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Resumo

O objetivo do método apresentado aqui é explorar a agregação da proteína durante o envelhecimento normal no organismo modelo c. elegans. O protocolo representa uma poderosa ferramenta para estudar os agregados grandes altamente insolúveis que formam com a idade e para determinar como as alterações em proteostasis impactam agregação da proteína.

Resumo

Nas últimas décadas, a prevalência de doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Alzheimer (AD) e a doença de Parkinson (PD), tem crescido. Estas desordens associadas idade caracterizam-se pelo aparecimento de agregados de proteínas com estrutura fibrilar nos cérebros destes pacientes. Exatamente por isso que as proteínas solúveis normalmente passam por um processo de agregação continua a ser mal compreendido. A descoberta de que a agregação da proteína não está limitada a processos da doença e em vez disso, parte do processo normal de envelhecimento permite o estudo dos mecanismos moleculares e celulares que regulam a agregação da proteína, sem usar ectopically expressa humana proteínas associadas a doença. Aqui descrevemos as metodologias para examinar a agregação da proteína inerente em elegans de Caenorhabditis através de abordagens complementares. Primeiro, nós examinamos como crescer um grande número de idade-sincronizado c. elegans para obter animais envelhecidos e apresentamos os procedimentos bioquímicos para isolar altamente insolúvel-grandes agregados. Em combinação com um nocaute alvo genético, é possível dissecar o papel de um gene de interesse em promover ou impedindo a agregação de idade-dependente da proteína usando qualquer uma análise abrangente com espectrometria de massa quantitativa ou uma análise baseada em candidato com anticorpos. Esses achados são então confirmados por análise na vivo com animais transgénicos expressando proteínas propensas a agregação fluorescente-etiquetadas. Esses métodos devem ajudar a esclarecer por que certas proteínas são propensas a agregação com a idade e, finalmente, como manter estas proteínas totalmente funcional.

Introdução

Enrolamento de proteínas e agregação são reconhecidos como uma marca registrada de várias doenças neurodegenerativas, como AD, PD, esclerose lateral amiotrófica (ela), demência frontotemporal (FTD) e muitos outros. Por exemplo, α-synuclein assemblies para amiloides que se acumulam como corpos de Lewy, particularmente na substância negra de pacientes com DP, enquanto no ALS pacientes TDP-43 ou FUS misfold para agregados citoplasmática de formulário na degeneração de neurônios motores. Cada uma destas perturbações neurodegenerativas, mecanismos de manutenção da homeostase de proteína ou proteostasis falham em evitar a acumulação de misfolded proteínas, consequentemente levando a doença.

Proteostasis é fundamental para garantir funções celulares e em condições normais estes mecanismos reguladores controlam rigorosamente a taxa de síntese proteica, dobramento e degradação. Vários estudos demonstram que, com o envelhecimento, a capacidade de muitas células e órgãos para preservar a homeostase de proteína é gradualmente comprometida e a deterioração fisiológica das redes proteostasis com a idade é um fator agravante importante para doenças neurodegenerativas (revistas em referências1,2,3). O fato de que o controle de qualidade de proteína e a resposta celular ao estresse unfolded da proteína são comprometidos com a idade sugere que o enrolamento de proteínas e agregação podem ser uma consequência geral de envelhecimento. Na verdade, nós e os outros têm demonstrado que a agregação da proteína não está restrita a doença e em vez disso, parte do proteome torna-se altamente detergente-insolúvel em animais envelhecidos4,5,6,7 ,8,9,10. Análise computacional e na vivo revelou que estes agregados fisiológicos relacionadas com a idade se assemelham a agregados de doenças em vários aspectos,5. A descoberta de agregação da proteína endógena, dependente da idade nos dá a oportunidade de dissecar os mecanismos moleculares e celulares que regulam a agregação da proteína, sem o uso de proteínas associadas a doença humanas ectopically expressas. Actualmente, apenas uma limitada informação existe sobre o Regulamento de insolubilidade proteína generalizada e sobre os efeitos desta desregulagem na saúde do organismo.

