JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Цель метода, представленные здесь заключается в изучении агрегации белков во время нормального старения в организме модель C. elegans. Протокол представляет собой мощный инструмент для изучения весьма нерастворимых большие компоситы, которые формируют с возрастом и определить, как изменения в proteostasis воздействия агрегации белков.

Аннотация

В последние десятилетия распространенность нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера (AD) и болезнь Паркинсона (PD), выросла. Эти расстройства, связанные с возрастом характерно появление белка агрегатов с фибриллово структурой в мозгах у этих больных. Почему именно обычно растворимые белки проходят процесс агрегации по-прежнему осознаются. Открытие, что агрегации белков не ограничивается процессов болезни и вместо этого частью нормального процесса старения включает изучение молекулярных и клеточных механизмов, которые регулируют агрегации белков, без использования ectopically выразил человека болезни связанных белков. Здесь мы описываем методологии для изучения присущих белка агрегации в Caenorhabditis elegans через взаимодополняющих подходов. Во-первых мы изучим как выращивать большое количество синхронизированы возраст C. elegans для получения возрасте животные и мы представляем биохимическими процедурами изолировать высоко нерастворимые большие компоситы. В сочетании с целенаправленной генетических нокдаун, это позволяет вскрыть роль гена интереса к содействию или предотвращения агрегации белков зависит от возраста с количественного масс-спектрометрии с помощью либо всеобъемлющий анализ или кандидат-анализа на основе с антителами. Затем эти выводы подтверждаются в естественных условиях анализа с трансгенных животных, выражая люминесцентной меткой подверженных агрегации белков. Эти методы должны помочь разъяснить, почему некоторые белки склонны к совокупности с возрастом и, в конечном итоге, как сохранить эти белки полностью функциональной.

Введение

Сворачиванию белков и агрегации признаются в качестве отличительной чертой нескольких нейродегенеративных заболеваний, таких как AD, PD, боковой амиотрофический склероз (ALS), frontotemporal деменции (FTD) и многие другие. К примеру α-synuclein сборок в амилоидных фибрилл, накапливаться Леви органов, особенно в Substantia PD больных, в то время как в ALS пациентов TDP-43 или Фу misfold к форме цитоплазматических агрегатов в вырождающихся двигательных нейронов. В каждом из этих нейродегенеративных расстройств механизмы поддержания гомеостаза белка или proteostasis не сможем предотвратить накопление смятых протеинов, следовательно, приводит к болезни.

Proteostasis имеет решающее значение для обеспечения клеточных функций, и в нормальных условиях эти механизмы регулирования плотно контролировать скорость синтеза белка, складные и деградации. Несколько исследований показывают, что с возрастом, постепенно нарушается способность многих клеток и органов сохранить гомеостаз белка и физиологические ухудшение proteostasis сетей с возрастом является важным фактором, усугубляющим нейродегенеративные заболевания (Обзор ссылки1,2,3). Тот факт, что контроль качества белков и клеточного ответа на стресс развернулось белка затрудняется с возрастом свидетельствует о том, что общим следствием старения может быть сворачиванию белков и агрегации. Действительно мы и другие показали, что агрегации белков не ограничивается болезни и вместо этого частью протеома становится весьма моющих средств нерастворимые в возрасте животных4,5,6,7 ,8,9,10. Вычислительные и в естественных условиях анализ показал, что эти физиологических возрастных агрегаты напоминают болезни агрегатов в нескольких аспектах5. Открытие эндогенные, возраст зависимых белков агрегации дает нам возможность вскрыть молекулярных и клеточных механизмов, которые регулируют агрегации белков, без использования ectopically выраженной человеческие белки, связанных заболеваний. В настоящее время о регулировании нерастворимость широко белка и о последствиях этой регуляции на состояние здоровья организма существует лишь ограниченная информация.

