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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das Ziel der hier vorgestellten Methode ist Proteinaggregation während der normalen Alterung bei Modellorganismus C. Eleganszu erkunden. Das Protokoll stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, sehr unlöslichen großen Aggregaten, die mit zunehmendem Alter bilden zu studieren und zu klären, wie Änderungen in Proteostase Proteinaggregation auswirken.

Zusammenfassung

In den letzten Jahrzehnten ist die Prävalenz von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD) und der Parkinson-Krankheit (PD), gewachsen. Diese altersassoziierter Erkrankungen zeichnen sich durch das Auftreten von Protein-Aggregate mit fibrillary Struktur in den Gehirnen von Patienten. Genau warum normalerweise löslichen Proteine zu unterziehen, bleibt ein Aggregationsprozess schlecht verstanden. Die Entdeckung, dass Proteinaggregation beschränkt sich nicht auf Krankheitsprozesse und stattdessen Teil des normalen Alterungsprozesses die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die Proteinaggregation, zu regulieren ermöglicht, ohne Verwendung von ectopically zum Ausdruck menschlicher Krankheit-assoziierte Proteine. Hier beschreiben wir Methoden um inhärente Proteinaggregation in Caenorhabditis Elegans durch komplementäre Ansätze zu untersuchen. Zunächst untersuchen wir wie zahlreicher Alter synchronisiert C. Elegans wachsen im Alter von Tieren zu erhalten und wir präsentieren die biochemische Verfahren um hoch-unlöslich-große Aggregate zu isolieren. In Kombination mit einer gezielten genetischen Knockdown, ist es möglich, die Rolle eines Gens von Interesse an der Förderung oder altersabhängig Proteinaggregation zu verhindern, indem Sie entweder eine umfassende Analyse mit quantitativen Massenspektrometrie sezieren oder eine Kandidaten-basierte Analyse mit Antikörpern. Diese Erkenntnisse werden dann mit transgenen Tieren ausdrücken Leuchtstoff-Tags Aggregation neigen Proteine durch in-Vivo -Analyse bestätigt. Diese Methoden sollen erklären, warum bestimmte Proteine sind anfällig für Aggregat mit zunehmendem Alter und letztlich wie diese Proteine voll funktionsfähig zu halten.

Einleitung

Protein misfolding und Aggregation sind ein Markenzeichen von mehreren neurodegenerativen Erkrankungen wie AD, PD, Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), frontotemporale Demenz (FTD) und viele andere anerkannte. Α-Synuclein Baugruppen zu Amyloid-Fibrillen anzusammeln, die beispielsweise als Lewy-Körper vor allem in der Substantia Nigra von Parkinson-Patienten, während bei ALS-Patienten TDP-43 oder FUS Misfold Form zytoplasmatischen Aggregaten in degenerierenden Motoneuronen. In jedem dieser neurodegenerativen Erkrankungen nicht Mechanismen, die Aufrechterhaltung der Homöostase Protein oder Proteostase verhindern die Ansammlung von fehlgefaltete Proteine, folglich zu Krankheit führt.

Proteostase ist entscheidend für die Zellfunktionen zu gewährleisten und unter normalen Bedingungen diese Regulationsmechanismen genau steuern die Rate der Proteinsynthese, Faltung und Abbau. Mehrere Studien zeigen, dass mit der Alterung, allmählich die Fähigkeit vieler Zellen und Organe, Protein Homöostase zu bewahren gefährdet ist und die physiologische Verschlechterung der Proteostase Netze mit zunehmendem Alter ein wichtiger erschwerender Faktor für ist Neurodegenerative Erkrankungen (rezensiert in Referenzen1,2,3). Die Tatsache, dass mit zunehmendem Alter der Protein-Qualitätskontrolle und die zelluläre Reaktion auf unfolded Protein Stress beeinträchtigt werden legt nahe, dass Protein misfolding und Aggregation eine allgemeine Folge des Alterns sein könnte. In der Tat haben wir und andere gezeigt, dass Proteinaggregation beschränkt sich nicht auf Krankheit und stattdessen Teil des Proteoms hoch Waschmittel-unlöslich in Alter Tiere4,5,6,7 wird ,8,9,10. Informatik und in Vivo Analyse ergab, dass diese physiologischen altersbedingte Aggregate Krankheit Aggregate in mehreren Aspekten5ähneln. Die Entdeckung der endogenen, altersabhängigen Proteinaggregation gibt uns die Möglichkeit, die molekularen und zellulären Mechanismen zu zergliedern, die Proteinaggregation, ohne Verwendung von ectopically ausgedrückt menschliche Krankheit-assoziierte Proteine regulieren. Derzeit gibt es nur begrenzte Informationen über die Regelung der weit verbreitete Protein Unlöslichkeit und über die Auswirkungen dieser Störungen auf die Gesundheit des Organismus.