O nemátodo c. elegans é um dos organismos modelo mais extensivamente estudados na pesquisa do envelhecimento como estes animais têm vida relativamente curta e mostram muitas características de envelhecimento característicos observadas em organismos superiores. Os efeitos do envelhecimento na insolubilidade de proteínas têm sido estudados em c. elegans por sequencial fracionamento bioquímico com base na solubilidade diferencial, que é amplamente utilizada para extrair agregados de doença no campo de pesquisa neurodegeneração11 . Por espectrometria de massa quantitativa, várias centenas de proteínas foram mostradas para tornar-se agregação propensas em c. elegans na ausência de doença5. Aqui descrevemos detalhadamente o protocolo para crescer um grande número de vermes em cultura líquida e a extração sequencial para isolar proteínas agregadas para quantificação por espectrometria de massa e análise por Western blot. Porque misfolded e propensas a agregação de proteínas se acumulam na idade c. elegans gônadas e máscaras alterações em outros tecidos somáticos5,12,13, usamos um mutante gonad-menos para focar a análise da proteína insolubilidade em tecidos não reprodutivos. O método apresentado permite a análise de agregados altamente insolúveis, grandes que são insolúveis em 0,5% SDS e peletizadas por velocidade centrífuga relativamente baixa. Alternativamente, um protocolo de extração menos rigoroso para coletar também agregados menores e mais solúveis tem sido publicado em outro lugar10. Além disso, descrevemos o método utilizado para avaliar a agregação em vivo em c. elegans.

Em geral, esses métodos em combinação com o RNA de interferência (RNAi) podem avaliar o papel de um gene de interesse em modulando a agregação da proteína idade-dependente. Para isso, descrevemos a análise dos extratos de vermes jovens e idosos com e sem a derrubada de uma proteína específica de interesse usando RNAi. Esses métodos devem ser uma ferramenta poderosa para determinar quais os componentes da rede proteostasis regulam a insolubilidade de proteína. Várias intervenções reduziram como fator de crescimento semelhante à insulina/insulina (IGF) 1 sinalização (IIS) têm sido mostrados para atrasar drasticamente c. elegans envelhecimento14. Caminhos de longevidade, muitas vezes induzem mecanismos de controle de qualidade da proteína e, portanto, estes caminhos poderiam ser ativamente influenciando a taxa de agregação de proteínas. Como exemplo, demonstramos a agregação de proteína inerente reduzida em Long-lived animais mediante inibição da via IIS7.

Protocolo

Nota: Para um melhor entendimento do processo, é anexado um esquema de fluxo de trabalho (Figura 1).

1. o crescimento de grandes números de Young e envelhecido c. elegans submetido a RNAi visando um Gene de interesse

Nota: Uso de c. elegans induzida por temperatura estéril gon-2(q388) os mutantes (CF2253) para obter grandes populações de idosos-sincronizado. Durante todas as etapas, é importante para trabalhar em condições semi estéreis com uma chama aberta e verifique se não há contaminações (por exemplo, com fungos ou bactérias) estão presentes. Execute as etapas (também centrifugações) à temperatura ambiente, se a temperatura não é descrita.

