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  • Résumé
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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

L’objectif de la méthode présentée ici est d’explorer l’agrégation des protéines au cours du vieillissement normal dans l’organisme modèle c. elegans. Le protocole représente un outil puissant pour étudier les grands agrégats fortement insolubles qui se forment avec l’âge et de déterminer comment la modification des protéostasie sur l’agrégation protéique.

Résumé

Au cours des dernières décennies, la prévalence des maladies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer (ma) et la maladie de Parkinson (MP), s’est développée. Ces troubles associés âge sont caractérisent par l’apparition d’agrégats de protéines avec la structure fibrillaire dans le cerveau de ces patients. Exactement pourquoi les protéines solubles normalement subissent un processus d’agrégation reste mal compris. La découverte que l’agrégation des protéines n’est pas limitée aux processus morbides et plutôt partie du processus normal de vieillissement permet l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent l’agrégation des protéines, sans utiliser de façon ectopique exprimé humaine protéines associées à la maladie. Nous décrivons ici les méthodologies afin d’examiner l’agrégation des protéines inhérente chez Caenorhabditis elegans au moyen d’approches complémentaires. Tout d’abord, nous examinons comment faire pousser un grand nombre d’âge synchronisé c. elegans afin d’obtenir des animaux âgés et nous présentons les processus biochimiques pour isoler fortement-insoluble-gros agrégats. En combinaison avec un knockdown génétique ciblée, il est possible de disséquer le rôle d’un gène d’intérêt dans la promotion ou de prévenir l’agrégation des protéines de la fonction de l’âge en utilisant soit une analyse complète avec la spectrométrie de masse quantitative ou un analyse axée sur les candidats avec des anticorps. Ces observations sont ensuite confirmées par in vivo analyse avec des animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes sujettes à l’agrégation. Ces méthodes devraient aider à clarifier pourquoi certaines protéines sont enclins à l’agrégat avec l’âge et, en définitive, comment garder ces protéines entièrement fonctionnel.

Introduction

Repliement et agrégation sont reconnus comme une caractéristique de plusieurs maladies neurodégénératives comme la publicité, PD, sclérose latérale amyotrophique (SLA), démence fronto-temporale (DFT) et bien d’autres. Par exemple, α-synucléine assemblées en fibrilles amyloïdes qui s’accumulent dans le corps de Lewy en particulier dans la substantia nigra de patients Parkinsoniens, tandis qu’en ALS patients TDP-43 ou FUS repliement pour former des agrégats cytoplasmiques dans la dégénérescence des neurones moteurs. Dans chacune de ces maladies neurodégénératives, mécanismes de maintenir l’homéostasie des protéines ou protéostasie ne parviennent pas à empêcher l’accumulation de protéines mal repliées, par conséquent conduisant à la maladie.

Protéostasie est essentiel pour assurer les fonctions cellulaires et dans des conditions normales, ces mécanismes de réglementation contrôlent étroitement le taux de synthèse des protéines, pliage et de dégradation. Plusieurs études démontrent qu’avec le vieillissement, la possibilité de nombreuses cellules et organes à préserver l’homéostasie des protéines est peu à peu et la détérioration physiologique des réseaux protéostasie avec l’âge est un facteur aggravant important pour maladies neurodégénératives (révisés dans les références1,2,3). Le fait que le contrôle de qualité de protéine et la réponse cellulaire au stress de la protéine dépliée sont compromises avec l’âge suggère que le repliement et l’agrégation pourraient être une conséquence générale du vieillissement. En effet, nous et autres avons démontré que l’agrégation des protéines n’est pas limitée à la maladie et plutôt partie du protéome devient hautement détergent insoluble dans animaux âgés4,5,6,7 ,8,9,10. Computational et in vivo l’analyse a révélé que ces agrégats physiologiques liées au vieillissement ressemblent à des agrégats de la maladie dans plusieurs aspects5. La découverte de l’agrégation des protéines endogènes, fonction de l’âge nous donne l’occasion de disséquer les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent l’agrégation des protéines, sans utiliser les protéines humaines exprimées de façon ectopique associés à la maladie. À l’heure actuelle, il existe que peu d’informations sur la régulation de l’insolubilité de la protéine généralisée et sur les effets de ce dérèglement sur la santé de l’organisme.