Der Fadenwurm C. Elegans gehört zu den am häufigsten untersuchten Modellorganismen in der Alternsforschung, wie diese Tiere eine relativ kurze Lebensdauer haben und viele charakteristische Alterung Funktionen in höheren Organismen beobachtet zeigen. Die Auswirkungen des Alterns auf Protein Unlöslichkeit sind untersucht worden, in C. Elegans durch sequentielle biochemische Fraktionierung basierend auf unterschiedliche Löslichkeit, die weit verbreitet ist, extrahieren Sie Krankheit Aggregate im Bereich der Neurodegeneration Research11 . Durch quantitative Massenspektrometrie wurden mehrere hundert Proteine Aggregation-anfällig in C. Elegans in der Abwesenheit von Krankheit5gezeigt. Hier beschreiben wir ausführlich das Protokoll um große Anzahl von Würmern in Flüssigkultur und die sequentielle Extraktion aggregierte Proteine für die Quantifizierung von Massenspektrometrie und Analyse von Western-Blot isolieren zu wachsen. Denn fehlgefaltete und Aggregation neigen Proteine im Alter ansammeln C. Elegans Gonaden und Masken Veränderungen in anderen somatischen Gewebe5,12,13, verwenden wir eine Mutante Gonade-weniger Protein die Analyse darauf Unlöslichkeit in nicht-reproduktiven Geweben. Die vorgestellte Methode ermöglicht die Analyse von hoch-unlösliche, große Aggregate, die unlöslich in 0,5 % SDS und gebeizte durch relativ niedrige zentrifugale Geschwindigkeit. Alternativ wurde eine weniger strenge Extraktion-Protokoll auch kleiner und besser löslichen Aggregate sammeln10an anderer Stelle veröffentlicht. Darüber hinaus beschreiben wir die Methode zur Aggregation in Vivo in C. Eleganszu beurteilen.

Alles in allem können diese Methoden in Kombination mit RNA-Interferenz (RNAi) die Rolle eines Gens von Interesse an der Modulation der altersabhängigen Proteinaggregation auswerten. Dafür beschreiben wir die Analyse von Auszügen aus jungen und alten Würmer mit und ohne Zuschlag eines spezifischen Proteins des Interesses mit RNAi. Diese Methoden sollte ein leistungsstarkes Tool zum bestimmen, welche Komponenten des Netzwerks Proteostase Protein Unlöslichkeit regulieren. Mehrere Eingriffe reduziert wie Insulin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) 1 Signalisierung (IIS) haben gezeigt, dass C. Elegans Altern14erheblich verzögern. Langlebigkeit-Wege induzieren oft Protein-Qualitätskontrolle-Mechanismen und damit diese Wege könnten aktiv beeinflussen die Rate der Proteinaggregation. Als Beispiel zeigen wir Ihnen reduzierte inhärenten Proteinaggregation in langlebigen Tiere auf Hemmung der IIS-Pfad-7.

Protokoll

Hinweis: Zum besseren Verständnis des Verfahrens, ist eine schematische Darstellung des Workflows (Abbildung 1) befestigt.

1. Wachstum von großen Zahlen von Jugendlichen und im Alter von C. Elegans unterzogen um RNAi gezielt ein Gen von Interesse

Hinweis: Verwendung C. Elegans temperaturbedingte sterile gon-2(q388) Mutanten (CF2253), große Alter synchronisiert Populationen zu erhalten. Bei allen Arbeitsschritten ist es wichtig, unter semi-sterilen Bedingungen mit einer offenen Flamme zu arbeiten und zu prüfen, dass keine Verunreinigungen (z. B. mit Pilzen oder Bakterien) vorhanden sind. Führen Sie die Schritte (auch Centrifugations) bei Raumtemperatur, wenn die Temperatur nicht beschrieben wird.