  1. Preparação de c. elegans gon-2(-) mutantes para se obter a gônada-menos animais
    Nota: Para obter animais estéreis falta gônadas, a mutação de perda-de-função deve ser induzida em animais progenitores deslocando estes na última fase larval (L4) a 25 ° C para evitar a contribuição materna.
    1. Primeira expansão de animais gon-2(-) para coletar a geração parental para mudança de temperatura
      1. Raia Escherichia coli OP50 Coe sobre um prato de caldo lisogenia (LB) e incube-lo durante a noite a 37 ° C.
      2. No dia seguinte inocular meio de 200 mL LB com um clone de OP50 e incubá-lo durante a noite a 37 ° C.
      3. As próximo dia semente 15 alto crescimento (HG) médio chapas (diâmetro 9cm) com 0,5 mL OP50 e distribuir OP50 com uma espátula. Manter as placas em temperatura ambiente por dois dias.
      4. Bolão gon-2(-) animais (não passaram fome durante as duas últimas gerações) nas chapas de média de 15 HG semeadas com OP50 e mantê-las a 20 ° C até que as placas são confluentes com adultos e alguns OP50 ainda está disponível.
      5. Entretanto, sementes HG 60 médio chapas com OP50 conforme descrito no passo 1.1.1.3 e mantém as placas em temperatura ambiente. Cuidado: Placas semeadas não devem ser mantidas por mais de uma semana como o ágar rachará em temperatura ambiente.
      6. Branquear as placas confluentes, uma vez que a maioria dos adultos começam a pôr ovos como descrito anteriormente,15. Recolher os ovos em dois 15 mL-os tubos e coloque em um misturador de oscilador durante a noite a 20 ° C.
      7. Lavagem do próximo dia eclodidos L1s com buffer M9 (85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22mm KH2PO4): centrifugar 3.000 x g por 30 s, descartar o sobrenadante e encher até à marca de 15 mL com M9. Centrifugar, desprezar o sobrenadante e repita a etapa 1.1.1.6. Encha os tubos com as pelotas resultante do worm até a marca de 15 mL com M9.
      8. Avalie o número total de L1s com um microscópio de dissecação contando o L1s presentes em 2 µ l gotas colocadas em placas de ágar não-semeada. Os números obtidos de pelo menos nove gotas de média.
      9. Adicione 6.500 L1s por semeado placa HG e deixe que crescem os vermes a 20 ° C até fase de L4.
    2. Segunda expansão de gon-2(-) animais para obter a gônada-menos animais para experimento
      1. Fase de L4, deslocar os vermes do passo 1.1.1.9 a 25 ° C até que eles começam a pôr ovos e L1s estão nascendo.
      2. Coleta de ovos e L1s por sedimentação
        Nota: Após a mudança de temperatura a 25 ° C, é preferível usar sedimentação como uma técnica suave para separar os ovos frágeis e L1s de adultos.
        1. Lave as placas com M9 usando 5ml M9 por cinco placas. Transferi os vermes para tubos de 50 mL.
        2. Encher todos os tubos para a marca de 45 mL com M9, deixe o sedimento de adultos durante cerca de 10 min, coletar cada sobrenadante em um tubo de 50 mL e repita esta etapa com a pelota. Centrifugue o sobrenadante que contém ovos e L1s a 3.000 x g por 1 min, deixe o sedimento L1s durante cerca de 10 min e retire o sobrenadante até 15 mL são deixados.
          Nota: Este é um passo crítico. Não retire o sobrenadante cedo demais, para coletar L1s tantos quanto possível.
        3. Coloque os tubos que contêm ovos e L1s em um misturador de oscilador durante a noite a 25 ° C.
  2. Cultura líquida da gônada-menos animais para recolher animais jovens e idosos, sujeitados a RNAi visando um gene de interesse
    Nota: A resposta de alguns genes de RNAi pode ser temperatura dependente como descrito anteriormente,16. Como uma alternativa para RNAi, um gene mutante poderia ser incorporado ao fundo de gon-2(-) .
    1. Preparação de bactérias para cultura líquida
      1. Preparar OP50 e RNAi bactérias (bactérias produzindo o dsRNA desejado e bactérias com o vetor vazio como controle) por inocular o meio LB 4L com 12 mL de cultura bacteriana respectiva (adicionar uma concentração final de 50 carbenicilina µ g/mL e 1 mM de IPTG para o RNAi culturas bacterianas) e incube-os a 37 ° C durante a noite a 180 rpm.