Нематоды C. elegans является одним из наиболее подробно изученных модельных организмов в процессе старения исследований, как эти животные имеют относительно короткий срок и показать многие черты характерные старения, наблюдается в высших организмов. Последствия старения на белок нерастворимость в C. elegans , изучен последовательных биохимических фракционирования, на основе дифференциальных растворимость, который широко используется для извлечения болезни агрегатов в области исследований нейродегенеративные11 . Путем количественного масс-спектрометрии стать агрегации подверженных в C. elegans в отсутствие болезни5были показаны несколько сотен белков. Здесь мы подробно описать протокол выращивать большое количество червей в жидкой культуры и последовательное извлечение изолировать агрегированных белков для количественного определения масс-спектрометрии и анализа, Западная помарка. Потому что Протеолиз и подверженных агрегации белков накапливается в возрасте C. elegans гонад и маски изменения в другие соматические ткани5,12,13, мы используем Гонада менее мутант сосредоточиться анализ на белок нерастворимость в не репродуктивных тканях. Представлен метод позволяет анализ высоко нерастворимые, крупных агрегатов, которые нерастворимы в 0,5% SDS и гранулированных относительно низкой скоростью центробежные. Кроме того, был менее строгие протокол извлечения для сбора также меньшие и более растворимые агрегатов опубликованы в другом месте10. Кроме того мы описываем метод, используемый для оценки агрегации в естественных условиях в C. elegans.

В целом эти методы в сочетании с РНК-интерференции (RNAi) можно оценить роль гена интереса к модуляции агрегации белков зависит от возраста. Для этого мы описываем анализ выдержек из молодых и пожилых червей с и без нокдаун специфического протеина интереса, с помощью РНК-интерференции. Эти методы должны быть мощным инструментом, чтобы определить, какие компоненты сети proteostasis регулировать нерастворимость белка. Несколько мероприятий таких как снижение инсулина/инсулин подобный фактор роста (IGF) 1 сигнализации (IIS) показали значительно отсрочить старение C. elegans 14. Долголетие пути часто вызывают механизмов контроля качества протеина и таким образом эти пути могут активно влияющие на уровень агрегации белков. В качестве примера мы демонстрируем снижение присущие белка агрегации в долгоживущих животных при торможении путь IIS7.

протокол

Примечание: Для лучшего понимания процедуры, прилагается схема рабочего процесса (рис. 1).

1. рост большого числа молодых и пожилых C. elegans подвергается RNAi ориентации гена интереса

Примечание: Использование C. elegans температуры индуцированной стерильные gon-2(q388) мутантов (CF2253) для получения больших групп населения, престарелых синхронизированы. На всех этапах важно работать в полу стерильных условиях с открытым пламенем и проверка наличия без загрязнений (например, с грибками или бактериями). Выполните шаги (также centrifugations) при комнатной температуре, если температура не описано.