  1. Vorbereitung von C. Elegans gon-2(-) Mutanten Gonade-weniger Tiere zu erhalten
    Hinweis: Um sterile Tiere fehlen der Gonaden zu erhalten, muss die Verlustfunktion-Mutation in der Elterntiere induziert werden durch die Verlagerung dieser bei der letzten Larvenstadium (L4) bis 25 ° C mütterliche Beitrag zur Vermeidung.
    1. Erste Erweiterung von gon-2(-) Tieren, elterliche Generierung für Temperaturverschiebung zu sammeln
      1. Streak Escherichia coli OP50 Stamm auf einen Teller Lysogeny Brühe (LB) und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 ° C.
      2. Am nächsten Tag 200 mL LB-Medium mit einem OP50 Klon zu impfen und es über Nacht bei 37 ° c inkubieren
      3. Der nächste Tag Samen 15 hohen Wachstum (HG) mittlere Platten (Durchmesser 9 cm) mit 0,5 mL OP50 und OP50 mit einem Spatel verteilen. Die Platten für zwei Tage bei Zimmertemperatur aufbewahren.
      4. Brocken Sie gon-2(-) Tiere (nicht ausgehungert nach den letzten beiden Generationen) auf 15 HG mittlere Teller mit OP50 ausgesät und pflegen sie bei 20 ° C, bis die Platten konfluierende mit Erwachsenen sind und einige OP50 noch vorhanden ist.
      5. In der Zwischenzeit Samen 60 HG mittleren Platten mit OP50 wie unter Schritt 1.1.1.3 und die Platten bei Zimmertemperatur aufbewahren. Achtung: Ausgesät Platten sollte nicht mehr als eine Woche aufbewahrt werden, wie Agar bei Raumtemperatur knackt.
      6. Bleichen Sie konfluierende Platten, sobald die meisten Erwachsenen anfangen, wie zuvor beschrieben15Eier zu legen. Sammeln von Eiern in zwei 15 mL-Tuben und legen Sie auf ein Nutating-Mixer über Nacht bei 20 ° C.
      7. Die nächste Tag Wäsche geschlüpft L1s mit M9 Puffer (85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4): Zentrifuge bei 3.000 x g für 30 s, verwerfen der Überstand und Füllung bis zu 15 mL-Markierung mit M9. Zentrifugieren, überstand verwerfen, und wiederholen Sie den Schritt 1.1.1.6. Füllen Sie die Rohre mit den daraus resultierenden Wurm Pellets bis zu 15 mL-Markierung mit M9.
      8. Bewerten Sie die Gesamtzahl der L1s mit einem Mikroskop Dissektion durch zählen der L1s vorhanden in 2 µL Tropfen auf nicht ausgesät Agarplatten gelegt. Durchschnitt der Zahlen von mindestens neun Tropfen.
      9. Fügen Sie 6.500 L1s pro ausgesät HG Platte und lassen Sie die Würmer wachsen bei 20 ° C bis L4-Stadium.
    2. Zweite Erweiterung der gon-2(-) Tiere, Gonade-weniger Tiere für Experiment zu erhalten
      1. Verschieben Sie in L4-Stadium die Würmer von Schritt 1.1.1.9 um 25 ° C, bis sie beginnen, Eier zu legen und L1s schlüpfen.
      2. Sammlung von Eiern und L1s durch sedimentation
        Hinweis: Nachdem die Temperaturverschiebung bis 25 ° C ist es vorzuziehen, Sedimentation als sanfte Technik verwenden, um die fragile Eiern und L1s von den Erwachsenen zu trennen.
        1. Waschen Sie die Platten mit M9 mit 5 mL M9 auf fünf Platten. Übertragen Sie die Würmer in 50 mL Röhrchen.
        2. Füllen Sie alle Röhren mit M9 45 mL auffuellen, lassen Sie die Erwachsenen Sediment für ca. 10 min sammeln Sie jeden Überstand in ein 50 mL-Tube und wiederholen Sie diesen Schritt mit dem Pellet. Zentrifugieren Sie den Überstand, der Eiern und L1s 3.000 x g für 1 min enthält und entfernen Sie den Überstand zu, bis 15 mL übrig lassen Sie L1s Sediment für ca. 10 min.
          Hinweis: Dies ist ein entscheidender Schritt. Entfernen Sie nicht des Überstands zu früh, um möglichst viele L1s wie möglich zu sammeln.
        3. Legen Sie die Röhrchen mit Eiern und L1s auf einem Nutating Mixer über Nacht bei 25 ° C.
  2. Flüssigkultur Gonade-weniger Tiere, junge und alte Tiere ausgesetzt RNAi gezielt ein Gen des Interesses zu sammeln
    Hinweis: Die Beantwortung einiger Gene RNAi kann temperaturabhängig als zuvor beschriebenen16sein. Als Alternative zu RNAi könnte ein mutiertes Gen in den gon-2(-) Hintergrund aufgenommen werden.
    1. Vorbereitung der Bakterien für die Flüssigkultur
      1. Bereiten Sie OP50 und RNAi Bakterien (Bakterien produzieren die gewünschten DsRNA und Bakterien mit der leeren Vektor als Steuerelement) durch impfen 4 L LB-Medium mit 12 mL die jeweilige Bakterienkultur (die RNAi eine Endkonzentration von 50 µg/mL Carbenicillin und 1 mM IPTG hinzufügen Bakterienkulturen) und inkubieren sie bei 37 ° C über Nacht bei 180 Umdrehungen pro Minute.