Le nématode c. elegans est un des organismes plus étudiés de modèle au cours du vieillissement recherche car ces animaux ont une durée de vie relativement courte et présenter de nombreuses caractéristiques de vieillissement caractéristique observées chez les organismes supérieurs. Les effets du vieillissement sur l’insolubilité de la protéine ont été étudiés chez c. elegans par fractionnement biochimique séquentiel, basé sur la solubilité différentielle, qui est largement utilisée pour extraire des agrégats de la maladie dans le domaine de la recherche de neurodégénérescence11 . Par spectrométrie de masse quantitative, plusieurs centaines protéines se sont révélés devenir agrégation sujettes chez c. elegans en l’absence de maladie5. Ici, nous décrivons en détail le protocole afin de cultiver un grand nombre de vers dans le milieu de culture liquide et l’extraction séquentielle pour isoler les protéines agrégées pour la quantification par spectrométrie de masse et analyse par Western blot. Parce que les protéines mal repliées et sujette à l’agrégation s’accumulent dans les personnes âgées c. elegans gonades et masques des changements dans les autres tissus somatiques5,12,13, nous utilisons un mutant de gonades-moins pour axer l’analyse sur les protéines insolubilité dans les tissus non reproductrices. La méthode présentée permet l’analyse des agrégats hautement insoluble, grandes qui sont insolubles dans 0,5 % SDS et granulés de vitesse centrifuge relativement faible. Par ailleurs, un protocole d’extraction moins strict de recueillir également des agrégats plus petits et plus solubles a été publié ailleurs10. En outre, nous décrire la méthode utilisée pour évaluer l’agrégation in vivo chez c. elegans.

Dans l’ensemble, ces méthodes en combinaison avec l’interférence ARN (ARNi) peuvent évaluer le rôle d’un gène d’intérêt dans la modulation de l’agrégation protéique de la fonction de l’âge. Pour cela, nous décrivons l’analyse d’extraits de jeunes et âgés vers avec et sans précipitation d’une protéine spécifique d’intérêt utilisant l’ARNi. Ces méthodes doivent être un outil puissant pour déterminer quels composants du réseau protéostasie réglementent insolubilité de la protéine. Plusieurs interventions réduites telles que l’insuline/insuline-like growth factor (IGF) 1 signalisation (IIS) auraient dû être divulgués de retarder considérablement c. elegans vieillissement14. Voies de longévité souvent induisent des mécanismes de contrôle de la qualité des protéines et donc ces voies pourraient être activement qui influent sur le taux d’agrégation de la protéine. Ainsi, nous démontrons l’agrégation de la protéine intrinsèque réduite chez les animaux de longue durée sur l’inhibition de la voie IIS7.

Protocole

NOTE : Pour une meilleure compréhension de la procédure, un schéma du flux de travail (Figure 1) est attaché.

1. croissance du grand nombre de jeunes et âgés c. elegans soumis à Arni ciblant un gène d’intérêt

Remarque : Utilisation c. elegans induite par la température stérile gon-2(q388) mutants (CF2253) pour obtenir de grandes populations de personnes âgées-synchronisé. Durant toutes les étapes, il est important de travailler dans des conditions semi-stérile avec une flamme nue et de vérifier qu’aucune contamination (par exemple, avec des champignons ou des bactéries) n’est présentes. Effectuez les opérations (également centrifugations) à température ambiante, si la température n’est pas décrite.

