線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

要約

ここで紹介した方法の目的は、線虫モデル有機体の正常な老化中タンパク質凝集を探索することです。プロトコルは、年齢を形成する非常に不溶解性の大きな凝集体を研究し、プロテオステイシスの変化により蛋白質の集合がどのような影響を与えるかを決定するための強力なツールを表します。

要約

最後の十年では、神経変性疾患、アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD) などの有病率は成長しています。これらの加齢に伴う疾患はこれらの患者の頭脳の線維性構造タンパク質凝集体の出現によって特徴付けられます。通常水溶性タンパク質を受けるまさに、集計プロセスは不十分な理解のままになります。蛋白質の集合は病気プロセスに限定されない代わりに、正常な老化プロセスの一部により異所萌出へを使用せずタンパク質凝集を調節する分子・細胞メカニズムの研究発見表現人間疾患関連タンパク質。ここで相補的なアプローチを通じてカエノラブディティス ・ エレガンスにおける固有の蛋白質凝集を調べるための方法論について述べる。まず、高齢の動物を取得する時代同期のc. の elegansの大量に成長する方法について説明、提案する高い不溶性-大きな凝集体を分離する生化学的なプロシージャ。ターゲット遺伝子ノックダウンと組み合わせて、促進またはいずれか包括的な分析を用いた定量的質量分析法によって年齢依存した蛋白質の集合を防ぐことの興味の遺伝子の役割を分析することが可能だか、抗体の候補者ベースの分析。これらの調査結果、集計しやすい蛋白質の蛍光タグを表現するトランスジェニック動物を体内分析によるに確認します。これらのメソッドは、ある特定の蛋白質が加齢とともに集計と最終的にどのようにこれらの蛋白質を完全に機能しやすい理由を明確に役立つはずです。

概要

タンパクは、広告、PD、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、前頭側頭型認知症 (FTD)、および他の多くなどのいくつかの神経変性疾患の認刻極印として認識されます。例えば、運動ニューロンの変性の細胞質集合体を形成する ALS 患者 TDP 43 または FUS ミスフォールドタンパク中の PD 患者の黒質に特にレビー小体として蓄積するアミロイド線維に α シヌクレイン アセンブリ。それぞれのこれらの神経変性疾患、プロテオスタシス蛋白質の恒常性を維持するメカニズムが病気につながるそのため、誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積を防ぐために失敗しました。

通常の条件の下でこれらの調節機構を厳密に制御タンパク質合成、折りたたみ、分解の率および細胞機能を確保するためプロテオステイシスが欠かせません。いくつかの研究は、高齢化、蛋白質の恒常性を維持するために多くの細胞や臓器の機能が徐々 に低下、年齢とプロテオステイシス ネットワークの生理的な老朽化はの重要な悪化要因を示す神経変性疾患 (参照^1,2,3で確認)。タンパク質の品質管理と小胞体ストレス ストレスに対する細胞の反応が年齢に侵害されているという事実は、タンパクが老化の一般的な結果であることを示唆しています。確かに、我々 と他の示されている蛋白質の集合は病に制限されない、その代り、プロテオームの一部なる高い洗剤-不溶性高齢動物^{4,5,6,7 ,8,9,10}。計算とin vivoの解析では、これらの生理学的な年齢関連の集計がいくつかの側面⁵疾患集計を似ているを明らかにしました。内因性、年齢依存した蛋白質の集合の発見は私たちに異所萌出へ表現されたひと疾患関連蛋白質を使用せずタンパク質凝集を調節する分子・細胞メカニズムを解剖する機会を与えます。現時点では、限られた情報のみが存在するは、広範なタンパク質の不溶の規制とこの破綻の生物の健康への影響について。