      2. No dia seguinte da colheita das culturas a 6.700 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Remover os sobrenadantes e ressuspender cada em 60 mL gelada S basal mídia (100 mM de NaCl, 50mm potássio fosfato pH 6, mantido no gelo). Manter as três bolinhas ressuspensa (OP50, controlar bactérias de RNAi e bactérias de RNAi para o gene de interesse) a 4 ° C até o passo 1.2.2 ou 1.2.3.
        Nota: Worms podem ser cultivadas em RNAi de fase L1 (consulte a etapa 1.2.3) ou para evitar defeitos no desenvolvimento da última fase larval L4 (consulte a etapa 1.2.2).
    2. Cultura líquida para tratamento com RNAi, começando no último estágio larval L4
      1. Adicionar 200 mL S basal mídia em um frasco de cultura Fernbach (capacidade 2.800 mL). Para um volume de cultura final de 300 mL (ver 1.2.2.4), adicionar o citrato de potássio 10 mM, pH 6, 3 mL de solução de metais traço (ácido de 5mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 2,5 mM Filipa4, 1mm MnCl2, 1mm ZnSO4, 0,1 mM CuSO4), 3 mM de MgSO 4 de , 3mm CaCl2, 100 ng/mL carbendazim e 5 µ g/mL colesterol). Feche o frasco com uma tampa de rosca de membrana. Consulte a tabela 1 para receitas de buffers.
      2. Pegue o L1s fora de 25 ° C (etapa 1.1.2.2.3) e transferi-los para tubos de 15 mL. Centrifugar a 1.900 x g, durante 3 min, remover o sobrenadante e contar o L1s por 2 µ l etapa 1.1.1.8. Adicione 500.000 L1s para o frasco de cultura Fernbach preparado na etapa anterior.
      3. Adicione OP50 (da etapa 1.2.1) proporcionalmente ao número de vermes. Por exemplo, para 500.000 vermes Adicionar 60 mL OP50.
      4. Cultura de worm completa com S basal para trazer o volume total de 300 mL. Incube a cultura do worm até fase de L4 a 25 ° C numa incubadora de agitação a 150 rpm.
      5. No dia seguinte, os vermes devem ser o tamanho do selvagem-tipo L4s. Para mudar de OP50 para bactérias de RNAi, recolher animais em seis 50 mL-tubos, deixe-os sedimentos e remover o sobrenadante. Lavar o L4s com M9 para remover as bactérias de OP50 residuais: centrifugar a 1900 x g, durante 3 min, remover o sobrenadante e transferir todos os L4s um 50 mL-tubo. Conte a L4s por 5 µ l (pelo menos nove vezes). Duas vezes 50.000 L4s são necessários para a coleção de verme jovem e duas vezes 100.000 L4s são necessários para a coleção de worm envelhecido.
      6. Prepare-se quatro frascos de cultura Fernbach conforme descrito em 1.2.2.1. Adicione também uma concentração final de 50 µ g/mL carbenicilina e 1 mM de IPTG para cada balão.
      7. Adicionar controle RNAi RNAi bactérias para o gene de interesse (da etapa 1.2.1) proporcionalmente ao número de vermes e bactérias: adicionar 7 mL das respectivas bactérias por balão para vermes jovens e 14 mL por frasco para os vermes envelhecidos.
      8. Adicionar 50.000 vermes por balão para a coleção de verme jovem e 100.000 vermes por balão para a coleção de worm envelhecido e completar as culturas com S basal para preencher até 300 mL. Incube as culturas worm (quatro no total) a 25 ° C e 150 rpm.
    3. Cultura líquida para tratamento com RNAi partir de fase L1
      1. Prepare quatro frascos de cultura Fernbach conforme descrito em 1.2.2.1 e adicionar uma concentração final de 50 carbenicilina µ g/mL e 1 mM de IPTG.
      2. Continue com a preparação de L1s conforme descrito em 1.2.2.2. No total, 300.000 vermes são necessários para dividi-los em quatro frascos.
      3. Adicionar controle RNAi bactérias e bactérias de RNAi para o gene de interesse (da etapa 1.2.1) proporcional ao número de vermes como descrito no passo 1.2.2.7 e considere também a fase de crescimento entre a fase de L1 e L4: adicionar 13 mL das respectivas bactérias por balão para jovem w ORMs e 26 mL por frasco para os vermes envelhecidos.
      4. Continue como descrito na etapa 1.2.2.8.
    4. Manutenção das culturas líquidas de c. elegans
      1. Periodicamente recolher uma alíquota de cada cultura líquida e coloque sobre uma lâmina de vidro (Alternativamente em uma placa de ágar) para verificar que não existem sem contaminações. Usando um microscópio de dissecação, verificar os níveis de alimentar bacteriana na cultura, especialmente durante a fase de crescimento. Preparar com antecedência as culturas de 2L de controle RNAi bactérias e bactérias de RNAi para o gene de interesse, conforme descrito na etapa 1.2.1. Adicioná-los ao C. elegans culturas de líquido se necessário e manter o resto em 4 ° C.