  1. Préparation de c. elegans gon-2(-) mutants pour obtenir des gonades sans animaux
    Remarque : Pour obtenir des animaux stériles, absence de gonades, la mutation de la perte de fonction doit être induite chez les animaux parents en déplaçant ceux-ci au dernier stade larvaire (L4) à 25 ° C afin d’éviter la contribution maternelle.
    1. Première extension de gon-2(-) animaux pour collecter la génération parentale pour changement de température
      1. Strie Escherichia coli OP50 souche sur une plaque de lysogénie bouillon (LB) et du jour au lendemain il incuber à 37 ° C.
      2. Le lendemain, inoculer milieu de 200 mL LB avec un clone de OP50 et il incuber une nuit à 37 ° C.
      3. Les prochaine journée semences 15 haute croissance (HG) moyennes plaques (diamètre 9 cm) avec 0,5 mL OP50 et distribuer OP50 avec une spatule. Conserver les plaques à température ambiante pendant deux jours.
      4. Chunk gon-2(-) animaux (ne pas affamé depuis les deux dernières générations) sur des plaques de medium 15 HG ensemencés avec OP50 et de les entretenir à 20 ° C jusqu'à ce que les plaques sont confluentes avec adultes et certains OP50 est toujours disponible.
      5. Dans l’intervalle, semences HG 60 moyennes plaques avec OP50 comme décrit dans étape 1.1.1.3 et garder les plaques à température ambiante. ATTENTION : Plaques ensemencées ne doivent pas être conservés pendant plus d’une semaine, comme l’agar va craquer à température ambiante.
      6. Une fois que la plupart des adultes commencent à pondre comme décrit précédemment15d’eau de Javel les plaques confluentes. Ramasser les œufs en deux 15 mL-tube et placer sur une table de mixage oscillant du jour au lendemain à 20 ° C.
      7. Le prochain jour lavage éclos L1s avec tampon M9 (85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4) : centrifuger à 3 000 x g pendant 30 s, jeter le surnageant et remplir jusqu’au trait de 15 mL avec M9. Centrifuger, éliminer le surnageant et répétez l’étape 1.1.1.6. Remplissez les tubes avec des granulés de ver qui en résulte jusqu’au trait de 15 mL avec M9.
      8. Évaluer le nombre total de L1s avec un microscope à dissection en comptant les L1s présents dans 2 µL gouttes placées sur milieu gélosé contenant des graines. Moyenne les chiffres obtenus à partir d’au moins neuf largages.
      9. Ajouter 6 500 L1s par ensemencés plaque HG et le laisser vers que grandir les à 20 ° C jusqu’au stade L4.
    2. La deuxième extension des animaux gon-2(-) pour obtenir des gonades sans animaux d’expérience
      1. Au stade de L4, passer les vers d’étape 1.1.1.9 à 25 ° C jusqu'à ce qu’elles commencent à pondre et L1s éclosent.
      2. Collecte des œufs et des L1s par sédimentation
        Remarque : Après le changement de température à 25 ° C, il est préférable d’utiliser la sédimentation comme une technique douce pour séparer les œufs fragiles et L1s les adultes.
        1. Laver les plaques avec M9 en utilisant 5 mL M9 par cinq planches. Transférer les vers dans les tubes de 50 mL.
        2. Remplissez tous les tubes de la marque de 45 mL avec M9, laissez les sédiments adultes pendant environ 10 min, percevoir chaque surnageant dans un tube de 50 mL et répétez cette étape avec le culot. Centrifuger le surnageant qui contient les oeufs et L1s à 3 000 x g pendant 1 min, laissez les sédiments L1s pendant environ 10 min et retirez le surnageant jusqu'à 15 mL sont laissés.
          NOTE : Ceci est une étape cruciale. Ne pas enlever le surnageant trop tôt, pour collecter des L1s autant que possible.
        3. Placer les tubes contenant les oeufs et L1s sur un mélangeur oscillant durant la nuit à 25 ° C.
  2. Culture liquide de gonades sans animaux pour recueillir les animaux jeunes et âgés soumis à Arni ciblant un gène d’intérêt
    Remarque : La réponse de certains gènes à RNAi peut être thermo-dépendantes comme décrit précédemment16. Comme alternative à Arni, un gène mutant pourrait être incorporé dans le fond de gon-2(-) .
    1. Préparation des bactéries de culture liquide
      1. Préparer OP50 et Arni bactéries (bactéries produisant de l’ARNdb désiré et bactéries avec le vecteur vide comme contrôle) en inoculant milieu LB 4 L avec 12 mL de la culture bactérienne respectif (ajouter une concentration finale de 50 carbénicilline µg/mL et de 1 mM d’IPTG à l’ARNi cultures bactériennes) et les incuber à 37 ° C durant la nuit à 180 tr/min.