線虫C. elegansは、老化研究のこれらの動物は比較的短い寿命を持っているし、高い生物にみられる多くの特徴的な高齢化機能を表示、もっとも広範囲に研究のモデル生物の一つです。不溶性タンパク質の加齢の影響線虫病神経変性研究^{11 のフィールドに集計を抽出するために用いられている微分の溶解度に基づく逐次生化学分画によって研究されています。}.定量的質量分析によるいくつかの百のタンパク質は、集計しやすい線虫病⁵の不在になること示されていた。ここで我々 は液体文化と西部のしみによって質量分析法と解析法による定量化のための集約された蛋白質を分離する逐次抽出にワームの大規模な番号を成長するプロトコルの詳細に説明します。高齢者の変性、集計しやすいタンパク質蓄積されていくので他の体細胞組織^5,12,13 c. の elegans生殖腺およびマスク変更蛋白質の分析の焦点に生殖腺のない突然変異体を用いて非生殖ティッシュに不溶。提示方法 0.5 %sds で不溶性と比較的低い遠心速度によって小球形にされた高い不溶性、大きい総計の解析が可能。 にします。またより小さくとより可溶性凝集体を収集するほど厳しくない抽出プロトコルとなっていますまた、¹⁰を他の所で出版しました。さらに、凝集体内線虫の評価に使用する方法をについて説明します。

全体的にみて、RNA 干渉 (RNAi) との組み合わせで、これらのメソッドは、年齢依存した蛋白質の集合を調節することの興味の遺伝子の役割を評価できます。この RNAi を使用して興味の特定の蛋白質のノックダウンと若齢および老齢のワームからの抽出物の分析について述べる。これらのメソッドは、プロテオステイシス ネットワークのコンポーネント調整不溶性タンパク質を決定するための強力なツールをする必要があります。いくつかの介入など減少インスリン/インスリン様成長因子 (IGF) 1 シグナル (IIS)線虫の加齢¹⁴を劇的に遅らせることが示されています。長寿経路はしばしばタンパク質品質管理機構を誘導し、こうしてこれらの経路が積極的に影響を与えられます蛋白質の集合の率。たとえば、IIS 経路⁷の阻害に寿命の長い動物で減らされた内在タンパク質凝集を示す.

プロトコル

注: プロシージャの詳細については、のワークフロー (図 1) の模式図が添付されます。

1. 若者の大規模な番号と高齢者のc. の elegansの成長は興味の遺伝子 RNAi ターゲットを受ける

注: 使用のc. の elegans温による滅菌gon-2(q388)変異 (CF2253) 高齢者同期集団を取得します。すべての手順で開いて炎を上げて半無菌条件の下で動作するように (たとえば、菌類または細菌)、汚染が存在しないことを確認することが重要です。温度が記載されていない場合は、部屋の温度で (また遠心) の手順を行います。