      2. Ernten Sie am nächsten Tag die Kulturen bei 6.700 x g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie die Überstände und Aufschwemmen Sie jedes Pellet in 60 mL eiskaltes S basale Medien (100 mM NaCl, 50 mM Kalium Phosphat pH 6, gehalten auf dem Eis). Die drei resuspendierte Pellets (OP50, Steuern, RNAi Bakterien und RNAi Bakterien für das gen des Interesses) bei 4 ° C bis Schritt 1.2.2 und 1.2.3.
        Hinweis: Würmer können auf RNAi von L1 Bühne angebaut werden (siehe Punkt 1.2.3) oder zur Vermeidung von Entwicklungsschäden aus dem letzten Larvenstadium L4 (siehe Punkt 1.2.2).
    2. Flüssigkultur für die Behandlung mit RNAi beginnend am letzten Larvenstadium L4
      1. Fügen Sie 200 mL S basale Medien in einem Fernbach Kultur Kolben (Kapazität 2.800 mL). Für eine endgültige Kulturvolumen von 300 mL (siehe 1.2.2.4), fügen Sie 10 mM Kalium Citrat, pH 6, 3 mL Spur Metalle Lösung (5 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), 2,5 mM FeSO4, 1 mM MnCl2, 1 mM ZnSO4, 0,1 mM CuSO4), 3 mM MgSO4 , 3 mM CaCl2, 100 ng/mL Carbendazim und 5 µg/mL Cholesterin). Schließen Sie die Flasche mit einem Membran-Schraubverschluss. Siehe Tabelle 1 für Rezepte von Puffern.
      2. Nehmen Sie die L1s aus 25 ° C (Schritt 1.1.2.2.3) und übertragen Sie sie auf 15 mL-Tuben. 1.900 x g für 3 min Zentrifugieren Sie, entfernen Sie überstand zu und zählen Sie die L1s pro 2 µL wie in Schritt 1.1.1.8. Fügen Sie 500.000 L1s in den Fernbach Kultur Kolben im vorherigen Schritt vorbereitet.
      3. Fügen Sie OP50 (aus Schritt 1.2.1) proportional zur Anzahl der Würmer. Fügen Sie z. B. für 500.000 Würmer 60 mL OP50.
      4. Komplette Wurm Kultur mit S basale bringen das Gesamtvolumen auf 300 mL. Inkubieren Sie die Wurm-Kultur bis L4-Stadium bei 25 ° C in einem schütteln Inkubator mit 150 u/min.
      5. Am nächsten Tag sollte die Würmer die Größe der Wildtyp L4s. Zum Ändern von OP50 RNAi Bakterien sammeln Tiere in sechs 50 mL-Tuben, lassen Sediment und Entfernen des Überstands. Waschen Sie die L4s mit M9, passives OP50 Bakterien zu entfernen: 1900 X g für 3 min Zentrifugieren, überstand zu entfernen und alle L4s in einem 50 mL-Tube übertragen. Zählen Sie die L4s pro 5 µL (mindestens neun Mal). Zwei Mal 50.000 L4s sind notwendig für die junge Wurm-Sammlung und zwei mal 100.000 L4s sind für die Sammlung alter Wurm benötigt.
      6. Bereiten Sie vier Fernbach Kulturflaschen wie 1.2.2.1 beschrieben. Fügen Sie auch eine Endkonzentration von 50 µg/mL Carbenicillin und 1 mM IPTG zu jedem Kolben.
      7. Fügen Sie Steuerelement RNAi Bakterien und RNAi Bakterien für das gen des Interesses (aus Schritt 1.2.1) proportional zu der Anzahl der Würmer: 7 mL der jeweiligen Bakterien pro Flasche für junge Würmer und 14 mL pro Flasche für die gealterte Würmer hinzufügen.
      8. Fügen Sie 50.000 Würmer pro Flasche für die junge Wurm-Sammlung und 100.000 Würmer pro Flasche für die Sammlung alter Wurm und vervollständigen Sie die Kulturen mit basalen S, bis zu 300 mL zu füllen. Inkubieren Sie die Wurm-Kulturen (vier insgesamt) bei 25 ° C und 150 u/min.
    3. Flüssigkultur für die Behandlung mit RNAi L1 Stadium ab
      1. Bereiten Sie vier Fernbach Kulturflaschen wie 1.2.2.1 unter und fügen Sie eine Endkonzentration von 50 µg/mL Carbenicillin und 1 mM IPTG.
      2. Fahren Sie mit der Vorbereitung der L1s wie in 1.2.2.2 beschrieben. Insgesamt sind 300.000 Würmer musste sie in vier Fläschchen zu unterteilen.
      3. Fügen Sie Steuerelement RNAi Bakterien und RNAi Bakterien für das gen des Interesses (aus Schritt 1.2.1) proportional zu der Anzahl von Würmern wie unter Schritt 1.2.2.7 und berücksichtigen auch die Wachstumsphase zwischen L1 und L4-Stadium: Hinzufügen der jeweiligen Bakterien pro Flasche für junge w 13 mL ORMs und 26 mL pro Flasche für die gealterte Würmer.
      4. Weiter wie in Schritt 1.2.2.8 beschrieben.
    4. Wartung von C. Elegans flüssige Kulturen
      1. Ein Aliquot von jedem Flüssigkultur und Ort regelmäßig zu sammeln, auf einen Objektträger (alternativ auf einer Nährbodenplatte) um sicherzustellen, dass keine Verunreinigungen gibt. Prüfen Sie eine Dissektion Mikroskop, die bakterielle Essen in der Kultur vor allem während der Wachstumsphase. Bereiten Sie im Voraus 2 L Kulturen des Steuerelements RNAi Bakterien und RNAi Bakterien für das gen des Interesses wie unter Punkt 1.2.1 beschrieben. Fügen Sie diese in C. Elegans flüssige Kulturen bei Bedarf und halten Sie den Rest bei 4 ° C.