      2. Le lendemain récolter les cultures à 6 700 x g pendant 10 min à 4 ° C. Éliminer le surnageant et resuspendre chaque culot dans 60 mL glacee S milieu de base (100 mM NaCl, 50 mM Potassium phosphate pH 6, gardé sur glace). Garder les trois boulettes remises en suspension (OP50, contrôler les bactéries d’Arni et Arni pour le gène d’intérêt) à 4 ° C jusqu'à l’étape 1.2.2 ou 1.2.3.
        NOTE : Worms peut être cultivé sur RNAi de phase L1 (reportez-vous à l’étape 1.2.3) ou pour éviter des défauts de développement depuis le dernier stade larvaire L4 (voir étape 1.2.2).
    2. Culture liquide pour traitement par ARNi commençant au dernier stade larvaire L4
      1. Ajouter 200 mL S de milieu basal dans un flacon de culture Fernbach (capacité de 2 800 mL). Pour un volume final de la culture de 300 mL (voir 1.2.2.4), ajouter le citrate de potassium 10 mM, pH 6, 3 mL de solution de métaux traces (l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 5 mM, 2,5 mM FeSO4, 1 mM MnCl2, 1 mM ZnSO4, 0,1 mM CuSO4), 3 mM MgSO4 , 3 mM CaCl2, 100 ng/mL carbendazime et 5 µg/mL cholestérol). Refermer le flacon avec un bouchon à vis membrane. Référer au tableau 1 pour les recettes de tampons.
      2. Prendre la L1s hors de 25 ° C (étape 1.1.2.2.3) et de les transférer aux tubes de 15 mL. Centrifuger à 1 900 g pendant 3 min, retirez le surnageant et compter les L1s par 2 µL comme à l’étape 1.1.1.8. Ajouter L1s 500 000 dans le flacon de culture Fernbach préparé à l’étape précédente.
      3. Ajouter OP50 (de l’étape 1.2.1) proportionnellement au nombre de vers. Par exemple, pour les 500 000 vers ajouter 60 mL OP50.
      4. Compléter la culture ver s basale à porter le volume total de 300 mL. Incuber la culture ver jusqu’au stade de L4 à 25 ° C dans un incubateur à agitation avec 150 tr/min.
      5. Le lendemain, les vers doivent être de taille de type sauvage L4s. Pour passer de OP50 aux bactéries d’Arni, recueillir les animaux en six 50 mL-tubes, laissez-les sédiments et éliminer le surnageant. Laver le L4s avec M9 pour éliminer les bactéries résiduelles de OP50 : centrifuger à 1900 g pendant 3 min, retirez le surnageant et transférer tous les L4s dans un 50 mL-tube. Compter les L4s par 5 µL (au moins neuf fois). Deux fois 50 000 L4s sont nécessaires pour la collection jeune ver et deux fois 100 000 L4s sont nécessaires pour la collecte de ver âgé.
      6. Préparer quatre flacons de culture Fernbach comme décrit dans 1.2.2.1. Ajouter également une concentration finale de 50 µg/mL carbénicilline et 1 mM d’IPTG dans chaque fiole.
      7. Ajouter contrôle Arni bactéries et Arni pour le gène d’intérêt (de l’étape 1.2.1) proportionnellement au nombre de vers : ajouter 7 mL des bactéries par flacon pour jeunes vers respectifs et 14 mL par flacon pour les vers ans.
      8. Ajouter 50 000 vers par flacon pour la collection jeune ver et 100 000 vers par fiole pour la collection ver âgé et toutes les cultures avec S basale pour remplir jusqu'à 300 mL. Incuber les cultures de ver (quatre au total) à 25 ° C et 150 tr/min.
    3. Culture liquide pour traitement par ARNi commence au stade de L1
      1. Préparer quatre flacons de culture Fernbach comme décrit dans 1.2.2.1 et ajouter une concentration finale de 50 carbénicilline µg/mL et de 1 mM d’IPTG.
      2. Continuer avec la préparation des L1s comme décrit dans 1.2.2.2. Au total, 300 000 vers est nécessaires pour les diviser en quatre flacons.
      3. Ajouter contrôle Arni bactéries et Arni pour le gène d’intérêt (de l’étape 1.2.1) proportionnelle au nombre de vers comme décrit dans étape 1.2.2.7 et examiner également la phase de croissance entre la L1 et L4 étape : ajouter 13 mL des bactéries respectifs par flacon pour jeune w ORM et 26 mL par flacon pour les vers ans.
      4. Continuez comme décrit à l’étape 1.2.2.8.
    4. Entretien des cultures en milieu liquide c. elegans
      1. Recueillir périodiquement une partie aliquote de chaque culture liquide et de la place sur une lame de verre (alternativement sur un plat d’agar) pour vérifier qu’il n’y a aucune contamination. À l’aide d’un microscope à dissection, vérifier les niveaux de bactéries alimentaires dans la culture surtout pendant la phase de croissance. Préparer à l’avance les cultures de 2 L de contrôle Arni bactéries et Arni pour le gène d’intérêt, comme indiqué au point 1.2.1. Ajouter ces cultures liquides de C. elegans si nécessaire et garder le reste à 4 ° C.