1. 生殖腺のない動物を取得する線虫 gon-2(-)変異体の作製
   注: 無菌動物の生殖腺に欠けているを得るためには、損失の機能突然変異する必要がありますで誘導する親動物 (L4) 最後の幼虫段階でこれらをシフトすることによって 25 ° C に母性的な貢献を避けるために。
   1. 温度シフトの親の世代を収集するgon-2(-)動物の最初の拡張
      1. ストリークのエシェリヒア属大腸菌OP50 ホストゲノム スープ (LB) プレートひずみし、37 ° C でそれを一晩インキュベート
      2. 次の日 OP50 クローンと 200 mL の LB 培地に接種し、37 ° C でそれを一晩インキュベート
      3. 次の日シード 15 高成長 (HG) ミディアム プレート (直径 9 cm) 0.5 mL OP50 でヘラで OP50 を配布。2 日間室温でプレートを維持します。
      4. OP50 でシード 15 HG 中板に (最後の 2 つの世代のために飢えていない) gon-2(-)動物をチャンクし、プレートが大人と合流していくつか OP50 がまだ使用可能まで 20 ° C でそれらを維持します。
      5. 一方で、シード 60 HG OP50 で中板に従って 1.1.1.3 ステップし、室温でプレートを維持します。注意してください: シード プレート保管してはいけません 1 週間以上室温で寒天がクラックされると。
      6. ほとんどの大人が上記¹⁵卵を産む始めたら合流プレートを漂白剤します。2 15 mL チューブに卵を収集し、20 ° C で一晩ならびにミキサーに配置
      7. 次の日洗濯 l1 でハッチングされた M9 バッファー (85 mM NaCl、42 mM Na₂HPO₄·7H₂O、22 mM KH₂PO₄): 3,000 × g で遠心する 30 s、破棄上清、M9 と 15 mL のマークまで塗りに。遠心、上澄みを廃棄し、1.1.1.6 の手順を繰り返します。M9 と 15 mL のマークまで結果ワーム ペレットを埋めます。
      8. 2 μ L 滴非シード寒天プレート上に配置に存在の l1 をカウントすることにより解剖顕微鏡と l1 の合計数を評価します。少なくとも 9 滴から得られた数字を平均します。
      9. L4 段階まで 20 ° c シード HG プレート ワームの成長させにつき 6,500 l1 を追加します。
   2. 実験のための生殖腺のない動物を取得するgon-2(-)動物の 2 番目の拡張
      1. L4 段階で、彼らは卵を産む開始し、l1 を孵化するまでステップ 1.1.1.9 ~ 25 ° C からワームをシフトします。
      2. 沈降積層法による集卵と l1
         メモ: 25 ° C に温度シフト後、穏やかな手法として大人から壊れやすい卵と l1 を分離する沈降を使うことが望ましいです。
         1. 5 つのプレートあたり 5 mL M9 を使用して M9 でプレートを洗います。50 mL チューブにワームを転送します。
         2. M9 の 45 mL マークすべてのチューブを埋める約 10 分大人土砂を聞かせて、50 mL のチューブにそれぞれの上清を収集し、ペレットでこの手順を繰り返します。1 分 3,000 x g で卵と l1 を含む上清を遠心し、約 10 分のための l1 土砂を 15 mL が残るまで上澄みを除去します。
            注: これは重要なステップです。できるだけ多くの l1 を収集する上清をあまりにも早くを削除しないでください。
         3. 25 ° C で一晩ならびにミキサーに卵と l1 を含むチューブを配置します。
2. RNAi 興味の遺伝子をターゲットに受ける若齢および老齢の動物を収集するために生殖腺のない動物の液体培養
   注: RNAi にいくつかの遺伝子の応答温度上記¹⁶に依存をすることができます。RNAi に代わりに、 gon-2(-)の背景に突然変異の遺伝子を組み込むことができます。
   1. 細菌の液体培養の準備
      1. それぞれの細菌文化の 12 mL で 4 L LB 培地に接種 OP50 と RNAi 細菌 (望ましい dsRNA と細菌コントロールとして空のベクターを産生する細菌) を準備 (RNAi に最終濃度 50 μ G/ml carbenicillin と 1 mM IPTG を追加細菌文化) 180 rpm で一晩 37 ° C でそれらを孵化させなさいと。
      2. 次の日は 4 ° C で 10 分間 6,700 x g で文化を収穫します。培養上清を取り外して 60 mL 冷たい S 基底メディア (100 mM 50 mM カリウム リン酸塩 pH 6、氷で保たれる塩化ナトリウム) でペレットを再懸濁します。3 つの再懸濁のペレットを維持 (OP50、RNAi 細菌および興味の遺伝子のための RNAi 細菌制御) 1.2.2 または 1.2.3 のステップまで 4 ° c。