  1. Подготовка мутантов gon-2(-) C. elegans для получения Гонада менее животных
    Примечание: Для получения стерильной животных, не хватает гонад, потеря функции мутации должны быть вызваны в родительского животных, сдвигая их на последней личиночной стадии (L4) до 25 ° C во избежание материнской вклад.
    1. Первое расширение gon-2(-) животных для сбора родительского поколения для смены температуры
      1. Полоска Escherichia coli ОР50 напряжение на тарелку Lysogeny бульон (LB) и проинкубируйте его на ночь в 37 ° C.
      2. На следующий день инокуляции 200 мл LB средний с одной ОР50 клон и проинкубируйте его на ночь в 37 ° C.
      3. Следующий день семян 15 высокого роста (HG) среднего пластин (диаметр 9 см) с 0,5 мл ОР50 и распространять ОР50 с помощью шпателя. Держите пластин при комнатной температуре в течение двух дней.
      4. Кусок gon-2(-) животных (не голодали для последних двух поколений) на 15 HG среднего пластин семенами с ОР50 и поддерживать их при 20 ° C до тех пор, пока пластины вырожденная с взрослыми и некоторые ОР50 по-прежнему доступен.
      5. В то же время семян 60 HG средних пластины с ОР50 как описано в разделе Шаг 1.1.1.3 и держите пластин при комнатной температуре. Осторожно: Пластины в сеяный должны не храниться для более чем одной недели как агар треснет при комнатной температуре.
      6. Отбеливатель вырожденная пластин после того, как большинство взрослых начинают откладывать яйца как описано15. Собирать яйца в двух 15 мл трубы и место на nutating смеситель на ночь при 20 ° C.
      7. Следующий день мыть вылупились Л1С с M9 буфера (85 мм NaCl, 42 мм Na2HPO4·7H2O, 22 мм х2PO4): центрифуги на 3000 x g 30 s, удалить супернатант и заполнить до отметки 15 мл с M9. Центрифуги, удалить супернатант и повторите шаг 1.1.1.6. Заполните трубы с результате червь гранул до отметки 15 мл с M9.
      8. Оцените общее количество Л1С с микроскопом рассечение, считая Л1С в 2 мкл капли на плиты агара-семенами. Средние цифры, полученные из по крайней мере 9 капель.
      9. Добавьте 6500 Л1С в сеяный HG пластины и пусть червей расти при 20 ° C до стадии L4.
    2. Второе расширение gon-2(-) животных для получения Гонада менее животных для эксперимента
      1. На стадии L4 сдвиг червей от шага 1.1.1.9 до 25 ° C до тех пор, пока они начинают откладывать яйца и Л1С вылупления.
      2. Сбор яиц и Л1С путем седиментации
        Примечание: После смены температуры до 25 ° C, предпочтительно использовать седиментации как мягкий метод для разделения хрупкие яйца и Л1С от взрослых.
        1. Мыть тарелки с M9, используя 5 мл M9 в пяти плит. Перевод на 50 мл трубки червей.
        2. Заполните все трубы до отметки 45 мл с M9, пусть взрослые осадков примерно 10 мин, собирать каждый супернатант в 50 мл трубки и повторите этот шаг с Пелле. Центрифуга супернатанта, содержащий яйца и Л1С на 3000 x г за 1 мин, пусть Л1С осадков примерно 10 минут и удалить супернатант пока остаются 15 мл.
          Примечание: Это важный шаг. Не удалить супернатант слишком рано, собирать столько Л1С как можно скорее.
        3. Место пробирки, содержащие яйца и Л1С на смесителе nutating ночь в 25 ° C.
  2. Жидкий культура Гонада менее животных для сбора молодых и пожилых животных, подвергается RNAi ориентации ген интереса
    Примечание: Реакция некоторых генов РНК-интерференции может быть зависит от ранее описанных16температуры. В качестве альтернативы интерференции мутантного гена могут быть включены в gon-2(-) фона.
    1. Подготовка бактерий для жидких культуры
      1. Подготовка ОР50 и интерференции бактерий (производит желаемого двуцепочечной ДНК и бактерий с пустой вектор как управления) путем прививки среднего LB 4 L с 12 мл соответствующих бактериальной культуры (добавить конечная концентрация 50 мкг/мл carbenicillin и 1 мм ИПТГ RNAi бактериальных культур) и инкубировать их при 37 ° C ночь в 180 об/мин.