      2. Vérifiez périodiquement que les animaux sont stériles. La plupart des animaux n’auront pas une gonade. Selon la pénétrance de la mutation de gon-2 , certains peuvent ont avorté gonadiques structures mais aucuns animaux avec les œufs ne doivent être observées.
  3. Collection des jeunes et âgés vers soumis à Arni en milieu liquide
    NOTE : Toutes les étapes suivantes sont pour un flacon de culture liquide, mais les deux cultures du même âge avec contrôle et bactéries de l’ARNi pour le gène d’intérêt doivent être traitées ensemble.
    1. Recueillir des jeunes vers à la journée 2 ou 3 pour mesurer le niveau basal d’insolubilité de la protéine. Vers âgés devraient être prélevés (au plus tard) quand la moitié de la population est morte. Pour déterminer cela, morts et vivants vers sont comptés dans plusieurs gouttes de culture liquide placé sur un plat d’agar. Les ratios sont en moyenne sur au moins neuf largages.
    2. Préparer des réactifs suivants : 1 L M9, 1 L M9 avec 0,01 % Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9) et 40 mL 60 % de sucrose à FD2O. gardent les réactifs sur la glace.
    3. Verser les vers un flacon dans une ampoule à décanter et laisser les sédiments vers pendant 10 min à température ambiante. Ouvrir le robinet et goutte à goutte les vers dans un tube de 50 mL.
    4. Diviser le culot de ver en deux 15 mL-tubes et centrifuger à 1 900 x g pendant 5 min à température ambiante. Pour laver les vers, éliminer le surnageant et remplir jusqu'à 15 mL avec M9. Répétez la centrifugation. Enfin, transférer les vers à deux tubes de 50 mL et remplir au volume total de 20 mL avec M9 glacee.
    5. Pour éliminer les bactéries et les vers morts, ajouter les deux boulettes de ver 20 mL dilué à deux 50 mL-tubes remplis de 20 mL glacee 60 % de saccharose. Centrifuger rapidement à 2 700 x g pendant 5 min à température ambiante, 9 d’accélération et de décélération 7. Retirer délicatement la couche supérieure de ver avec une pipette grande (25 mL). Prendre jusqu'à 15 mL (mais moins si il y a évidemment beaucoup de vers morts). Mettre ceci directement dans 37 mL de M9 + Octoxynol-9 (3 tubes par tube de saccharose) établi sur la glace. Centrifuger à 2 700 g pendant 3 min à température ambiante, accélération décélération 7 et 9.
      Remarque : Les deux doivent être glacée ; sinon la séparation ne fonctionnera pas. Ne pas mélanger ! Parce que le saccharose est toxique pour les vers, il est important d’être rapide pour l’étape suivante.
    6. Diviser le culot en quatre 15 mL-tubes et laver deux fois avec glacee M9 + Octoxynol-9 : centrifuger à 1 900 x g pendant 1 min à température ambiante. Retirer le surnageant, remplir jusqu'à 15 mL marque avec glacee M9 + Octoxynol-9 et procédure de répéter.
    7. Laver une fois avec M9 glacée et combiner les quatre tubes à deux tubes. Remplir avec M9 à température ambiante pour un volume total de 4 mL à 15 mL-tubes et tourner sur un mélangeur oscillant à 25 ° C pendant 40 min.
      Remarque : Cela aide les vers de digérer les bactéries résiduelles dans le tube digestif. Vérifier les vers au microscope pour voir qu’il n’y a pas morts.
    8. Laver les vers deux fois avec glacee M9 + Octoxynol-9 comme décrit dans 1.3.5. Laver deux fois avec le M9 et transférer les vers dans un tube.
    9. Laver les vers une fois dans le tampon d’extraction de la forte teneur en sel de remontage (RAB) sans inhibiteurs (0,1 M d’acide 4-morpholineethanesulfonic (MES), l’acide ethyleneglycoltetraacetic 1 mM (EGTA), 0,1 mM EDTA, 0,5 mM MgSO4, 0,75 M NaCl, le fluorure de sodium (NaF) 0,02 M) avant le prélèvement. Retirez le surnageant jusqu'à ce qu’il n’y a pas de liquide sur le dessus de la pastille de ver.
      Remarque : Cette étape et celle qui suit devraient être faits rapidement pour éviter les artefacts dans les vers causée par la forte concentration de sel dans la mémoire tampon.
    10. Estimer le volume d’extrait concentré de ver et ajouter un volume identique de RAB avec inhibiteurs (2 x Cocktail inhibiteur de protéase). À l’aide d’une pipette Pasteur, dresser les vers et s’écouler lentement dans un tube de 50 mL que moitié remplie à l’azote liquide placé dans la glace sèche. Laissez l’azote liquide s’évapore et stocker les vers congelés à-80 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure.
      ATTENTION : L’azote liquide est à une température extrêmement basse ; porter une protection appropriée.

