 100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM NaCl 및 50mM MgCl ₂ 를 함유하는 완충액에서 10 분 동안 유리 슬라이드를 적시십시오.
   9. 0.23 mg / mL 5- 브로 모 -4를 함유하는 포스 파타 아제 기질 용액(BCIP), 0.35 mg / mL nitro blue tetrazolium (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl 및 50 mM MgCl ₂ 를 세포에 첨가하여 항온 배양 하였다.
   10. 현미경으로 세포를 관찰하여 적절한 얼룩이 있는지 확인하십시오. hemocytes의 과립에 강한 보라색 신호가 나타날 때, 기판 솔루션을 제거하고 10 MM Tris-HCl, 산도 8.5 및 1 MM EDTA로 구성된 버퍼에 유리 슬라이드를 담가. 약 5 ~ 10 분 동안 염색하는 것이 좋습니다.
2. 항 GFP 항체 (hemocytes의 얼룩에 대한 또 다른 옵션)와 Immunostaining
   1. 10 분 동안 0.2 % (v / v) Triton X-100을 함유하는 PBS를 10 분 동안 메탄올에 유리 슬라이드를 적시고, 10 분 동안 PBS를 적신 다음, PBS를 10 분 동안 적시십시오.
   2. 블로킹을 위해 세포에 0.2 % (v / v) Triton X-100을 함유 한 PBS에 5 % (v / v) 전체 돼지 혈청 20 μL를 넣습니다. 슬라이드를 20 분 동안 실온에서 인큐베이션한다.
   3. 유리 슬라이드에서 솔루션을 제거하고, 마우스 anti-GFP 항체 (1 % (브이 /)) / PBS C의 20 μL를 탑재세포에 0.2 % (v / v) Triton X-100을 함유하고있다. 슬라이드를 밤새 상온에서 인큐베이션하십시오.
   4. 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에 유리 슬라이드를 10 분간 5 번 담근다.
   5. 유리를 PBS에 10 분 동안 담근다.
   6. 0.2 % (v / v) Triton X-100 및 5 % (v / v) 전체 돼지 혈청을 함유 한 PBS에 알칼라인 포스파타제 표지 항 마우스 IgG (0.5 % (v / v) 1 시간 동안 온도.
   7. 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에 유리 슬라이드를 10 분간 5 번 담근다.
   8. 100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM NaCl 및 50mM MgCl ₂ 로 이루어진 완충액에서 10 분 동안 유리 슬라이드를 적시십시오.
   9. 0.23 mg / ml BCIP, 0.35 mg / mL NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl 및 50 mM MgCl _2가 함유 된 포스파타제 기질 용액을 세포에 올려 놓습니다.
   10. 현미경으로 세포를 관찰하여 적절한 얼룩이 있는지 확인하십시오. 보라색 신호가 전체 hemocytes에 나타나면, 기판 솔루션을 제거하고 구성된 버퍼에 슬라이드를 담그다10mM 트리스 -HCl, pH8.5 및 1mM EDTA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 인 방법. 약 10 ~ 15 분 동안 염색하는 것이 좋습니다.

5. TUNEL에 의한 세포 사멸 세포의 얼룩

1. 유리를 PBS에 5 분 동안 담근다.
2. 새로운 PBS로 반복하십시오.
3. 10 분 동안 세포에 평형 완충액 (재료 표 참조)을 놓습니다.
4. 유리 슬라이드에서 솔루션을 제거하고, 1 시간 동안 37 ° C에서 세포 5 ML의 터미널 deoxynucleotidyl transferase 및 15 μL의 반응 버퍼를 포함하는 TdT 솔루션 20 μL를 탑재.
5. 유리 슬라이드에서 용액을 제거하고 0.5 ML 중지 / 세척 버퍼와 물 17 ML로 구성된 버퍼에 슬라이드를 담그십시오.
6. 슬라이드를 5 분 동안 PBS에 3 회 담그십시오.
7. 30 분 동안 상온에서 세포에 20 μL의 Anti-Digoxigenin-Peroxidase를 넣는다.
8. 유리를 PBS에 5 분 동안 4 회 담근다.
9. 50mM Tris-HCl, pH7.5 함유 물 30 mL로 이루어진 퍼 옥시다아제 기질 용액에 유리 슬라이드를 담근다.3,3'- diaminobenzidine tetrahydrichloride (DAB) 및 0.002 % (v / v) H ₂ O _2의 전체 마이크로 주걱을 30 초간 처리 하였다.
10. apoptotic 세포가 갈색 얼룩 때까지 단계 5.9를 반복합니다. 유리를 물에 담그면 퍼 옥시다아제 반응이 멈 춥니 다.
11. 관찰을 위해 세포를 물로 둘러 쌉니다.

6. Apoptotic 세포의 Phagocytosis의 수준을 측정

1. phagocytosis의 수준을 평가하기 위해 샘플을 가벼운 현미경으로 관찰하십시오. Croquemort 양성 세포 또는 GFP 양성 세포를 hemocytes로, TUNEL 양성 세포를 세포 사멸 세포로, double positive 세포를 탐식하는 혈구로 계산하십시오.
2. 식균 지수는 Croquemort 양성 세포 또는 GFP 양성 세포의 총 수에 대한 이중 양성 세포의 수로 정의됩니다. 300 개 이상의 hemocytes가 관찰되는 것이 좋습니다.

결과

apoptotic 세포의 식균 작용을 조사하기 위해 발달 단계의 Drosophila 배아를 모아서 분산 세포로 만들었다. Hemocytes, Drosophila macrophages는 특정 항체 ^{19 , 21을} 사용하여 hemocyte 마커 "Croquemort" ^{17 , 22에} 대한 면역 세포 화학 검사로 염색되었으며, apoptotic 세포는 분산 배아 세...

토론

우리는 여기에 Drosophila 배아를 사용하여 식균 작용 분석을 설명했다. 식균 작용을 정량적으로 측정하기 위해 분산 된 배아 세포를 사용함으로써 hemocyte, Drosophila professional phagocytes가 hemocyte marker Croquemort 또는 srpHemo- driven GFP에 대해 면역 염색되고, apoptotic 세포가이 프로토콜에서 TUNEL에 의해 검출됩니다. 식균 작용의 수준은 hemocytes와 phagocytosing hemocytes의 총 수를 세어 phagocy...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
whole swine serum	MP Biomedicals	55993	For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL	TreffLab	96. 4625. 9. 01	For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL	TreffLab	96. 7339. 9. 03	For  homogenization
Collagenase	Sigma-Aldrich	C-0130	For preparation of embryonic cells
Trypsin	Thermo Fisher SCIENTIFIC	27250-018	For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPL	475-1612	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate	Roche	11383221001	BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium	Roche	11383213001	NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody			described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1)	Roche	11814460001	For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate	Bio-Rad	170-6520	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit	Millipore	S7100	For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride	nacalai tesque	11009-41	DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name	Stock center	Stock ID	Comments
w1118			Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5			drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2			Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP			described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR	VDRC	4833	-
UAS-Itgbn-IR	NIG-fly	1762R-1	-