      2. Periodicamente, verifique que os animais são esterilizados. A maioria dos animais não terá uma gônada. Dependendo a penetrância da mutação gon-2 , alguns podem ter abortado estruturas gonadais, mas nenhum animal com ovos deve ser observados.
  3. Coleção de minhocas jovens e idosos submetidos a RNAi em cultura líquida
    Nota: Todas as etapas a seguintes são para um frasco de cultura líquida, mas ambas as culturas da mesma idade com controle e bactérias de RNAi para o gene de interesse devem ser processadas juntos.
    1. Recolha os vermes jovens no dia 2 ou 3 para medir os níveis basais de insolubilidade de proteína. Envelhecido vermes devem ser recolhidos (no máximo), quando metade da população morreu. Para determinar isso, vermes mortos e vivos são contadas em várias gotas de cultura líquida colocada sobre uma placa de ágar. Rácios são calculados pelo menos nove gotas.
    2. Preparem-se os seguintes reagentes: 1 L M9, 1 L M9 com 0.01% Octoxinol-9 (M9 + Octoxinol-9) e 40 mL 60% de sacarose em ddH2O. mantém os reagentes no gelo.
    3. Despeje os vermes de um balão em um funil de separação e deixa o sedimento de vermes por 10 min à temperatura ambiente. Abra a torneira e escorrer os vermes em um tubo de 50 mL.
    4. Dividir a pelota de worm em dois 15 mL-os tubos e centrifugar a 1.900 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Para lavar os vermes, remover o sobrenadante e encha até 15 mL com M9. Repeti a centrifugação. Finalmente, transferir os vermes para dois tubos de 50 mL e encher o volume total de 20ml com M9 gelada.
    5. Para remover as bactérias e vermes mortos, adicionar as duas pelotas de worm 20 mL diluído para dois 50 mL-os tubos cheios de 20 mL gelada 60% de sacarose. Rapidamente, centrifugar a 2.700 x g durante 5 min à temperatura ambiente, 9 de aceleração e desaceleração 7. Remova com cuidado a camada superior do worm com uma pipeta grande (25 mL). Levar até 15 mL (mas menos se há, obviamente, um monte de vermes mortos). Colocar isso diretamente em 37 mL de M9 + Octoxinol-9 (3 tubos por tubo de sacarose) preparado no gelo. Centrifugar a 2.700 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente, aceleração 9 e desaceleração 7.
      Nota: Tanto a necessidade de ser gelada; caso contrário, a separação não vai funcionar. Não misture! Porque a sacarose é tóxico para os vermes... é importante ser rápido para a etapa seguinte.
    6. Divida a pelota em quatro 15 mL-os tubos e lavar duas vezes com gelada M9 + Octoxinol-9: centrifugar 1.900 x g por 1 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante, encha até a marca de 15 mL com gelada M9 + Octoxinol-9 e a repetição do procedimento.
    7. Lave uma vez com M9 gelada e combinar os quatro tubos de dois tubos. Encher com M9 em temperatura ambiente para um volume total de 4 mL em tubos de 15 mL e girar em um misturador de oscilador a 25 ° C por 40 min.
      Nota: Isto ajuda as minhocas para digerir qualquer residuais bactérias no intestino. Verifique os vermes sob o microscópio para ver que não há nenhum inoperantes.
    8. Lave os vermes duas vezes com gelada M9 + Octoxinol-9, conforme descrito em 1.3.5. Lave duas vezes com M9 e transferir os vermes para um tubo.
    9. Lave os vermes de uma vez no buffer de extração de elevado-sal de remontagem (RAB) sem inibidores (ácido 4-morpholineethanesulfonic de 0,1 M (MES), ácido de ethyleneglycoltetraacetic de 1 mM (EGTA), 0.1 mM EDTA, 0,5 mM de MgSO4, 0,75 M NaCl, fluoreto de sódio (NaF) a 0,02 M) antes da coleta. Remova o sobrenadante até que não haja nenhum líquido em cima a pelota de verme.
      Nota: Este passo e o próximo devem ser feitos rapidamente para evitar artefatos nos vermes causados pela alta concentração de sal no buffer.
    10. Estimar o volume de sedimento worm e adicionar um volume idêntico de RAB com inibidores (2 x coquetel de inibidor de Protease). Com uma pipeta Pasteur, elaborar os vermes e gotejar lentamente em um tubo de 50 mL, que metade cheio com nitrogênio líquido, colocado em gelo seco. Deixe o nitrogênio líquido evapora e armazenar os vermes congelados a-80 ° C até o processamento adicional.
      Atenção: O nitrogênio líquido é a temperatura extremamente baixa; Use proteção adequada.