2. Extraction de la protéine insolubles avec les animaux jeunes et âgés soumis à Arni ciblant un gène d’intérêt

  1. Perturbation des animaux recueillis dans l’étape 1.3
    Remarque : Il est important d’éviter tout dégel des échantillons ver. Refroidir le mortier à l’azote liquide, puis effectuez la procédure complète sur la glace sèche.
    ATTENTION : L’azote liquide est à une température extrêmement basse ; porter une protection appropriée.
    1. Transférer les vers congelés au mortier refroidis et moudre pour 2,5 min.
      Remarque : Soyez prudent lors de la mouture : au début, les vers congelés sont en petites balles et il est facile de les perdre.
    2. Ajouter l’azote liquide (environ 100 mL) à la poudre pour refroidir à nouveau et moudre pour encore 2,5 min. vérifier avec le microscope que les corps de ver sont brisés. Transférer la poudre dans des tubes de 2 mL et les stocker à-80 ° C.
  2. Extraction des protéines insolubles rapide pour l’analyse par Western blot
    Remarque : Utilisez cette méthode pour comparer les niveaux de protéines insolubles et de contenu de protéine totale entre les différents jours avec et sans Arni ciblant le gène d’intérêt. Exécutez toutes les étapes jusqu'à l’étape 2.2.3 sur glace !
    1. Solubiliser les 50 mg de vers de terre à l’étape 2.1 avec 150 µL de tampon de dosage (RIPA) immunoprécipitation (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5 % dodécylsulfate de sodium (SDS), désoxycholate de sodium 0,5 % (SDO), 1 % nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 mM fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 1 x Cocktail inhibiteur de protéase). Homogénéiser la suspension à l’aide d’une seringue de 1 mL avec aiguille gris (27 x ½", 0,4 mm x 13 mm) ; dresser la suspension de 10 fois.
    2. Centrifuger à 18 400 x g pendant 20 min à 4 ° C. Recueillir le liquide surnageant.
    3. Resuspendre le culot dans 100 µL de tampon de RIPA et centrifuger à 18 400 x g pendant 20 min à 4 ° C. Jeter le surnageant, tournent peu et veillez à enlever les restes de surnageant.
    4. Pour solubiliser les protéines hautement insolubles, resuspendre le culot dans 75 µL de tampon d’urée/SDS (8 M urée, 2 % SDS, 50 mM dithiothréitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8) et incuber pendant 10 min à température ambiante.
    5. Pour analyser la teneur en protéines totales, combiner le premier RIPA surnageant de l’étape 2.2.2 et la remise en suspension de pellet urée/SDS. Pour expliquer les volumes utilisés pour l’extraction, la fraction totale devrait contenir deux tiers de RIPA surnageant et un tiers de la fraction de pellet urée/SDS. Sur un gel de gradient petit 4-12 %, vérifier les niveaux de protéines insolubles en chargeant 9 µL de la fraction d’urée/SDS et 4 µL de protéine combinée totale. Effectuer une coloration de tache de protéines totales pour surveiller les niveaux de la protéine. Par Western Blot à l’aide d’anticorps spécifiques, vérifier les modifications apportées à l’insolubilité des protéines individuelles quantifiées par spectrométrie de masse (voir Section 3).
  3. Extraction de la protéine insoluble pour isoler les protéines insolubles dans SDS pour la spectrométrie de masse
    Remarque : Effectuez toutes les étapes sur la glace.
    1. Sur la glace sèche peser deux fois vers de terre 350 mg par point dans le temps et par les bactéries de RNAi (vers jeunes et âgés, contrôler les bactéries d’Arni et Arni pour le gène d’intérêt) dans des tubes de 2 mL.
    2. Pour enlever les protéines solubles de forte teneur en sel, ajouter deux volumes de RAB par poids (700 µL) avec des inhibiteurs, 1 mM PMSF, 200 U/mL DNase I, ainsi que 100 µg/mL RNase A à chaque tube et solubiliser la poudre sur la glace. Dresser la suspension dans une seringue de 1 mL (aiguille gris, 27 x ½", 0,4 mm x 13 mm) 15 fois et il incuber sur glace pendant 10 min. Centrifuger à 18 400 x g pendant 20 min à 4 ° C. Passer à travers la couche de graisse et de recueillir le surnageant contenant les protéines solubles de forte teneur en sel dans un tube de 2 mL par État (quatre tubes au total). Retirez la graisse et jetez-le. Aliquotes forte teneur en sel des protéines solubles à congeler à-80 ° C.
    3. Pour rejeter les lipides, solubiliser le culot avec 700 µL RAB avec inhibiteurs contenant 1 M de sucrose (sans DNase I et RNase A). Dresser la suspension dans une seringue de 10 fois et il incuber sur glace pendant 5 min. Centrifuger à 18 400 x g pendant 20 min à 4 ° C. Veillez à supprimer tous les surnageant et lipides et jetez-les.
    4. Pour éliminer les protéines solubles dans le SDS, solubiliser le culot avec 700 µL de tampon de RIPA. Dresser la suspension dans une seringue de 10 fois et il incuber pendant 10 minutes sur la glace. Centrifuger à 18 400 x g pendant 20 min à 4 ° C. Récupérer le surnageant contenant les protéines solubles dans le SDS et l’aliquote pour la congélation à-80 ° C.
    5. Deux échantillons de chaque condition ensemble la piscine après solubilisation de chaque granule avec 500 µL de tampon de RIPA. Dresser la suspension dans une seringue de 10 fois. Centrifuger à 18 400 x g pendant 20 min à 4 ° C. Veillez à supprimer tous les surnageant et jetez-le.
      NOTE : Le but de l’extraction est de séparer les protéines solubles de protéines insolubles. Par conséquent, il est important de supprimer tous les résiduels RIPA surnageante avant d’ajouter l’acide formique dans l’étape suivante.
    6. Solubiliser le granule final contenant des protéines hautement insolubles à l’acide formique de 70 % 400 µL et établit la suspension dans une seringue de 20 fois. Incuber pendant 20 min sur la glace. Centrifuger à 50 000 x g pendant 20 min à 4 ° C, 3 d’accélération et la décélération 5, pour enlever les débris de cuticule ver. Récupérer le surnageant qui contient des protéines hautement insolubles et congeler à-80 ° C.
    7. Dialyse des fractions de protéines insolubles pour la spectrométrie de masse
      Remarque : Dialyser à 4 ° C.
      1. Préparer le tampon de dialyse 8 L (50 mM Tris, 1 millimètre DTT, 0,1 mM PMSF, pH 7,5) et le diviser à huit béchers 1 L. Placez trois membranes (membranes filtrantes = 0,025 µM) sur la surface de tampon pour chaque bécher de 1 L.
      2. Par membrane, soigneusement charger 65 µL de protéine insoluble solubilisé dans de l’acide formique obtenu à l’étape 2.3.6. Chaque condition est répartie sur six des membranes.
      3. Vérifier le pH d’un échantillon en retirant 5 µL et ajoutant sur une bande de pH. Si le pH est entre 7 et 8 (après environ 2 h), prélever l’échantillon en pipettant également monter et descendre doucement. Enfin, utilisez 10 µL de tampon de dialyse pour laver le précipité hors chaque membrane. Congeler les échantillons à-80 ° C.