      2. In regelmäßigen Abständen zu überprüfen, dass die Tiere steril sind. Die meisten Tiere haben keine Gonade. Je nach die Penetranz der Mutation Gon-2 einige möglicherweise Gonaden Strukturen abgebrochen haben, aber keine Tiere mit Eiern sollten beachtet werden.
  3. Sammlung von jungen und alten Würmer RNAi in Flüssigkultur ausgesetzt
    Hinweis: Die folgenden Schritte sind für eine Flüssigkultur Kolben aber beide Kulturen im gleichen Alter mit Steuerung und RNAi Bakterien für das gen des Interesses sollten zusammen verarbeitet werden.
    1. Sammeln Sie junge Würmer am Tag 2 oder Tag 3 basalen Niveau des Proteins Unlöslichkeit messen. Im Alter von Würmern sollte (spätestens) genommen werden, wenn die Hälfte der Bevölkerung ist gestorben. Um dies festzustellen, sind tot und lebendig Würmer in einige Tropfen flüssigen Kultur auf einer Nährbodenplatte platziert gezählt. Kennzahlen werden über mindestens neun Tropfen gemittelt.
    2. Die folgenden Reagenzien vorzubereiten: 1 L M9, 1 L M9 mit 0,01 % Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9) und 40 mL 60 % Saccharose in DdH2O. halten die Reagenzien auf Eis.
    3. Gießen Sie die Würmer aus einer Flasche in einen Trichter, Trennung und lassen Sie die Würmer Sediment für 10 min bei Raumtemperatur. Öffnen Sie den Absperrhahn und tropft die Würmer in einem 50 mL-Tube.
    4. Der Wurm Pellet in zwei 15 mL-Tuben aufgeteilt und Zentrifugieren bei 1.900 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Um die Würmer zu waschen, entfernen Sie den Überstand und füllen Sie bis zu 15 mL mit M9. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Schließlich die Würmer auf zwei 50 mL Röhrchen übertragen und auf 20 mL Gesamtvolumen mit eiskalten M9 auffüllen.
    5. Entfernen Bakterien und toten Würmer, fügen Sie die beiden 20 mL verdünnt Wurm Pellets, zwei 50-mL-Röhrchen gefüllt mit 20 mL eiskaltes 60 % Saccharose. Zentrifugieren Sie schnell bei 2.700 x g für 5 min bei Raumtemperatur, 9 Beschleunigung und Abbremsung 7. Entfernen Sie vorsichtig die obere Wurm-Schicht mit einem großen Pipettieren (25 mL). Nehmen Sie bis zu 15 mL (aber weniger, wenn es gibt offensichtlich eine Menge Tote Würmer). Setzen Sie diese direkt in 37 mL M9 + Octoxynol-9 (3 Tuben pro Saccharose Rohr) auf Eis zubereitet. Zentrifugieren Sie bei 2.700 x g für 3 min bei Raumtemperatur, Beschleunigung, 9 und 7 Verzögerung.
      Hinweis: Beide müssen eiskalt sein; Ansonsten funktioniert die Trennung nicht. Nicht mischen! Da Saccharose giftig für die Würmer ist ist es wichtig, schnell für den folgenden Schritt zu sein.
    6. Teilen Sie das Pellet in vier 15 mL-Tuben und waschen zweimal mit eiskalten M9 + Octoxynol-9: Zentrifuge bei 1.900 x g für 1 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie überstand, füllen Sie bis 15 mL-Markierung mit eiskalten M9 + Octoxynol-9 und Prozedur wiederholen.
    7. Einmal waschen mit eiskalten M9 und kombinieren die vier Röhren, zwei Röhren. Mit M9 bei Raumtemperatur zu einem Gesamtvolumen von 4 mL in 15 mL-Tuben füllen und auf dem Nutating bei 25 ° C für 40 min. drehen.
      Hinweis: Dadurch werden die Würmer, alle verbleibenden Bakterien im Darm zu verdauen. Überprüfen Sie die Würmer unter dem Mikroskop zu sehen, dass es keine Toten.
    8. Waschen Sie die Würmer zweimal mit eiskalten M9 + Octoxynol-9, wie in 1.3.5 beschrieben. Waschen Sie zweimal mit M9 und übertragen Sie die Würmer auf einem Rohr.
    9. Waschen Sie die Würmer einmal in dem Zusammenbau (RAB) hohem Salzgehalt Extraktionspuffer ohne Inhibitoren (0,1 M 4-Morpholineethanesulfonic Säure (MES), 1 mM Ethyleneglycoltetraacetic Säure (EGTA), 0,1 mM EDTA, 0,5 mM MgSO4, 0,75 M NaCl 0,02 M Natriumfluorid (NaF)) vor der Abholung. Entfernen Sie den Überstand erst gibt es keine Flüssigkeit auf den Wurm Pellet.
      Hinweis: Dieser Schritt und die nächste sollte schnell getan werden, um Artefakte in den Würmern verursacht durch die hohe Salzkonzentration im Puffer zu vermeiden.
    10. Schätzen Sie das Volumen der Wurm Pellet und fügen Sie eine identische Volumen von RAB mit Inhibitoren (2 x Protease-Inhibitor-Cocktail). Mit einer Pasteurpipette, zeichnen sich die Würmer und tropft langsam in ein 50 mL-Tube, die Hälfte mit flüssigem Stickstoff in Trockeneis gelegt gefüllt. Lassen Sie den flüssigen Stickstoff verdampft und die gefrorenen Würmer bei-80 ° C bis zur Weiterverarbeitung zu lagern.
      Achtung: Flüssiger Stickstoff ist bei einer sehr niedrigen Temperatur; angemessenen Schutz zu tragen.