         注: ワームにも作製できる RNAi L1 段階から (ステップ 1.2.3 参照) または L4 最後の幼虫期から発育障害を避けるために (手順 1.2.2 参照)。
   2. 幼虫期は L4 を開始最後に RNAi 治療液体培養
      1. Fernbach 培養フラスコ 200 mL S 基底メディアを追加 (容量 2,800 mL)。300 mL の最終的な文化ボリューム (1.2.2.4 を参照)、3 mM MgSO 4_{10 mM クエン酸カリウム、pH 6、3 mL の微量金属ソリューション (5 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、2.5 mM FeSO4、1 mM MnCl2、1 mM ZnSO4、0.1 mM CuSO4) を追加}、3 mM CaCl₂、100 ng/mL カルベンダジム、5 μ G/ml コレステロール)。膜のスクリュー キャップとフラスコを閉じます。バッファーのレシピは、表 1を参照してください。
      2. 25 の ° C (ステップ 1.1.2.2.3) から l1 を取るし、15 mL チューブにそれらを転送します。3 分間 1,900 × g で遠心、上清を除去、ステップ 1.1.1.8 のように 2 μ L あたり l1 をカウントします。前の手順で準備 Fernbach 培養用フラスコに 500,000 l1 を追加します。
      3. ワームの数に比例して (手順 1.2.1) から OP50 を追加します。たとえば、500,000 ワーム 60 mL OP50 を追加します。
      4. 300 mL 合計ボリュームをさせる基底 s ワーム文化を完了します。150 rpm の振動のインキュベーターで 25 ° C で L4 段階までワーム文化を孵化させなさい。
      5. 次の日、ワームは、野生型 L4s のサイズをする必要があります。OP50 から RNAi 細菌に変更、6 の 50 mL チューブに動物を収集、土砂をさせて、上澄みを削除します。残留 OP50 細菌を除去する M9 に L4s を洗う: 3 分間 1900 × g で遠心分離機、上澄みを除去し、すべて L4s を 1 つ 50 mL チューブに移します。カウント 5 μ L あたり L4s (少なくとも 9 回)。高齢者ワーム コレクションに 2 回 100,000 L4s が必要し、2 回 50,000 L4s 若いワーム コレクション必要です。
      6. 1.2.2.1 に従って 4 つの Fernbach 文化フラスコを準備します。各フラスコに最終濃度 50 μ G/ml Carbenicillin と 1 mM IPTG の追加もできます。
      7. RNAi コントロールを追加細菌とワームの数に比例して (手順 1.2.1) からの興味の遺伝子のための RNAi 細菌: 若いワーム用フラスコごとそれぞれの細菌の 7 mL と高齢者のワームのフラスコあたり 14 mL を追加。
      8. 若いワーム コレクション用フラスコあたり 50,000 ワームと高齢者ワーム コレクション用フラスコあたり 100,000 ワームを追加し、300 mL に合わせて基底 s 文化を完了します。25 の ° C および 150 rpm でワーム文化 (4 つの合計) を孵化させなさい。
   3. L1 段階から RNAi 治療液体培養
      1. 1.2.2.1 に従って 4 つの Fernbach 文化フラスコを準備し、最終濃度 50 μ G/ml carbenicillin と 1 mM IPTG を追加します。
      2. 1.2.2.2 に従って l1 の準備を続行します。合計では、4 つのフラスコに分ける 300,000 ワームが必要です。
      3. RNAi コントロールを追加細菌と (ステップ 1.2.1) からワームで前述の数に比例の興味の遺伝子のための RNAi 細菌 1.2.2.7 をステップし、考えても L1 と L4 段階の間成長期: 若い w フラスコごとそれぞれの細菌の 13 mL を追加orm と高齢者のワームのフラスコあたり 26 mL。
      4. 1.2.2.8 の手順で説明したように続けます。
   4. C. elegans液体文化の保守
      1. 定期的にスライド ガラスに各液体培養と場所から、因数を収集 (または寒天版の) 汚染がないことを確認します。特に成長期の中に文化の細菌食品レベルをチェック解剖顕微鏡を使用して。事前制御 RNAi の 2 L 文化細菌と手順 1.2.1 興味の遺伝子のための RNAi 細菌。必要な場合C. elegans液体文化にこれらを追加し、4 ° C で残りの部分を保つ