3. complète Identification et Quantification des changements dans l’insolubilité de protéine avec l’âge induite par ARNi ciblant un gène d’intérêt

  1. Préparation pour l’analyse par spectrométrie de masse
    1. Évaluer la quantité de protéines insolubles dans les échantillons dialysés en chargeant une partie aliquote sur un gel de dégradé de 4 à 12 % et un échantillon de référence de concentration connue. Effectuer une coloration de gel de protéine totale et de quantifier la quantité de protéines avec une analyse d’images. Cette étape est nécessaire pour estimer le montant de la trypsine, nécessaire à la digestion (étape 3.1.4).
    2. Concentrer les échantillons à l’aide d’un évaporateur centrifuge et solubiliser les protéines insolubles dans une concentration finale de 8 M urée.
    3. Alkylation et réduction
      1. Ajouter Tris(2-carboxyethyl) chlorhydrate de phosphine (TCEP) à une concentration finale de 4 mM pour les échantillons. Incuber pendant 1 heure à 57 ° C, avec 300 tr/min. Placer les échantillons à la température ambiante.
      2. Ajouter iodoacétamide à une concentration finale de 8,4 mM. Incuber pendant 45 min (peuvent être incubées pendant 2 h) dans l’obscurité à température ambiante.
      3. Diluer les échantillons dans le bicarbonate d’ammonium 150 mM pour obtenir une concentration finale d’urée 2 M.
    4. Digérer les protéines avec 5 % p/p modifié la trypsine pendant une nuit à 37 ° C et 400 tr/min.
    5. Charger un échantillon des protéines digérées sur un gel SDS de 12 % et d’effectuer un marquage de protéines totales gel pour analyser si la digestion a travaillé. S’il n’y a encore quelques bandes présentes, répétez les étapes 3.1.4 et 3.1.5.
    6. Peptides de contrôle jeune et âgé et Arni traité c. elegans sont étiquetés avec des balises isobariques pour quantification relative et absolue, suivant les instructions du fabricant.
      NOTE : Alternativement, autres méthodes pour étiqueter les peptides ou protéines pourraient être utilisés pour la quantification telles que les balises de masse en tandem.
      Remarque : Analyse par spectrométrie de masse : pour réduire la complexité de l’échantillon, les peptides doivent être séparés par chromatographie échangeuse de cations forts en différentes fractions pour analyse de spectrométrie de masse5. Plusieurs spectromètres de masse sont capables d’analyses tags isobares quantification relative et absolue comme décrit ailleurs17. Les données obtenues devraient être traitées avec un logiciel approprié. Dans l’ensemble, cette analyse permet l’identification des protéines hautement insolubles et leurs variations sur l’âge et à la modulation de protéostasie.

4. évaluation in Vivo de l’Influence d’un gène d’intérêt sur le modèle d’agrégation au cours du vieillissement