      2. Следующий день урожая культур в 6700 g x 10 мин при 4 ° C. Удаление supernatants и Ресуспензируйте каждой гранулы в 60 мл ледяной S базальной СМИ (100 мм NaCl, 50 мм калия фосфат рН 6, хранится на льду). Держите три ресуспензированы гранулы (ОР50, контролировать RNAi бактерии и бактерии RNAi для гена интереса) при 4 ° C до шага 1.2.2 или 1.2.3.
        Примечание: Червей можно выращивать на интерференции от L1 стадии (см. шаг 1.2.3) или избежать дефектов развития от последней личиночной стадии L4 (см. шаг 1.2.2).
    2. Жидкий культура для лечения с RNAi начиная наконец личиночной стадии L4
      1. Добавить 200 мл S базальной СМИ в колбе Fernbach культуры (емкость 2,800 мл). Для окончательного культуры объем 300 мл (см. 1.2.2.4), добавить 10 мм цитрат калия, рН 6, 3 мл раствора металлов трассировки (5 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 2,5 мм FeSO4, 1 мм НКД2, 1 мм ZnSO4, 0,1 мм CuSO4), 3 мм MgSO4 , 3 мм CaCl2, карбендазим 100 нг/мл и 5 мкг/мл холестерин). Закройте колбу с мембраной колпачок. Обратитесь к таблице 1 для рецепты буферов.
      2. Возьмите Л1С из 25 ° C (шаг 1.1.2.2.3) и передавать их для 15 мл пробирок. Центрифуга на 1900 x g на 3 мин, удалить супернатант и рассчитывать Л1С за 2 мкл как шаг 1.1.1.8. Добавьте 500 000 Л1С в колбу Fernbach культуры, подготовленный на предыдущем шаге.
      3. Добавьте ОР50 (от шаг 1.2.1) пропорционально на количество червей. Например для 500 000 червей добавьте 60 мл ОР50.
      4. Полный червь культуры с S базальной довести объем до 300 мл. Инкубируйте червь культуры до стадии L4 при 25 ° C в тряску инкубатор с 150 об/мин.
      5. Следующий день, черви должны быть размер одичал типа L4s. Чтобы изменить от ОР50 интерференции бактерий, собирать животных в шести 50 мл трубы, пусть отложений и удалить супернатант. Мыть L4s с M9 для удаления остаточных ОР50 бактерий: центрифуги на 1900 x g на 3 мин, удалить супернатант и передачи всех L4s в 50 мл. Граф L4s за 5 мкл (по крайней мере девять раз). Два раза 50000 L4s необходимы для коллекции молодого червя и два раза 100000 L4s необходимы для коллекции возрасте червя.
      6. Подготовка четырех Fernbach культуры колбы, как описано в 1.2.2.1. Добавьте также конечная концентрация 50 мкг/мл Carbenicillin и 1 мм ИПТГ каждый флакон.
      7. Добавьте элемент управления RNAi бактерии и бактерии РНК-интерференции для гена интереса (от шаг 1.2.1) пропорционально на количество червей: добавить 7 мл соответствующих бактерий за флакон для молодых глистов и 14 мл флакон для возрасте от червей.
      8. Добавить 50.000 червей за флакон для коллекции молодого червя и 100 000 червей за флакон для коллекции возрасте червя и завершить культур с S базального чтобы заполнить до 300 мл. Инкубируйте червь культур (четыре в общей сложности) при 25 ° C и 150 об/мин.
    3. Жидкий культура для лечения с интерференции, начиная на стадии L1
      1. Подготовка четырех Fernbach культуры колбы, как описано в 1.2.2.1 и добавить конечная концентрация 50 мкг/мл carbenicillin и 1 мм ИПТГ.
      2. Продолжайте подготовку Л1С как описано в 1.2.2.2. В общей сложности 300 000 червей необходимо разделить их на четыре колбы.
      3. Добавьте элемент управления RNAi бактерии и бактерии РНК-интерференции для гена интереса (от шаг 1.2.1) пропорциональна количество червей, как описано в разделе Шаг 1.2.2.7 и рассмотреть также фазы роста между L1 и L4 этап: добавить 13 мл соответствующих бактерий за флакон для молодых w Орма и 26 мл флакон для возрасте от червей.
      4. Продолжайте, как описано в шаге 1.2.2.8.
    4. Техническое обслуживание C. elegans жидкого культур
      1. Периодически собирать Алиготе от каждого жидкого культуры и место на слайде стекла (в качестве альтернативы на плите агар) чтобы убедиться, что есть без загрязнений. С помощью микроскопа рассечение, проверьте уровень бактериальной продовольствия в культуре особенно во время фазы роста. Заранее подготовить 2 L культуры управления RNAi бактерии и бактерии РНК-интерференции для гена интереса, как описано в пункте 1.2.1. При необходимости добавьте их в C. elegans жидкого культур и сохранить остальные при 4 ° C.