(2) unlöslichen Protein Extraktion mit jungen und alten Tieren ausgesetzt RNAi gezielt ein Gen des Interesses

  1. Störung der Tiere, die in Schritt 1.3 gesammelt
    Hinweis: Es ist wichtig, zu vermeiden alle Auftauen der Wurm Proben. Der Mörtel mit flüssigem Stickstoff abgekühlt und führen die komplette Prozedur auf Trockeneis.
    Achtung: Flüssiger Stickstoff ist bei einer sehr niedrigen Temperatur; angemessenen Schutz zu tragen.
    1. Die gefrorenen Würmer auf den vorgekühlten Mörtel übertragen und für 2,5 min. mahlen.
      Hinweis: Achten Sie beim Schleifen: zu Beginn, die gefrorenen Würmer sind in kleine Kugeln und es ist leicht, sie zu verlieren.
    2. Flüssiger Stickstoff (ca. 100 mL) hinzu kommt das Pulver wieder abkühlen und Schleifen für eine weitere 2,5 min. Check mit dem Mikroskop, dass der Wurm Körper gebrochen sind. Übertragen Sie das Pulver in 2 mL-Tuben und bei-80 ° c aufbewahren
  2. Schnelle unlöslichen Protein Extraktion für Western-Blot Analyse
    Hinweis: Verwenden Sie diese Methode, um die Gesamt-Protein Inhalt und unlöslichen Protein Ebenen zwischen den verschiedenen Tagen mit und ohne RNAi gezielt das gen des Interesses zu vergleichen. Führen Sie alle Schritte bis zum Schritt 2.2.3 auf Eis!
    1. Solubilisieren 50 mg geschliffene Schnecken aus Schritt 2.1 mit 150 µL Tests (RIPA) Testpuffer (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5 % Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS), 0,5 % Natrium Deoxycholate (SDO), 1 % Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF), 1 x Protease-Inhibitor-Cocktail). Homogenisieren der Suspension mit einer 1 mL Spritze mit grauen Nadel (27 x ½", 0,4 mm x 13 mm); Aufstellen der Suspension 10 Mal.
    2. Zentrifuge bei 18.400 x g für 20 min bei 4 ° C. Den Überstand zu sammeln.
    3. Aufschwemmen Sie das Pellet in 100 µL RIPA Puffer und Zentrifuge 18.400 x g für 20 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den Überstand, drehen Sie kurz und achten Sie darauf, um übrig gebliebene überstand zu entfernen.
    4. Um die sehr unlösliche Proteine zu solubilisieren, Aufschwemmen Sie das Pellet in 75 µL Harnstoff/SDS Puffers (8 M Harnstoff, 2 % SDS, 50 mM Dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8) und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Um den Gesamtproteingehalt zu analysieren, kombinieren Sie die ersten RIPA aus Schritt 2.2.2 überstand und der Harnstoff/SDS Pellet Wiederfreisetzung. Um für die Volumes verwendet für die Extraktion zu berücksichtigen, sollte die gesamte Fraktion RIPA überstand zwei Drittel und ein Drittel der Harnstoff/SDS Pellet Bruchteil enthalten. Überprüfen Sie auf einem kleinen 4-12 % Steigung Gel das Niveau der unlöslichen Protein durch Laden 9 µL der Harnstoff/SDS-Fraktion und 4 µL kombinierte Gesamtprotein. Führen Sie eine Gesamt-Protein Fleck Färbung um die Protein-Ebene zu überwachen. Durch Western Blot mit spezifischen Antikörpern, Änderungen in Unlöslichkeit für einzelne Proteine durch Massenspektrometrie quantifiziert überprüfen (siehe Abschnitt 3).
  3. Unlösliche Proteingewinnung SDS-unlösliche Proteine für die Massenspektrometrie isolieren
    Hinweis: Führen Sie alle Schritte auf dem Eis.
    1. Auf Trockeneis Mal wiegen zwei 350 mg geschliffene Schnecken pro Zeitpunkt und RNAi Bakterien (junger und Alter Würmer kontrollieren RNAi Bakterien und RNAi Bakterien für gen von Interesse) in 2 mL Röhrchen.
    2. Um die hohem Salzgehalt lösliche Proteine zu entfernen, fügen Sie zwei Bände von RAB pro Gewicht (700 µL) mit Inhibitoren, 1 mM PMSF, 200 U/mL DNase I und 100 µg/mL RNase A zu jedem tube und lösen das Pulver auf dem Eis. Erarbeiten der Suspension in eine 1 mL Spritze (graue Nadel, 27 x ½", 0,4 mm x 13 mm) 15 Mal und auf Eis für 10 min. Zentrifuge 18.400 x g für 20 min bei 4 ° c inkubieren Gehen Sie durch die Fettschicht und sammeln Sie den Überstand mit hohem Salzgehalt lösliche Proteine in einer 2 mL-Tube pro Zustand (insgesamt vier Röhren). Das Fett zu entfernen und entsorgen. Aliquoten hohem Salzgehalt lösliche Proteine zu frieren bei-80 ° C.
    3. Um Lipide zu verwerfen, anderweitig das Pellet mit 700 µL RAB mit Inhibitoren mit 1 M Saccharose (ohne DNase I und RNase A). Erarbeiten der Suspension in eine Spritze 10 Mal und auf Eis für 5 min. Zentrifuge 18.400 x g für 20 min bei 4 ° c inkubieren Achten Sie darauf, alle überstand und Lipide entfernen und entsorgen.
    4. Um SDS-lösliche Proteine zu entfernen, lösen Sie das Pellet mit 700 µL RIPA Puffer. Erarbeiten der Suspension in eine Spritze 10 Mal und inkubieren Sie es für 10 min auf Eis. Zentrifuge bei 18.400 x g für 20 min bei 4 ° C. Sammeln des Überstands mit SDS-lösliche Proteine und Aliquot für das Einfrieren bei-80 ° C.
    5. Bündeln Sie zwei Proben von jedem Zustand zusammen nach jedes Pellet mit 500 µL RIPA Puffer Gefäss-. Aufstellen der Suspension in eine Spritze 10-Mal. Zentrifuge bei 18.400 x g für 20 min bei 4 ° C. Achten Sie darauf, alle überstand entfernen und entsorgen es.
      Hinweis: Das Ziel der Extraktion ist die unlösliche Proteine die löslichen Proteine getrennt. Daher ist es wichtig, alle restlichen RIPA überstand vor dem Hinzufügen von Ameisensäure im nächsten Schritt zu entfernen.
    6. Solubilisieren Sie die endgültige Pellet mit sehr unlösliche Proteine mit 400 µL 70 % Ameisensäure und erarbeiten Sie die Aussetzung in eine Spritze 20 Mal. Inkubieren Sie für 20 min auf Eis. Zentrifugieren Sie bei 50.000 x g für 20 min bei 4 ° C, 3 Beschleunigung und Verzögerung 5, Wurm Kutikula Ablagerungen zu entfernen. Sammeln des Überstands, der sehr unlösliche Proteine enthält und bei-80 ° c eingefroren
    7. Dialyse von unlöslichen Proteinfraktionen für die Massenspektrometrie
      Hinweis: Dialyse bei 4 ° C.
      1. 8 L-Dialyse-Puffer (50 mM Tris, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, pH 7,5) vorzubereiten und zu acht 1 L Becher dividiert. Platzieren Sie drei Membranen (Membranfilter = 0,025 µM) auf der Oberfläche der Puffer für jede 1 L Becher.
      2. Pro Membran laden Sie sorgfältig 65 µL des unlöslichen Proteins in Ameisensäure in Schritt 2.3.6 erhaltenen solubilisiert. Jede Bedingung gliedert sich in sechs Membranen.
      3. Überprüfen Sie den pH-Wert einer Probe von 5 µL entfernen und fügen ihn auf einen pH-Streifen. Wenn der pH-Wert zwischen 7 und 8 (nach ca. 2 h), sammeln der Probenmaterials durch Pipettieren sanft rauf und runter. Schließlich verwenden Sie 10 µL-Dialyse-Puffer, um den Niederschlag aus jede Membran zu waschen. Einfrieren der Proben bei-80 ° C.