  1. Dans l’analyse de spectrométrie de masse à la Section 3, sélectionnez une protéine sujettes à l’agrégation de fonction de l’âge qui s’accumule à des degrés divers chez les animaux soumis à l’ARNi. Générer des transgéniques c. elegans exprimant cette protéine contenant le tag avec une protéine fluorescente et sous le contrôle de son promoteur respective ou un promoteur de tissu-spécifique (voir la Discussion pour le choix d’un promoteur approprié). Maintenir la souche à 15 ° C par des techniques standard sur des plaques de croissance nématode (NG) ensemencées avec OP50. Par exemple, nous avons choisi une souche ver exprimant la protéine liant le polyadénylate (PAB-1) soudé à l’extrémité N de tagRFP sous le contrôle du promoteur muscle pharyngé pmyo-2.
  2. In vivo l’évaluation des changements dans l’agrégation avec l’âge sur l’inhibition du gène d’intérêt
    1. Un ou deux jours à l’avance, préparer NG/carbénicilline (Carb) / IPTG plats avec un contrôle (vecteur vide d’Arni L4440) les bactéries et Arni pour inhiber le gène d’intérêt. (Pour un protocole détaillé sur l’ARNi chez c. elegans voir JoVE Science Education de base de données. Essentials de biologie 1 : levure, Drosophila et Elegans de c. Arni chez c. elegans. JoVE, Cambridge, MA, doi : 10.3791/5105 (2017)).
    2. Pour le traitement de RNAi de L1, lieu Ponte worms sur plusieurs séparent les petites assiettes NG/Carb/IPTG (6 cm de diamètre), ensemencés avec contrôle Arni ou RNAi bactéries pour le gène d’intérêt à 20 ° C. Supprimer les adultes après 2 h, gardant la progéniture à 20 ° C. Pour éviter les anomalies du développement, Arni traitements peuvent être démarrés après le stade larvaire de L4.
    3. Une fois que la progéniture atteint le stade larvaire de L4, transférer ces L4s sur nouvelles plaques NG/Carb/IPTG ensemencés avec contrôle Arni ou RNAi bactéries pour le gène d’intérêt. Mettre en place des neuf plaques avec 15 organismes transgéniques chacun pour les deux conditions et gardez-les à 20 ° C. Les vers de vieillissement doivent être transférées loin de leur progéniture aux plaques de nouveau tous les deux jours jusqu'à la fin de leur période de reproduction afin de pouvoir les distinguer de leur progéniture.
    4. Évaluer les changements dans la distribution de la protéine agrégation sujets marquée avec une étiquette fluorescente sous un stéréo-microscope à fluorescence 24 grossissement à l’âge adulte, tous les autres jours de.
      Remarque : L’accumulation de fonction de l’âge de la protéine sujettes à l’agrégation en examen lumineux est utilisée comme un affichage pour l’agrégation. Ces punctums devraient être des structures très immobiles pour être qualifiée d’agrégats. Cela devrait être déterminée par la récupération de la fluorescence après photoblanchiment (FRAP) à l’aide de la microscopie confocale. Pour les protéines agrégées, aucun recouvrement ne devrait être observée dans la région blanchie après au moins 4 min5,18. Afin de quantifier les modifications avec l’âge, nous avons marqué les patrons de distribution chez les vers synchronisé âge surexprimant PAB-1 au jour 2, jour 5 et jour 7 de l’âge adulte comme suit : de faibles niveaux d’agrégation (0-10 tagRFP::PAB-1 examen en ampoule pharyngée postérieure), niveaux d’agrégation moyenne (plus de 10 punctums dans le bulbe pharyngé postérieur) et les niveaux d’agrégation élevé (plus de 10 punctums dans le bulbe du pharynx antérieur).

Résultats

Nous avons utilisé les méthodes présentées ici pour évaluer comment longévifs animaux avec IIS réduites moduler l’agrégation des protéines de la fonction de l’âge. Par Western blot (Voir l’étape 2.2, rapide extraction de protéine insoluble pour analyse par Western blot), nous avons analysé le total et la teneur en protéines insolubles d’young (le 3e jour de l’âge adulte) et âgés de worms (jour 18 de l’âge adulte) sur commande RNAi et Arni ciblant l’insuline...

Discussion

Nous présentons une méthode pour isoler les agrégats de protéines hautement insoluble c. elegans soumis à Arni pour l’analyse par spectrométrie de masse et les éponger occidental de vieillissement. Nous montrons qu’améliorer protéostasie en réduisant considérablement les IIS empêche l’agrégation des protéines de la fonction de l’âge. En sélectionnant des protéines spécifiques sujettes à l’agrégation de surexprimer chez c. elegans, il est possible de disséquer davantage les...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par la DZNE et une subvention de réintégration Marie Curie International (322120 à D.C.D.)

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Fernbach culture flask Corning4425-2XLPyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap Schott1088655GL45
Nutating MixerVWR444-0148
Separatory funnelNalgene4300-1000Capacity 1,000 ml
1 ml syringe BD Plastipak300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mmBD Microlance 3300635
Membrane filters 0.025 µMMilliporeVSWP04700
pH stripMachery-Nagel92110pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001Complete Mini EDTA-free tablets 
Octoxynol-9 ApplichemA1388Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichM1317
NonylphenylpolyethylenglycolApplichemA1694Nonidet P40 (NP40)
DNaseIRoche04716728001recombinant, RNase free
RNaseAPromegaA7973solution
Total protein blot stainingThermofisherS11791Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel stainingThermofisherS12001Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)Serva36970
IodoacetamideServa26710
AmmoniumbicarbonateSigma-Aldrich09830
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitationSciex4352135iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XPBeckmann Coulter393126
Ultracentrifuge Optima Max-XPBeckmann Coulter393315
Centrifuge 5424REppendorf5404000413
Centrifuge 5702Eppendorf5702000329
Centrifuge Megafuge 40RThermo Scientific75004518
Concentrator PlusEppendorf5305000304Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC LeicaWith Planapo 2.0x objective
Dissection microscopeLeica Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1ZeissWith PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis softwareImageJ
Analysis of mass spectrometry dataProtein Prospectorhttp://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50CGC
RNAi bacteria
L4440Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253CGC, strain name: EJ1158 Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]

Références

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