2. extração da proteína insolúvel com animais jovens e idosos, sujeitado a RNAi visando um Gene de interesse

  1. Perturbação dos animais coletados na etapa 1.3
    Nota: É importante evitar qualquer descongelamento das amostras de verme. Arrefecer a argamassa com nitrogênio líquido e execute o procedimento completo em gelo seco.
    Atenção: O nitrogênio líquido é a temperatura extremamente baixa; Use proteção adequada.
    1. Transferir os vermes congelados para a argamassa pre-cooled e moer para 2,5 min.
      Nota: Tenha cuidado durante a moagem: no início, os vermes congelados estão em pequenas balas e é fácil perdê-los.
    2. Adicione nitrogênio líquido (cerca de 100 mL) para o pó para esfriá-la novamente e moer para outra 2,5 min. verificar com o microscópio, que os órgãos de worm são quebrados. Transferir o pó para tubos de 2 mL e armazená-los a-80 ° C.
  2. Extração de proteínas insolúveis rápida para análise ocidental do borrão
    Nota: Use esse método para comparar os níveis de proteína insolúvel e conteúdo de proteína total entre os dias diferentes, com e sem RNAi como alvo o gene de interesse. Execute todas as etapas até o passo 2.2.3 no gelo!
    1. Solubilizar a 50 mg de vermes de solo da etapa 2.1 com 150 µ l Radioimmunoprecipitation ensaio (RIPA) tampão (50 mM Tris pH 8, 150 mM de NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% sulfato dodecyl de sódio (SDS), 0,5% de sódio Deoxycholate do (SDO), 1% nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1mm phenylmethylsulfonyl fluoreto (PMSF), 1 x coquetel de inibidor de Protease). Homogeneizar a suspensão utilizando uma seringa de 1 mL com agulha cinza (27 x ½", 0,4 milímetros x 13 milímetros); elaborar a suspensão 10 vezes.
    2. Centrifugar 18.400 x g por 20 min a 4 ° C. Recolha o sobrenadante.
    3. Resuspenda o pellet em 100 µ l RIPA buffer e centrifugar a 18.400 x g por 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante, girar logo e cuidado remover restos de sobrenadante.
    4. Para solubilizar as proteínas altamente insolúveis, resuspenda o pellet em buffer de ureia/SDS 75 µ l (8m ureia, 2% SDS, 50mm ditiotreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8) e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
    5. Para analisar o conteúdo de proteína total, combine o primeiro RIPA sobrenadante da etapa 2.2.2 e a ressuspensão de sedimento de ureia/SDS. Para considerar os volumes utilizados para a extração, a fração total deve conter dois terços da RIPA sobrenadante e um terço da fração de pelota de ureia/SDS. Em um pequeno 4-12% gel de gradiente, verificar os níveis de proteína insolúvel por carregar 9 µ l da fração de ureia/SDS e 4 µ l combinada da proteína total. Realize uma coloração de borrão da proteína total para monitorar os níveis de proteína. Por Western mancha usando anticorpos específicos, verificar alterações na insolubilidade para proteínas individuais quantificado por espectrometria de massa (ver secção 3).
  3. Extração de proteínas insolúveis para isolar proteínas insolúveis SDS por espectrometria de massa
    Nota: Execute todas as etapas no gelo.
    1. Em gelo seco pesar duas vezes 350mg vermes de solo por ponto de tempo e por bactérias de RNAi (vermes jovens e idosos, controlar bactérias de RNAi e bactérias de RNAi para gene de interesse) para tubos de 2 mL.
    2. Para remover as proteínas solúveis de elevado-sal, adicione dois volumes de RAB por peso (700 µ l) com inibidores, 1mm PMSF, 200 U/mL DNase I e 100 µ g/mL RNase A cada tubo e solubilizar o pó no gelo. Elaborar a suspensão em uma seringa de 1 mL (agulha cinza, 27 x ½", 0,4 milímetros x 13 milímetros) 15 vezes e ele incubar no gelo por 10 min. centrifugar a 18.400 x g por 20 min a 4 ° C. Atravessar a camada de gordura e recolher o sobrenadante contendo proteínas solúveis de elevado-sal em um tubo de 2 mL por condição (quatro tubos no total). Remover a gordura e descartá-lo. Alíquotas proteínas solúveis de elevado-sal para congelar a-80 ° C.
    3. Para descartar os lipídios, solubilizar a pelota com 700 µ l RAB com inibidores com 1 M de sacarose (sem DNase I e RNase A). Elaborar a suspensão em uma seringa de 10 vezes e ele incubar no gelo por 5 min. centrifugar a 18.400 x g por 20 min a 4 ° C. Tenha cuidado para remover todo o sobrenadante e lipídios e descartá-los.
    4. Para remover as proteínas solúveis no SDS, solubilize a pelota com amortecedor de RIPA 700 µ l. Elaborar a suspensão em uma seringa de 10 vezes e incube-lo por 10 min no gelo. Centrifugar 18.400 x g por 20 min a 4 ° C. Recolher o sobrenadante contendo proteínas SDS-solúvel e alíquota para congelar a-80 ° C.
    5. Juntar duas amostras de cada condição junto depois de solubilizing cada pellet com amortecedor de RIPA 500 µ l. Elaborar a suspensão em uma seringa de 10 vezes. Centrifugar 18.400 x g por 20 min a 4 ° C. Tenha cuidado para remover todos os sobrenadante e descartá-lo.
      Nota: O objetivo da extração é separar as proteínas solúveis as proteínas insolúveis. Portanto, é importante remover todos os residual RIPA sobrenadante antes de adicionar o ácido fórmico na próxima etapa.
    6. Solubilizar o pellet final contendo proteínas altamente insolúveis com 400 µ l 70% de ácido fórmico e elaborar a suspensão em uma seringa de 20 vezes. Incube durante 20 min no gelo. Centrifugar a 50.000 x g por 20 min a 4 ° C, 3 de aceleração e desaceleração 5, para remover os resíduos de cutícula do verme. Recolher o sobrenadante que contém proteínas altamente insolúveis e congelá-lo a-80 ° C.
    7. Diálise de frações de proteína insolúvel por espectrometria de massa
      Nota: Dialize a 4 ° C.
      1. Preparar o tampão de diálise 8L (50 mM Tris, 1 milímetro DTT, 0.1 mM PMSF, pH 7,5) e dividi-lo para oito provetas de 1L. Coloque três membranas (filtros de membrana = 0,025 µM) sobre a superfície de reserva para cada copo de 1 L.
      2. Por membrana, cuidadosamente carrega 65 µ l de proteína insolúvel solubilizada em ácido fórmico, obtido na etapa 2.3.6. Cada condição é dividida em seis membranas.
      3. Verificar o pH de uma amostra, removendo 5 µ l e adicioná-lo para uma faixa de pH. Se o pH é entre 7 e 8 (aproximadamente após 2 h), colete a amostra pipetando para cima e para baixo suavemente. Finalmente, use o buffer de diálise 10 µ l para lavar o precipitado fora cada membrana. Congelar as amostras a-80 ° C.