3. umfassende Identifizierung und Quantifizierung der Änderungen im Protein Unlöslichkeit mit zunehmendem Alter induziert durch RNAi gezielt ein Gen des Interesses

  1. Vorbereitung auf Mass Spectrometry Analyse
    1. Bewerten Sie die Menge an unlöslichen Proteine in den dialysierten Proben durch das Laden einer Aliquoten auf ein 4-12 % Steigung Gel zusammen mit einer Referenzprobe bekannter Konzentration. Führen Sie eine Gesamt-Protein Gel Färbung und quantifizieren Sie die Protein-Menge mit einer Bildanalyse-Software. Dieser Schritt ist notwendig, die Menge von Trypsin benötigt für die Verdauung (Schritt 3.1.4) zu schätzen.
    2. Konzentrieren Sie die Proben unter Verwendung eines Kreiselpumpen Verdampfers zu und solubilisieren Sie die unlösliche Proteine in einer Endkonzentration von 8 M Harnstoff.
    3. Alkylierung und Reduzierung
      1. Fügen Sie Tris(2-carboxyethyl) Phosphin-Hydrochlorid (DÄMMUND), eine Endkonzentration von 4 mM auf die Proben. 1 h bei 57 ° C mit 300 u/min inkubieren. Setzen Sie die Proben auf Raumtemperatur.
      2. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 8,4 mM Iodoacetamide. Inkubieren sie 45 min (2 h inkubiert werden) im Dunkeln bei Raumtemperatur.
      3. Verdünnen Sie die Proben in 150 mM Ammonium Bicarbonat, eine Endkonzentration 2 M Harnstoff zu erhalten.
    4. Digest-Proteine mit 5 % w/w verändert Trypsin über Nacht bei 37 ° C und 400 u/min.
    5. Laden Sie eine Probe der verdaute Proteine auf einem 12 % SDS-Gel und führen Sie eine Gesamt-Protein Gel Färbung zu analysieren, ob die Verdauung funktioniert. Noch gibt es einige Bands anwesend, wiederholen Sie die Schritte 3.1.4 und 3.1.5.
    6. Peptide aus jungen und alten Kontroll- und RNAi behandelt C. Elegans sind mit Isobaren Tags für relative und absolute Quantifizierung nach den Anweisungen des Herstellers gekennzeichnet.
      Hinweis: Alternativ könnte andere Methoden zur Kennzeichnung der Peptide oder Proteine zur Quantifizierung z. B. Tandem mass Tags verwendet werden.
      Hinweis: Mass Spectrometry Analyse: zum Beispiel Komplexität zu reduzieren, sollten Peptide in verschiedene Fraktionen für Massenspektrometrie Analyse5durch starke Kationenaustausch-Chromatographie getrennt werden. Einige Massenspektrometer sind in der Lage analysieren isobare Tags für relative und absolute Quantifizierung wie17an anderer Stelle beschrieben. Die gewonnenen Daten sollten mit der entsprechenden Software verarbeitet werden. Alles in allem ermöglicht diese Analyse die Identifikation von hoch unlösliche Proteine und deren Veränderungen nach Alter und nach Proteostase Modulation.

4. in Vivo Evaluierung des Einflusses eines Gens von Interesse auf die Aggregation Muster während der Alterung