      2. Периодически проверяйте, что животные являются стерильными. Большинство животных не будет иметь гонад. В зависимости от пенетрантностью мутации ПН-2 некоторые могут прервать гонадной структур, но не животных с яйца должны соблюдаться.
  3. Коллекция молодых и пожилых червей, подвергается RNAi в жидком культуре
    Примечание: Следующие шаги все для одной колбе культур в жидкой среде, но обе культуры того же возраста с контролем и интерференции бактерий для гена интереса должны обрабатываться вместе.
    1. Собирают молодые черви на день 2 или 3 для измерения Базальные уровни белка нерастворимость. Возрасте черви должны собираться (позднее), когда половина населения умер. Чтобы определить это, живые и мертвые червей, учитываются в нескольких капель жидкого культуры размещены на плите агар. Коэффициенты усредненное по крайней мере 9 капель.
    2. Подготовка следующих реагентов: 1 L M9, 1 L M9 с 0,01% Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9) и 40 мл 60% сахарозы в ddH2O. держать реагентов на льду.
    3. Налейте червей из одной колбе в воронку разделения и пусть черви осадков за 10 мин при комнатной температуре. Открыть кран и капать червей в один тюбик 50 мл.
    4. Разделить гранулы червя на два 15 мл трубы и центрифуги на 1900 x g 5 мин при комнатной температуре. Моют червей, удалить супернатант и заполнить до 15 мл с M9. Повторите центрифугирования. Наконец передать два 50 мл трубки червей и заполнить до общего объема 20 мл с ледяной M9.
    5. Чтобы удалить бактерии и мертвых червей, добавить два 20 мл разбавленной червь гранулы для двух 50 мл трубы заполнены с 20 мл ледяной 60% сахарозы. Быстро центрифуги на 2700 g x 5 мин при комнатной температуре, ускорение 9 и замедления 7. Осторожно удалите слой верхней червя с большой пипетки (25 мл). Занять до 15 мл (но меньше, если есть, очевидно, много мертвых червей). Положите это прямо в 37 мл M9 + Octoxynol-9 (3 трубки на сахарозу трубки), подготовленный на льду. Центрифуга на 2700 x g 3 мин при комнатной температуре, ускорение, замедление 7 и 9.
      Примечание: Оба должны быть ледяной; в противном случае разделение не будет работать. Не следует смешивать! Потому что сахароза является токсичным для червей важно быть быстрым для следующего шага.
    6. Разделить гранулы на четыре 15 мл трубы и мыть дважды с ледяной M9 + Octoxynol-9: Центрифуги в 1900 x g 1 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант, заполнить до отметки 15 мл с ледяной M9 + Octoxynol-9 и повторите процедуру.
    7. Один раз мыть с ледяной M9 и объединить четыре трубы для двух труб. Заполнить с M9 при комнатной температуре до общего объема по 4 мл в 15 мл трубы и повернуть на nutating смеситель при 25 ° C для 40 мин.
      Примечание: Это помогает черви дайджест любого остаточного бактерий в кишечнике. Проверьте червей под микроскопом, чтобы увидеть, что есть нет мертвых.
    8. Моют червей дважды с ледяной M9 + Octoxynol-9, как описано в 1.3.5. Мыть дважды с M9 и передать одной трубки червей.
    9. Один раз мыть червей в буфере высоким соли извлечения сборка (RAB) без ингибиторы (0,1 М 4-morpholineethanesulfonic кислота (МЧС), 1 мм ethyleneglycoltetraacetic кислоты (EGTA), 0,1 мм ЭДТА, 0,5 мм MgSO4, 0,75 М NaCl, фторид натрия 0,02 М (NaF)) до коллекции. Удалите супернатант до тех пор, пока не жидкости на вершине червь Пелле.
      Примечание: Этот шаг и следующий должно быть сделано быстро избежать артефактов в глистах, вызванные высокой концентрации соли в буфере.
    10. Оценить объем червь гранул и добавить идентичные объем раб с ингибиторами (2 x коктейль ингибитор протеазы). С помощью пипетки Пастера, составить червей и медленно заливайте в 50 мл трубки, наполовину заполненный жидким азотом, помещены в сухой лед. Пусть жидкого азота испаряются и хранить замороженные червей-80 ° c до дальнейшей обработки.
      Предупреждение: Жидкий азот является крайне низкой температуре; надевайте соответствующую защиту.