      2. 動物が生殖不能である定期的にチェックします。動物の大部分は、生殖腺を必要はありません。ゴン 2の突然変異の浸透度、に応じていくつかは生殖腺構造を中止可能性がありますが、卵を持つ動物は守らなければなりません。
3. 液体培養で RNAi を受ける若齢および老齢のワームのコレクション
   注: すべての次の手順は、1 つの液体培養フラスコが興味の遺伝子の制御と RNAi 細菌と同じ年齢の両方の文化を一緒に処理する必要があります。
   1. 2 日目や不溶性蛋白質の基底レベルを測定する 3 日目で若いワームを収集します。高齢者ワームは、人口の半分が死亡したとき (最新) で収集する必要があります。これを行うには、死者と生きているワームは液体培養寒天プレート上に配置を数滴にカウントされます。少なくとも 9 滴の比率は平均化します。
   2. 次の試薬: 1 L M9、1 L M9 0.01 %octoxynol-9 (M9 + Octoxynol 9) と ddH₂O. 40 mL 60% のショ糖を維持氷上試薬。
   3. 分離漏斗に 1 つのフラスコからワームを注ぎ、室温で 10 分間ワーム土砂をみましょう。活栓を開き、1 つの 50 mL チューブにワームを点滴します。
   4. 2 15 mL チューブにワーム ペレットを分割し、室温で 5 分間 1,900 × g で遠心分離機します。ワームを洗って、上澄みを除去し、M9 で 15 mL を埋めます。遠心分離を繰り返します。最後に 2 つの 50 mL チューブにワームを転送し、20 mL の合計容積冷たい M9 にいっぱい。
   5. 削除する細菌や死んだワームを追加 2 つの 50 mL チューブに 2 つの 20 mL の希釈ワーム ペレット 20 mL 冷たい 60% ショ糖でいっぱい。すぐに部屋の温度、加速度 9 と 7 の減速で 5 分間 2,700 × g で遠心分離機します。大規模なピペット (25 mL) とトップ ワーム層を慎重に取り外します。15 mL を取る (ただし、以下の場合は、明らかに死んでワームの多く)。M9 + Octoxynol 9 37 mL に直接これを入れて氷の上 (ショ糖チューブあたり 3 管) を用意します。9 と 7 の減速、加速度、室温で 3 分間 2,700 × g で遠心分離機します。
      注: 両方の冷たい; する必要があります。それ以外の場合、分離は動作しません。混在させないでください!ショ糖はワームに有毒であるために、次のステップの速さに重要です。
   6. 4 15 mL チューブにペレットを分割し、洗って二度と冷たい M9 + Octoxynol-9: 1,900 x g で室温で 1 分間遠心します。上清を除去、冷たい M9 + Octoxynol 9 と手順を繰り返して 15 mL マークがいっぱい。
   7. 冷たい M9 で 1 回洗浄し、2 つの管に 4 本のチューブを結合します。15 mL チューブに 4 mL の容量を室温で M9 でいっぱい、40 分の 25 ° c ならびにミキサーに回転させます。
      注: これにより腸内残留細菌を消化するワームです。死んだ物がないことを顕微鏡下でワームをチェックします。
   8. 1.3.5 で説明されているように冷たい M9 + Octoxynol 9 で 2 回ワームを洗ってください。M9 で 2 回洗浄し、ワームを 1 つの管に転送します。
   9. インヒビター (0.1 M 4 morpholineethanesulfonic 酸 (MES)、1 mM ethyleneglycoltetraacetic 酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)、0.1 ミリメートルの EDTA、0.5 mM MgSO₄、0.75 M の NaCl、0.02 M フッ化ナトリウム (NaF)) 再構築 (RAB) 高塩抽出バッファーでワームを一度洗う前にコレクション。ワーム ペレット上に液がなくなるまでは、上清を削除します。
      注: この手順と次のいずれかされるべきである急速に高い塩濃度バッファーによるワームのアーティファクトを避けるために。
   10. ワーム餌の量を推定し、阻害剤 (プロテアーゼ阻害剤カクテル × 2) とラブの同一ボリュームを追加します。パスツール ピペットを使用して、ワームを描画し、ドライアイス、液体窒素で満たされた半分 50 mL のチューブにゆっくりと滴下します。液体窒素蒸発し、さらに処理まで-80 ° c 冷凍ワームを保存をしましょう。
       注意: 液体窒素は超低温です。適切な保護具を着用します。