  1. Wählen Sie aus der Massenspektrometrie Analyse in Abschnitt 3 eine altersabhängige Aggregation neigende Protein, die in unterschiedlichem Ausmaß in die Tiere ausgesetzt RNAi ansammelt. Generieren von transgenen C. Elegans Linien mit dem Ausdruck dieses Proteins markiert mit einem fluoreszierenden Protein und unter der Kontrolle der jeweiligen Veranstalter oder einen gewebespezifischen Promoter (siehe Diskussion für die Wahl einer geeigneten Förderer). Halten Sie die Dehnung bei 15 ° C mittels standardisierter Techniken auf Nematoden Wachstum (NG) Platten mit OP50 ausgesät. Zum Beispiel wählten wir einen Wurm-Stamm mit dem Ausdruck Polyadenylate-bindendes Protein (PAB-1) verschmolzen am N-Terminus, TagRFP unter der Kontrolle der pharyngealen Muskulatur Promotor Pmyo-2.
  2. In Vivo Bewertung der Veränderungen beim Aggregation mit dem Alter nach Hemmung des Gens von Interesse
    1. Ein bis zwei Tage im Voraus vorbereiten NG/Carbenicillin (Carb) / IPTG Platten mit einer Steuerung (leerer RNAi Vektor L4440) Bakterien und RNAi Bakterien, das gen des Interesses zu hemmen. (Für ein detailliertes Protokoll über RNAi in C. Elegans siehe Jupiter Science Education Database. Grundlagen der Biologie 1: Hefe, Drosophila und C. Elegans. RNAi in C. Elegans. Jupiter, Cambridge, MA, Doi: 10.3791/5105 (2017)).
    2. Ort eierlegende Würmer auf mehrere separate für RNAi Behandlung von L1 Nutsteine NG/Carb/IPTG (6 cm Durchmesser) mit RNAi oder RNAi Bakterien für das gen des Interesses bei 20 ° c ausgesät Entfernen Sie die Erwachsenen nach 2 h, halten die Nachkommen bei 20 ° C. Zur Vermeidung von Entwicklungsschäden können RNAi-Behandlungen nach dem Larvenstadium L4 gestartet werden.
    3. Sobald die Nachkommen der L4 Larvenstadium erreicht, übertragen Sie diese L4s auf neue NG/Carb/IPTG Teller ausgesät mit RNAi oder RNAi Bakterien für das gen des Interesses. Neun Platten mit 15 transgene für beide Bedingungen richten Sie ein und halten sie bei 20 ° C. Die Alterung Würmer Weg von ihren Nachkommen zu neuen Platten jeden zweiten Tag bis zum Ende ihrer reproduktiven Periode übertragen werden müssen um sie von ihren Nachkommen unterscheiden zu können.
    4. Bewerten Sie Veränderungen in der Verteilung der Aggregation neigende Protein mit einer fluoreszierenden Tag unter einem fluoreszierenden Stereo-Mikroskop mit 24 X Vergrößerung im Erwachsenenalter, jeden zweiten Tag markiert.
      Hinweis: Die altersabhängigen Ansammlung Aggregation neigende Proteins in hellen Puncta dient als einen Ausdruck für die Aggregation. Diese Puncta sollte sehr unbeweglich Strukturen als Zuschlagstoffe charakterisiert werden. Dies sollte durch Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz (FRAP) mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie bestimmt werden. Für aggregierte Protein sollte keine Erholung nach mindestens 4 min5,18in der gebleichten Region beobachtet werden. Um die Veränderungen mit dem Alter zu quantifizieren, erzielten wir die Verteilungsmuster der Alter synchronisiert Worms überexprimierenden PAB-1 am Tag 2, Tag 5 und 7. Tag des Erwachsenenalters wie folgt: niedrige Aggregationsebenen (0-10 tagRFP::PAB-1 Puncta im hinteren Rachenraum Birne), mittlere Aggregationsebenen (mehr als 10 Puncta in den hinteren Rachenraum Birne) und hohen Aggregationsniveaus (mehr als 10 Puncta in der vorderen pharyngealen Birne).

Ergebnisse

Wir verwendet um wie langlebigen Tiere mit bewerten hier vorgestellten Methoden reduzierte IIS modulieren altersabhängigen Proteinaggregation. Durch Western blot (siehe Punkt 2.2, schnell unlöslichen Protein Extraktion für Western-Blot Analyse), analysiert die Summe und die unlösliche Eiweißgehalt von Young (Tag 3 des Erwachsenenalters) und im Alter von (18. Tag des Erwachsenenalters) Würmer auf Kontrolle RNAi und RNAi gezielt das Insulin / IGF-1-Like-Rezeptor Daf-2. Wir be...

Diskussion

Hier berichten wir über eine Methodik zu isolieren, hoch-unlösliche Aggregate aus Altern C. Elegans RNAi durch Massenspektrometrie und Western blotting für Analyse unterzogen. Wir zeigen, dass Verbesserung Proteostase durch Reduzierung der IIS stark altersabhängig Proteinaggregation verhindert. Wenn Sie spezifische Aggregation neigen Proteine, in C. Elegansoverexpress auswählen, ist es möglich, weitere Mechanismen, die Modulation der inhärenten Proteinaggregation sezieren.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von DZNE und ein Marie-Curie-International Wiedereingliederungsbeihilfe (322120, D.C.D.)

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Fernbach culture flask Corning4425-2XLPyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap Schott1088655GL45
Nutating MixerVWR444-0148
Separatory funnelNalgene4300-1000Capacity 1,000 ml
1 ml syringe BD Plastipak300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mmBD Microlance 3300635
Membrane filters 0.025 µMMilliporeVSWP04700
pH stripMachery-Nagel92110pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001Complete Mini EDTA-free tablets 
Octoxynol-9 ApplichemA1388Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichM1317
NonylphenylpolyethylenglycolApplichemA1694Nonidet P40 (NP40)
DNaseIRoche04716728001recombinant, RNase free
RNaseAPromegaA7973solution
Total protein blot stainingThermofisherS11791Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel stainingThermofisherS12001Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)Serva36970
IodoacetamideServa26710
AmmoniumbicarbonateSigma-Aldrich09830
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitationSciex4352135iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XPBeckmann Coulter393126
Ultracentrifuge Optima Max-XPBeckmann Coulter393315
Centrifuge 5424REppendorf5404000413
Centrifuge 5702Eppendorf5702000329
Centrifuge Megafuge 40RThermo Scientific75004518
Concentrator PlusEppendorf5305000304Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC LeicaWith Planapo 2.0x objective
Dissection microscopeLeica Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1ZeissWith PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis softwareImageJ
Analysis of mass spectrometry dataProtein Prospectorhttp://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50CGC
RNAi bacteria
L4440Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253CGC, strain name: EJ1158 Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]

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