2. нерастворимого белка добычу с молодых и пожилых животных, подвергается RNAi ориентации ген интереса

  1. Срыв животных, собранных в шаге 1.3
    Примечание: Важно избежать любых оттаивания образцов червя. Охладить вниз раствор с жидким азотом и выполнить всю процедуру на сухой лед.
    Предупреждение: Жидкий азот является крайне низкой температуре; надевайте соответствующую защиту.
    1. Передача замороженных червей с предварительно охлажденным раствором и растереть для 2,5 мин.
      Примечание: Будьте внимательны во время шлифования: в начале, замороженные черви находятся в небольших пуль, и это легко потерять их.
    2. Добавьте порошок, чтобы охладить его снова и шлифуют еще 2,5 мин Check с микроскопом, что червь тела сломаны жидкого азота (около 100 мл). Передача порошка в 2 мл пробирок и хранить их при температуре-80 ° C.
  2. Быстрый нерастворимого белка добычу для Западный анализ помаркой
    Примечание: Используйте этот метод для сравнения общего белка контента и нерастворимого белка уровнях между различных дней с и без интерференции, ориентация гена интереса. Выполните все шаги до шага 2.2.3 на льду!
    1. Солюбилизировать последнего 50 мг земле червей из шаг 2.1 с 150 мкл Radioimmunoprecipitation проба (RIPA) буфера (50 мм трис рН 8, 150 мм NaCl, 5 мм ЭДТА, 0,5% лаурилсульфат натрия (SDS), 0,5% Дезоксихолат натрия (SDO), 1% nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF), 1 x коктейль ингибитор протеазы). Однородный подвеска, используя шприц 1 мл с серым иглы (27 G x ½", 0,4 мм х 13 мм); составить подвеска 10 раз.
    2. Центрифуга на 18400 x g 20 мин при 4 ° C. Соберите супернатант.
    3. Ресуспензируйте Пелле в 100 мкл Буфер RIPA и центрифуги на 18400 g x 20 мин при 4 ° C. Отменить супернатанта, вскоре спина и будьте осторожны, чтобы удалить остатки супернатант.
    4. Чтобы солюбилизировать последнего высоко нерастворимые белки, Ресуспензируйте гранулы в 75 мкл буфера мочевины/SDS (8 M мочевины, 2% SDS, 50 мм Дитиотреитол (DTT), 50 мм трис, рН 8) и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
    5. Чтобы проанализировать содержание общего белка, объедините первый RIPA супернатанта от шага 2.2.2 и ресуспендирования гранулы мочевины/СДП. Для учета используется для извлечения томов, Общая часть должна содержать две трети RIPA супернатанта и одна треть фракции гранулы мочевины/SDS. На небольшой 4-12% гель градиента Проверьте уровни нерастворимых белков путем загрузки 9 мкл мочевины/SDS дроби и 4 мкл всего комбинированного белка. Выполнение общего белка окраски пятно для мониторинга уровня белка. На западной blotting, с использованием специфических антител, проверить изменения в нерастворимость для индивидуальных белков, количественно по масс-спектрометрии (см. раздел 3).
  3. Экстракция нерастворимого белка изолировать SDS-нерастворимые белки для масс-спектрометрия
    Примечание: Выполните все шаги на льду.
    1. Сухой лед весят в два раза 350 мг земле червей на момент времени и на RNAi бактерий (молодых и пожилых червей, управления RNAi бактерий и РНК-интерференции бактерий для гена интереса) в 2 мл пробирок.
    2. Чтобы удалить высоким соли растворимые белки, добавьте два тома на вес (700 мкл) раб с ингибиторами, 1 мм PMSF, 200 ед/мл DNase я и 100 мкг/мл РНКазы A каждой трубки и солюбилизировать последнего порошок на льду. Составить подвеска в 1 мл шприц (серый иглы, 27 G x ½", 0,4 мм х 13 мм) 15 раз и инкубировать на льду за 10 мин центрифуги 18400 g x 20 мин при 4 ° C. Пройти через слой жира и собирать супернатанта, с высоким содержанием соли растворимые белки в один 2-мл пробирку за состояние (четыре трубы в общей сложности). Удалить жир и выбросьте его. Аликвота высоким соли растворимые белки для замораживания при температуре-80 ° C.
    3. Чтобы отменить липиды, солюбилизировать последнего лепешка с 700 мкл раб с ингибиторами, содержащие 1 М сахарозы (без DNase I и РНКазы A). Составить подвеска в шприц 10 раз и инкубировать на льду на 5 мин центрифуги на 18400 g x 20 мин при 4 ° C. Будьте осторожны, чтобы удалить все супернатант и липидов и отбросить их.
    4. Чтобы удалить SDS-растворимые белки, солюбилизировать последнего лепешка с 700 мкл Буфер RIPA. Составить подвеска в шприц 10 раз и проинкубируйте втечение 10 мин на льду. Центрифуга на 18400 x g 20 мин при 4 ° C. Собирать супернатанта, содержащие SDS-растворимые белки и Алиготе для замораживания при температуре-80 ° C.
    5. Объединить два образца каждого условия вместе после растворяющие каждой лепешки с 500 мкл Буфер RIPA. Составить подвеска в шприц 10 раз. Центрифуга на 18400 x g 20 мин при 4 ° C. Будьте осторожны, чтобы удалить все супернатант и выбросьте его.
      Примечание: Цель извлечения является отделить растворимые белки от нерастворимых белков. Таким образом важно удалить все остаточные RIPA супернатанта перед добавлением муравьиной кислоты в следующем шаге.
    6. Солюбилизировать последнего окончательный гранулы, содержащие весьма нерастворимые белки с 400 мкл 70% муравьиной кислоты и составить подвеска в шприц 20 раз. Проинкубируйте втечение 20 мин на льду. Центрифуга на 50 000 x g 20 мин при 4 ° C, ускорение 3 и замедления 5, для удаления червя кутикулы мусора. Собирать супернатанта, содержащий высоко нерастворимые белки и заморозить при температуре-80 ° C.
    7. Диализ нерастворимых белковых фракций для масс-спектрометрия
      Примечание: Dialyze на 4 ° C.
      1. Подготовка 8 L диализа буфера (50 мм трис, 1 DTT, 0,1 мм PMSF, рН 7,5) и разделить на восемь 1 Л мензурки. Поместите три мембраны (мембранные фильтры = 0,025 мкм) на поверхности буфера для каждого стакан емкостью 1 Л.
      2. На мембрану тщательно нагрузки 65 мкл нерастворимого белка, солюбилизирован в муравьиной кислоты, полученный на шаге 2.3.6. Каждое условие делится на шесть мембраны.
      3. Проверьте рН одного образца, удалив 5 мкл и добавив его на полосы рН. Если pH между 7 и 8 (примерно через 2 ч), соберите образца, закупорить вверх и вниз осторожно. Наконец используйте 10 мкл буфера диализа для стирки осадок от каждого мембраны. Замораживание образцов-80 ° c.