2. RNAi 興味の遺伝子をターゲットに受ける若齢および老齢動物と不溶性蛋白質の抽出

1. 1.3 ステップで収集した動物の中断
   注: 任意のワーム試料の融解を避けるために重要です。液体窒素でモルタルを冷やすし、ドライアイスで完全な手順を実行します。
   注意: 液体窒素は超低温です。適切な保護具を着用します。
   1. 予冷のモルタルに冷凍ワームを転送し、2.5 分挽きます。
      注: 粉砕の間に注意する: 初めに、冷凍のワームは、小さい弾と、それらを失うことは簡単です。
   2. もう一度それを冷却し、ワーム本体が壊れている顕微鏡で別 2.5 分チェックを挽く粉に液体窒素 (約 100 mL) を追加します。2 mL の管に粉体を転送し、-80 ° C で保存
2. 西部のしみの分析のための迅速な不溶性蛋白質の抽出
   注: は、RNAi 興味の遺伝子をターゲットと別の日の間総蛋白コンテンツと不溶性のタンパク質レベルを比較するのにこのメソッドを使用します。2.2.3 氷の上のステップまですべての手順を実行します!
   1. ステップ 2.1 150 から挽いたミミズの 50 mg を可溶化 μ Radioimmunoprecipitation 検定法 (RIPA) バッファー (50 mM Tris pH 8、150 mM の NaCl、5 ミリメートルの EDTA、0.5% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 0.5% デオキシ コール酸ナトリウム (SDO)、1 %nonylphenylpolyethylenglycol (NP40) 1 mM特異フッ化物 (PMSF)、プロテアーゼ阻害剤カクテル × 1)。灰色の針 (27 x ½」、0.4 mm × 13 mm) を 1 mL の注射器を使用して懸濁液の均質化します。懸濁液を 10 倍を描画します。
   2. 18,400 x g で 4 ° C で 20 分間遠心上清を収集します。
   3. 4 ° C で 20 分 18,400 x g で 100 μ L RIPA バッファーと遠心分離機でペレットを再懸濁します上澄みを廃棄、まもなく、スピン、残った上清を削除する注意してください。
   4. 高い不溶性タンパク質の可溶化、75 μ L 尿素/SDS バッファー (8 M 尿素、2% SDS 50 mM ジチオトレイトール (DTT) 50 mM トリス、pH 8) でペレットを再懸濁します、室温で 10 分間インキュベートします。
   5. 総たんぱく量を分析するには、尿素/SDS ペレット巻き上がり・最初 RIPA ステップ 2.2.2 から上澄みを組み合わせます。抽出に使用されるボリュームのために、総分数は RIPA 培養上清中の 3 分の 2 と尿素/SDS ペレットの割合の 3 分の 1 を含める必要があります。小さな 4-12% の勾配ゲル [尿素/SDS の端数の 9 μ L を読み込むことによって不溶性タンパク質と 4 μ L 結合蛋白のレベルをチェックします。総蛋白のしみ染色蛋白質のレベルを監視するを実行します。質量分析法による定量化個々 のタンパク質の不溶で変更を確認特定の抗体を使用してしみが付くことウエスタンによって (セクション 3 を参照してください)。
3. 質量分析のための SDS 不溶性タンパク質を分離する不溶性蛋白質の抽出
   注: は、氷の上のすべての手順を実行します。
   1. ドライアイスの 2 つを重量を量る回 2 mL チューブに挽いたミミズ時点および RNAi 細菌 (若齢および老齢のワームを制御 RNAi 細菌や興味の遺伝子のための RNAi 細菌) あたり 350 mg です。
   2. 高塩可溶性タンパク質を削除するには、阻害剤, 1 mM PMSF、200 U/mL DNase I とそれぞれ 100 μ g/mL RNase A 管し、氷の粉体を可溶化重量 (700 μ L) あたりラブの 2 つのボリュームを追加します。15 回 1 mL 注射器 (灰色の針、27 x ½」、0.4 mm × 13 mm) に懸濁液を作成し、4 ° C で 20 分 18,400 x g で 10 分間遠心分離機氷の孵化脂肪層を通過し、1 つの条件 (合計で 4 つの管) 1 つ 2 mL チューブに高食塩可溶性タンパク質を含む上清を収集します。脂肪を除去し、それを破棄します。-80 ° C で凍結する分注高塩可溶性タンパク質
   3. 脂質を破棄する 1 M ショ糖を含む阻害剤と 700 μ L ラブでペレットを可溶化 (DNase せず私と RNase A)。懸濁液を注射器に 10 倍を引くし、氷上で 5 分間遠心 4 ° C で 20 分 18,400 x g、インキュベート上清および脂質をすべて削除し、それらを捨てるように注意します。
   4. SDS 可溶性タンパク質を削除するには、700 μ L RIPA バッファーとペレットを可溶化します。10 回注射器に懸濁液を描画し、氷で 10 分間インキュベートします。18,400 x g で 4 ° C で 20 分間遠心SDS 水溶性タンパク質と-80 ° C で凍結の因数を含む上清を収集します。
   5. 一緒にそれぞれの条件の 2 つのサンプルを 500 μ L RIPA バッファーとペレットを可後プールします。10 回を懸濁液を注射器に描画します。18,400 x g で 4 ° C で 20 分間遠心すべて上清を除去し、それを破棄する注意してください。
      注: 抽出の目標は、不溶性のタンパク質から水溶性の蛋白質を分けるにです。したがって、すべて残留 RIPA 清次のステップでギ酸を追加する前に削除することが重要です。
   6. 400 μ L 70% ギ酸に極めて不溶性蛋白質を含んでいる最終的なペレットを可溶化し、20 回注射器に懸濁液を作成します。氷の上に 20 分間インキュベートします。4 ° C、3 の加速と減速 5、ワーム キューティクルの残骸を削除するのに 20 分間 50,000 × g で遠心分離機します。高い不溶性タンパク質を含む上清を収集し、-80 ° C で凍結
   7. 不溶性蛋白質量分析のための透析
      注: Dialyze 4 ° C で
      1. 8 L 透析バッファー (50 mM トリス、1 mM DTT、0.1 mM PMSF、pH 7.5) を準備し、8 の 1 L ビーカーに分割します。3 つの膜を配置 (膜フィルター = 0.025 μ M) 各 1 L ビーカーのバッファー面。
      2. 膜ごと慎重に手順 2.3.6 で取得した蟻酸に可溶化不溶性タンパク質の 65 μ L をロードします。各条件は、六つの膜に分かれています。
      3. 5 μ L を採取して pH のストリップに追加 1 つのサンプルの pH をチェックします。PH は 7 と 8 の間 (約 2 h) 後は、上下に軽くピペッティングしてサンプルを収集します。最後に、10 μ L 透析バッファーを使用して、各膜を析出物を洗います。-80 ° C で凍結します。