3. abrangente identificação e quantificação das alterações na proteína insolubilidade com idade induzida por RNAi visando um Gene de interesse

  1. Preparação para análise de espectrometria de massa
    1. Avalie a quantidade de proteínas insolúveis nas amostras dializadas carregando uma alíquota em um gel de gradiente de 4-12% juntamente com uma amostra de referência de concentração conhecida. Realizar uma coloração do gel de proteína total e quantificar a quantidade de proteína com um software de análise de imagem. Essa etapa é necessária para estimar a quantidade de tripsina, necessária para a digestão (passo 3.1.4).
    2. Concentre-se as amostras usando um evaporador centrífugo e solubilizar as proteínas insolúveis em uma concentração final de ureia 8m.
    3. Alquilação e redução
      1. Adicionar Tris(2-carboxyethyl) cloridrato de fosfina (TCEP) a uma concentração final de 4 mM para as amostras. Incube durante 1 h a 57 ° C, com 300 rpm. Colocar as amostras à temperatura ambiente.
      2. Adicione iodoacetamide para uma concentração final de 8,4 mM. Incube-45 min (pode ser incubadas durante 2 h) no escuro à temperatura ambiente.
      3. Dilua as amostras em bicarbonato de amónio 150 mM para obter uma concentração final de ureia 2m.
    4. Digerir proteínas com 5% w/w modificado tripsina durante a noite a 37 ° C e 400 rpm.
    5. Carregar uma amostra das proteínas digeridas em um gel de SDS de 12% e realizar uma coloração de gel de proteína total para analisar se a digestão trabalhou. Se ainda houver algumas bandas presentes, repita os passos 3.1.4 e 3.1.5.
    6. Peptídeos de controle de jovens e idosos e RNAi Tratado c. elegans são rotulados com tags isobárica para quantificação relativa e absoluta, seguindo as instruções do fabricante.
      Nota: Como alternativa, para rotular os peptídeos ou proteínas podem ser utilizados outros métodos para quantificação como marcas de massa em tandem.
      Nota: Análise de espectrometria de massa: para reduzir a complexidade de amostra, peptídeos devem ser separados por cromatografia de troca de cátion forte em diferentes frações para análise de espectrometria de massa5. Espectrómetros de massa de vários são capazes de analisar as tags isobárica para quantificação relativa e absoluta conforme descrito em outro lugar17. Os dados obtidos devem ser processados com o software adequado. Globalmente, esta análise permite a identificação de proteínas altamente insolúveis e suas alterações sobre a idade e sobre modulação proteostasis.

4. avaliação in Vivo da influência de um Gene de interesse sobre o padrão de agregação durante o envelhecimento