3. всеобъемлющее выявление и количественная оценка изменений в нерастворимость белка с возрастом, индуцированной интерференции, ориентация ген интереса

  1. Подготовка для анализа спектрометрии массы
    1. Оцените количество нерастворимых белков в dialyzed образцах путем загрузки Алиготе на 4-12% градиента гель вместе с эталонного образца известной концентрации. Выполнение общего белка Пятнать геля и количественно оценить объем белка с программным обеспечением анализа изображений. Этот шаг необходим для оценки объема трипсина, необходимые для пищеварения (шаг 3.1.4).
    2. Концентрат образцы с помощью центробежных испарителя и солюбилизировать нерастворимые белки в конечной концентрации мочевины 8 M последнего.
    3. Алкилирование и сокращение
      1. Добавить Tris(2-carboxyethyl) фосфин гидрохлорид (TCEP) до конечной концентрации 4 мм для образцов. Инкубируйте 1 час при 57 ° C с 300 об/мин. Поместите образцы до комнатной температуры.
      2. Добавьте iodoacetamide в конечной концентрации 8,4 мм. Проинкубируйте его 45 мин (можно инкубировали в течение 2 ч) в темноте при комнатной температуре.
      3. Развести образцы в бикарбонат аммония 150 мм для получения конечной концентрации мочевины 2 М.
    4. Дайджест белки с 5% w/w изменение трипсина на ночь при 37 ° C и 400 об/мин.
    5. Загрузить образец переваренной белков на 12% гель SDS и выполнения общего белка Пятнать геля для анализа если пищеварение работал. Если есть еще некоторые группы настоящее, повторите шаги 3.1.4 и 3.1.5.
    6. Пептиды из молодых и пожилых контроль и лечение RNAi C. elegans помечены Изобарический теги для относительной и абсолютной количественный следуя инструкциям производителя.
      Примечание: в качестве альтернативы, другие методы для маркировки пептидов и белков может использоваться для количественной оценки таких массовых Теги тандем.
      Примечание: Массовое спектрометрирование анализ: для уменьшения сложности образца, пептиды должны быть разделены сильный катионообмен хроматографии на различные фракции для масс-спектрометрии анализа5. Несколько масс-спектрометры способны анализировать Изобарический теги для относительной и абсолютной количественный как описано17. Полученные данные должны быть обработаны с соответствующим программным обеспечением. В целом этот анализ позволяет выявить весьма нерастворимых белков и их изменения на возраст и на proteostasis модуляции.

4. в естественных условиях оценки влияния гена интереса на шаблоне агрегации во время старения