3. 包括的な同定と RNAi ターゲットに興味の遺伝子による年齢とともにタンパク質不溶性の変化の定量化

1. 質量分析の分析の準備
   1. 濃度既知の参照試料とともに 4-12% 勾配ゲルに因数を読み込むことによって、透析の試料中の不溶性のタンパク質の量を評価します。総蛋白ゲル染色を行い画像解析ソフトとタンパク質の量を定量化します。この手順は、トリプシン消化 (ステップ 3.1.4) に必要な量を推定する必要です。
   2. 遠心蒸化器を使用してサンプルを集中し、8 M 尿素の最終的な集中に不溶性タンパク質を可溶化します。
   3. アルキル化と削減
      1. 追加 Tris(2-carboxyethyl) ホスフィン塩酸塩 (TCEP) サンプルに 4 mM の最終的な集中に。300 rpm と 57 ° C で 1 時間インキュベートします。サンプルを室温に置きます。
      2. 8.4 mM の最終的な集中にヨードアセトアミドを追加します。室温で暗闇の中では、45 分 (2 時間インキュベートすることができます) それを孵化させなさい。
      3. 150 mM 重炭酸アンモニウム、最終的な 2 M 尿素濃度のサンプルを希釈します。
   4. 5%/w ダイジェスト蛋白質は、37 ° C、400 rpm で一晩トリプシンを変更しました。
   5. 12 %sds ゲルの消化された蛋白質のサンプルをロードし、総蛋白ゲル染色消化が働いていた場合を分析するを実行します。まだ、いくつかのバンドの存在、3.1.4 と 3.1.5 が手順繰り返します。
   6. 若者と高齢者のコントロールと扱われる RNAi線虫由来のペプチドは、製造元の指示に従って相対的な絶対 quantitation のための等圧のタグが付いています。
      注: また、ペプチッドまたは蛋白質の分類のための他の方法に使えるタンデム質量タグなど定量化。
      注: 質量分析法による分析: サンプルの複雑さを減らすためには、ペプチドが質量分析⁵の異なる画分に強い陽イオン交換クロマトグラフィーによって分けられるべきです。いくつかの質量分析計も¹⁷相対的な絶対 quantitation のため分析の定圧タグが可能です。得られたデータは、適切なソフトウェアで処理する必要があります。全体的にこの分析は非常に不溶解性蛋白質と年齢とプロテオステイシス変調変化の識別を許します。

4.生体内評価集計パターンに興味の遺伝子の影響の高齢化の中に

1. セクション 3 で質量分析、RNAi を受ける動物の別の範囲に蓄積する年齢依存性凝集しやすいタンパク質を選択します。遺伝子組換え線虫を生成するタグ付き蛍光タンパク質とそのそれぞれのプロモーターまたはティッシュ特定の促進者の管理下のこの蛋白質を表現するライン (適切なプロモーターの選択のための説明を参照)。OP50 でシード線虫成長 (NG) 版での標準技術で 15 ° C でひずみを維持します。たとえば、我々 は polyadenylate 結合蛋白質 (PAB-1) 咽頭筋プロモーターの制御の下で tagRFP に N 末端融合を表現するワームひずみを選んだpmyo 2.
2. 興味の遺伝子の抑制に年齢とともに集計における変化のin vivo評価
   1. 1 ~ 2 日前もって、準備 NG/carbenicillin (Carb) コントロール (空 RNAi ベクター L4440) に IPTG プレート/細菌と RNAi 細菌興味の遺伝子を抑制します。(RNAi線虫について詳細なプロトコル ゼウス科学教育データベースを参照してください。Essentials の生物 1: 酵母、ショウジョウバエと線虫。RNAi線虫。ゼウス、ケンブリッジ、マサチューセッツ、doi: 10.3791/5105 (2017 年))。
   2. L1 から RNAi 治療のため場所産卵ワーム幾つかに分離、20 ° C の興味の遺伝子のための RNAi の細菌のコントロール RNAi やシード小皿 NG/炭水化物/IPTG (直径 6 cm)後 2 時間、20 ° C で子孫を維持する大人を削除します。発達の欠陥を避けるためには、L4 仔稚魚期後 RNAi 治療を開始できます。
   3. 子孫 L4 幼虫の段階に達すると、新しい NG/炭水化物/IPTG プレート、興味の遺伝子のための RNAi の細菌のコントロール RNAi やシードの上にこれらの L4s を転送します。9 板 15 遺伝子組み換え各両方の条件を設定し、20 ° C でそれらを保つ高齢化のワームを転送する必要彼らの子孫から新しい板に彼らの生殖期の終わりまで 1 日おきその子孫からそれらを区別することができるために。
   4. 成人期、一日おきに 24 倍の倍率で蛍光ステレオ顕微鏡下で蛍光タグ集計しやすいタンパク質の分布の変化を評価します。
      注: 明るい点で集計しやすいタンパク質の齢依存的蓄積は、集計の読み取りとして使用されます。これらの点は、骨材として特徴付けられる高不動の構造をする必要があります。これは、共焦点顕微鏡を用いた (FRAP) 退色後蛍光回復によって決定する必要があります。集約された蛋白質のため、少なくとも 4 分^5,18後、漂白地域の回復が観察ない必要があります。2 日目、5 日目、次として成人の 7 日目で PAB 1 を過剰発現年齢同期ワームで年齢による変化を定量化する勝ち越し分布パターン: 低い集計レベル (後部咽頭球 0 10 tagRFP::PAB 1 点)媒体の集約レベル (後部咽頭球以上 10 点) や高い集約レベル (前方咽頭球以上 10 点)。

結果

どのように長寿命の動物を評価するここに示される方法を用いて削減 IIS は年齢依存した蛋白質の集合を調節します。西部のしみの (参照手順 2.2 簡易西部のしみの分析のための不溶性蛋白質の抽出)、我々 は合計とヤング (成人の日 3) の不溶性のタンパク質含有量を分析し、(成人の日 18) ワーム コントロール RNAi と RNAi ターゲットにインスリンを高齢者/ような IGF-1 ?...

ディスカッション

ここで報告受ける RNAi 解析質量分析法および西部にしみが付くことによって線虫の老化から高い不溶性タンパク質凝集体を分離する手法を提案する.私達は、年齢依存した蛋白質の集合を防止する IIS を大幅に減らすことによってプロテオステイシスを向上させることを示します。線虫c.エレガンス ノザン特定の集計しやすいタンパク質を選択すると、さらに固有の蛋白質凝集を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1088655	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	300635
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	04716728001	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	09830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4352135	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	393126
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	393315
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5404000413
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702000329
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	75004518
Concentrator Plus	Eppendorf	5305000304	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158		Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen		Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen		Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]