  1. A análise de espectrometria de massa na secção 3, selecione uma proteína propensas a agregação de idade-dependente que se acumula de forma diferente nos animais submetidos a RNAi. Gerar transgénicos c. elegans linha expressam esta proteína marcados com uma proteína fluorescente e sob o controle de seu respectivo promotor ou um promotor de tecido-específica (veja a discussão para a escolha de um promotor adequada). Manter a tensão a 15 ° C por técnicas padronizadas em placas de crescimento nematódeo (NG) inoculadas com OP50. Por exemplo, nós escolhemos uma estirpe de worm expressando a proteína ligadora de polyadenylate (PAB-1) fundida no N-terminal para tagRFP sob o controle do promotor da faringe muscular pmyo-2.
  2. Avaliação in vivo de alterações na agregação com idade mediante inibição do gene de interesse
    1. Um ou dois dias de antecedência, preparar NG/carbenicilina (Carb) / IPTG placas com um controle (vetor vazio de RNAi L4440) bactérias e bactérias de RNAi para inibir o gene de interesse. (Para um protocolo detalhado sobre RNAi em c. elegans consulte JoVE ciência educação de banco de dados. Básico de biologia 1: levedura, Drosófila e C. elegans. RNAi em c. elegans. JoVE, Cambridge, MA, doi: 10.3791/5105 (2017)).
    2. Para o tratamento de RNAi de L1, lugar postura vermes para vários separam pequenas placas NG/Carb/IPTG (6 cm de diâmetro), semeadas com controle RNAi ou RNAi bactérias para o gene de interesse a 20 ° C. Remover os adultos após 2 h, mantendo a progênie a 20 ° C. Para evitar defeitos no desenvolvimento, tratamentos de RNAi podem ser iniciados após a fase larval de L4.
    3. Uma vez que a descendência atinge o estágio larval de L4, transferi estes L4s em novas placas de NG/Carb/IPTG semeadas com controle RNAi ou RNAi bactérias para o gene de interesse. Configurar nove placas com 15 transgênicos para ambas as condições e mantê-los a 20 ° C. Os vermes de envelhecimento precisam ser transferido longe de seus descendentes para novas placas cada segundo dia até o final do seu período reprodutivo a fim de ser capaz de distingui-los dos seus descendentes.
    4. Avalie as alterações na distribuição da proteína propensas a agregação rotulada com uma etiqueta fluorescente sob um estéreo-microscópio fluorescente com ampliação de x 24 durante a idade adulta, todos os dias.
      Nota: O acúmulo de idade-dependente da proteína propensas a agregação em partitura brilhante é usado como uma leitura para agregação. Estes partitura deve ser altamente imóveis estruturas para ser caracterizado como agregados. Isso deve ser determinado pela recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) utilizando microscopia confocal. Para agregados da proteína, sem recuperação deve ser observada na região branqueada após pelo menos 4 min5,18. Para quantificar as alterações com a idade, marcamos os padrões de distribuição na idade-sincronizado worms superexpressão PAB-1 no dia 2, dia 5 e dia 7 da vida adulta como o seguinte: níveis de agregação (0-10 tagRFP::PAB-1 partitura no bulbo da faringe posterior), níveis de agregação média (mais de 10 partitura no bulbo da faringe posterior) e níveis elevados de agregação (mais de 10 partitura no bulbo faríngea anterior).

Resultados

Usamos os métodos apresentados aqui para avaliar como long-lived animais com IIS reduzidas modulam a agregação da proteína idade-dependente. Por Western borrão (consulte a etapa 2.2, rápida extração da proteína insolúvel para análise ocidental do borrão), analisamos o total e o conteúdo de proteína insolúvel de young (dia 3 de idade adulta) e envelhecido vermes (dia 18 de idade adulta) em controle de RNAi e RNAi visando a insulina / Receptores de IGF-1-como daf-2. ...

Discussão

Aqui nós relatamos uma metodologia para isolar agregados de proteínas altamente insolúveis do envelhecimento c. elegans submetidos a RNAi para análise por espectrometria de massa e mancha ocidental. Nós mostramos que melhorar proteostasis, reduzindo grandemente o IIS impede a agregação da proteína idade-dependente. Selecionando a proteínas específicas de agregação-propenso a overexpress em c. elegans, é possível dissecar ainda mais os mecanismos de agregação de proteínas inerente de mod...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do DZNE e um subsídio de reintegração Marie Curie International (322120 para D.C.D.)

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Fernbach culture flask Corning4425-2XLPyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap Schott1088655GL45
Nutating MixerVWR444-0148
Separatory funnelNalgene4300-1000Capacity 1,000 ml
1 ml syringe BD Plastipak300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mmBD Microlance 3300635
Membrane filters 0.025 µMMilliporeVSWP04700
pH stripMachery-Nagel92110pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001Complete Mini EDTA-free tablets 
Octoxynol-9 ApplichemA1388Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichM1317
NonylphenylpolyethylenglycolApplichemA1694Nonidet P40 (NP40)
DNaseIRoche04716728001recombinant, RNase free
RNaseAPromegaA7973solution
Total protein blot stainingThermofisherS11791Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel stainingThermofisherS12001Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)Serva36970
IodoacetamideServa26710
AmmoniumbicarbonateSigma-Aldrich09830
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitationSciex4352135iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XPBeckmann Coulter393126
Ultracentrifuge Optima Max-XPBeckmann Coulter393315
Centrifuge 5424REppendorf5404000413
Centrifuge 5702Eppendorf5702000329
Centrifuge Megafuge 40RThermo Scientific75004518
Concentrator PlusEppendorf5305000304Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC LeicaWith Planapo 2.0x objective
Dissection microscopeLeica Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1ZeissWith PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis softwareImageJ
Analysis of mass spectrometry dataProtein Prospectorhttp://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50CGC
RNAi bacteria
L4440Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253CGC, strain name: EJ1158 Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]

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