  1. Из анализа масс-спектрометрии в разделе 3 Выберите возраст зависимой агрегации подверженных белок, который накапливается в разной степени в животных, подвергается RNAi. Создание трансгенных C. elegans линии, выражая этот протеин тегами с флуоресцентный белок и под контролем своих соответствующих промоутер или ткани конкретной промоутера (см. обсуждение для выбора соответствующей промоутер). Поддерживайте стандартные методы на тарелках нематода роста (НГ), семенами с ОР50 деформации при 15 ° C. Например, мы выбрали червь штамм, выражая polyadenylate связывающий белок (PAB-1) сливается в N-terminus в tagRFP под контролем promotor глоточных мышц pmyo-2.
  2. В естественных условиях оценки изменений в агрегате с возрастом при торможении гена интереса
    1. Одного-двух дней заранее, подготовить нг/carbenicillin (Carb) / IPTG плиты с элементом управления (пустой вектор RNAi L4440) бактерии и интерференции бактерии подавляют гена интереса. (Для подробного протокола о РНК-интерференции у нематоды Caenorhabditis elegans см JoVE науки образования базы данных. Основы биологии 1: дрожжи, Дрозофилы и C. elegans. РНК-интерференции у нематоды Caenorhabditis elegans. Зевс, Кембридж, Массачусетс, doi: 10.3791/5105 (2017)).
    2. Для лечения RNAi от L1 место яйцекладка червей на несколько отдельных небольших пластин нг/карбюратора/IPTG (6 см в диаметре), семенами с управления RNAi или бактерии РНК-интерференции для гена интереса при 20 ° C. Удаление взрослые через 2 ч, сохраняя потомства при 20 ° C. Чтобы избежать дефектов развития, RNAi лечения может быть запущен после L4 личиночной стадии.
    3. Как только потомство достигает личиночной стадии L4, передача этих L4s на новые пластины нг/карбюратора/IPTG семенами с управления RNAi или бактерии РНК-интерференции для гена интереса. Установить до девяти плит с 15 мутация для обоих условий и держать их на 20 ° C. Черви старения должны быть переданы от их потомства на новые пластины каждый второй день до конца их репродуктивный период для того, чтобы иметь возможность отличать их от их потомство.
    4. Оцените изменения в распределении подверженных агрегации белков, помечены флуоресцентные метки под микроскопом флуоресцентный стерео с 24 крат во взрослом возрасте, каждый день.
      Примечание: Возраст зависимых накопление подверженных агрегации белков в ярких puncta используется как считывания для агрегации. Эти puncta должно быть весьма неподвижной структур можно охарактеризовать, как агрегатов. Это должно определяться флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание (FRAP) с помощью конфокальной микроскопии. Для агрегированных белка не восстановления должны соблюдаться в регионе отбеленной после по крайней мере 4 мин5,18. Для количественной оценки изменения с возрастом, забили моделей распределения в возрасте синхронизированы червей, экспрессирующих PAB-1 на 2 день, день 5 и 7 день совершеннолетия следующим: низкие уровни агрегации (tagRFP::PAB-1 puncta 0-10 в задней глотки лампы), Уровни средних агрегации (более 10 puncta в задней глотки лампы) и уровни высокой агрегации (более 10 puncta в передней глоточные лампочку).

Результаты

Мы использовали методы, представленные здесь, чтобы оценить как долгоживущие животные с сокращением IIS модулировать агрегации белков зависит от возраста. По Западной блот (см. шаг 2,2, быстрого извлечения нерастворимых белков для Западный анализ помаркой), мы проанализ?...

Обсуждение

Здесь мы приводим методологию для изоляции агрегатов высоко нерастворимого белка от старения C. elegans подвергается РНК-интерференции для анализа по масс-спектрометрии и Западный blotting. Мы покажем, что улучшение proteostasis путем уменьшения IIS значительно препятствует агрегации белков за...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана финансирование от DZNE и Мари Кюри международной реинтеграции Грант (322120 D.C.D.)

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Fernbach culture flask Corning4425-2XLPyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap Schott1088655GL45
Nutating MixerVWR444-0148
Separatory funnelNalgene4300-1000Capacity 1,000 ml
1 ml syringe BD Plastipak300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mmBD Microlance 3300635
Membrane filters 0.025 µMMilliporeVSWP04700
pH stripMachery-Nagel92110pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001Complete Mini EDTA-free tablets 
Octoxynol-9 ApplichemA1388Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichM1317
NonylphenylpolyethylenglycolApplichemA1694Nonidet P40 (NP40)
DNaseIRoche04716728001recombinant, RNase free
RNaseAPromegaA7973solution
Total protein blot stainingThermofisherS11791Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel stainingThermofisherS12001Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)Serva36970
IodoacetamideServa26710
AmmoniumbicarbonateSigma-Aldrich09830
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitationSciex4352135iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XPBeckmann Coulter393126
Ultracentrifuge Optima Max-XPBeckmann Coulter393315
Centrifuge 5424REppendorf5404000413
Centrifuge 5702Eppendorf5702000329
Centrifuge Megafuge 40RThermo Scientific75004518
Concentrator PlusEppendorf5305000304Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC LeicaWith Planapo 2.0x objective
Dissection microscopeLeica Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1ZeissWith PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis softwareImageJ
Analysis of mass spectrometry dataProtein Prospectorhttp://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50CGC
RNAi bacteria
L4440Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253CGC, strain name: EJ1158 Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]

Ссылки

  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
  2. David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
  3. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  4. Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
  5. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
  6. Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
  7. Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
  8. Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
  9. Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
  10. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
  11. Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
  12. Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
  13. Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
  14. Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
  15. Sulston, J. H. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
  16. Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
  17. Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
  18. Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
  19. Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
  20. Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
  21. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
  22. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
  23. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
  24. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
  25. Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
  26. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
  27. Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
  28. Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
  29. Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
  30. Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
  31. Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

129proteostasisC elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены