深い皮膚注入として、モデルカンジダ皮膚感染症病理組織学的解析のための

要約

ここでカンジダ皮内注射後皮膚サンプルの組織学的および分子の解析を可能にするプロトコルについて述べる。このプロトコルは、皮膚の構造的な整合性を維持でき、病原体の分布と同様、組織居住者や新人の免疫細胞の局在化のため。

要約

皮膚は体の非常に拡張された器官、この大きい表面のため継続的に微生物にさらさ。肌のダメージは有効で、血液中に病原体の普及の結果、真皮で感染症に簡単につながります。どのように非常に早い段階で感染症と戦う免疫システムとどのようにホストが病原体を排除することができます理解することは、将来の治療介入のベースを設定する重要なステップです。ここで述べるなど病原体がc. アルビカンスによって誘発される免疫応答と同様に、上皮のバリアを超えたとき、感染症の初期段階で発生するプロセスを視覚化することができますカンジダ感染症のモデルの侵略。皮膚と同様の存在と病原体の局在に潜入免疫細胞を示す組織学的解析を実行するのにこの感染モデルを使用しました。採取後 RNA 抽出のため感染を処理ことができます。

概要

人間の体は、微生物数が非常に高いで覆われています。皮膚表面は、¹平方センチメートルあたりほぼ 100 万の細菌の生息地です。ただし、この数は皮膚を定着する微生物のさまざまなを反映しません。細菌だけでなく人間の体は、粘膜と皮膚のレベル²の両方を存続することができるc. アルビカンスを含む多くの菌種によって植民地化します。

近年では、真菌感染症と診断された人の割合は非常に増加しています。これは主に免疫不全者、すなわち、HIV 陽性の患者、移植³の後に化学療法や免疫抑制薬を経て患者数の増加。アメリカ合衆国で行われた監視調査、Wisplinghoffらは、院内血流感染症の 9.5% がカンジダ種⁴によって引き起こされたことを示した。真菌感染症とカンジダ血流感染症の中に発見の上昇の割合、特にのための高められた発生、ためこの病原体が免疫系の制御をエスケープする方法を理解することは非常に大事な。

C. アルビカンスは、酵母、blastospores、桑、⁵環境条件に応じて菌糸など異なる形態で育つ二形性真菌です。菌糸形態、 C. albicansはその侵襲性の最大容量を示しています、上皮⁶を貫通する能力を持っています。

C. アルビカンスの感染症は、いくつかの実験的アプローチを使用して研究されています。感染症の最も一般的なモデルは、 C. albicans酵母⁷の静脈注射です。ただし、このモデルはない考慮すべてのプロセスが起こる菌が血流に広がる管理する前に。別のモデルでは、上皮に侵入するC. albicansの機能を活用します。このメソッドでは、またとして知られている砂のペーパー モデル⁸1998年⁹Gaspariらによって開発された、こうしてc.albicansを適用する前に角質を除去、肌を研磨する砂のペーパーを使用して成っています。この手順では、この病原体の侵襲的な能力の分析ができ、上皮に侵入する菌をことができます。最後に、消化管¹⁰と¹¹気道感染症の他のモデルは、さまざまな研究で使用されています。

(砂のペーパー モデル) のように傷の形成は、癒しのプロセス¹²を促進するために免疫細胞の動員と活性化を含む、いくつかの経路の活性化を引き起こします。変更、または具体的結果を交絡につながる、病原体に対して誘発される免疫応答をマスクできます。

ここで初期傷の形成を回避する皮膚感染症法と基底炎症性環境の誘導について述べる。そのまま上皮構造を維持するために直接、菌糸形深いダーマでc. アルビカンスを挿入します。炎症の量が制限され、制限されているにもかかわらず、単一の注入は、軽度の炎症を引き出すことができる、砂のペーパー モデルのように開いた傷の形成と比較して。我々 はここで説明するアプローチには、真菌感染症と機械的な損傷によって引き起こされる過度なと既存の炎症性環境を回避しながら普及に免疫応答の研究ことができます。

プロトコル

すべて手順の機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の下で承認された子供に動物資源科の監督の下で運営のボストン小児病院の病院 (ARCH) またはイタリア語によって承認されました。厚生省機関動物ケア委員会ミラノ ビコッカ大学の下。

1 C. albicansの準備。

1. 文化c. アルビカンスCAF3 1¹³、25 ° C でウリジン (50 mg/L) を添加した豊富な媒体 (酵母エキス ペプトン ブドウ糖 (YEPD)、1% (w/v) 酵母エキス、バクト ペプトン、2% (w/v) グルコースの 2% (w/v)) を含んでいる管のひずみこれらの条件の下でc. アルビカンスは酵母として育ちます。
   注: C. albicansの他の系統も使えます、臨床分離c.albicansひずみ SC5314¹³など生得の免疫組織の¹⁴、その細胞壁成分と構造を保持するすべてのc.albicansひずみ理論的に活性化による、潰瘍性のプロセスことを示してきたからだけでなく、菌糸の予測を発信する機能を使用できます。
2. 細胞カウンター アナライザーを使用して細胞濃度をカウントすることによって文化を監視します。
3. 約 8 × 10⁶セル/ml の濃度に達すると文化を収穫します。また、外径₆₀₀を測定するのに分光光度計を使用します。
   注: 通常、外径 φ₆₀₀の値 = 3 × 10、⁷セル/ml の酵母濃度に対応する 1 が、滴定をお勧め。
4. YEPD ウリジン中、バッファー剤として HEPES (50 mM、pH 7.5) を使用して文化を再懸濁し、菌糸の形成を誘導する 37 ° C で文化を孵化させなさい。100 倍の倍率の顕微鏡で菌糸の形成を確認します。菌糸の形成は 37 ° C で培養後表示 5 h です。ただし、菌糸の割合が全体の文化のほぼ 95% に達した場合、37 ° C で培養後セル 16 h を使用します。
5. 菌糸の濃度で準備をさらに充実させて、遠心分離機因数 3,300 x g で 5 分間の文化の上澄みを廃棄し、1 × 10⁸菌糸/mL の濃度で滅菌 PBS でペレットを再懸濁します。

2. 深い皮膚注入

1. 24 時間前感染症プロシージャはケタミン (80-100 mg/kg) およびキシラジン (10 mg/kg)、腹腔内注入マウスを麻酔し、電気クリッパーを使用してマウスの側面を剃る。
   注: 麻酔を含むプロシージャの後彼らが効率的に回復するまで、加熱ランプの下でマウスを配置します。
2. シェービング加工による任意の炎症を避けるために 24 時間のマウスを置きます。
3. シェービングの手順後 24 h は、ケタミン (80-100 mg/kg) およびキシラジン (10 mg/kg 腹腔内注射マウスを麻酔します。
4. 足反射マウスが深く麻酔したことを確認するを確認します。足をしっかりとつまんで足反射を評価します。麻酔が達成された場合、動物は痛みを感じていないと動かない。
5. 50 μ L/注入、5 x 10⁶菌糸・射出に対応する最終巻で 30 x 8 mm 針で 0.3 mL インスリン注射器を使用して深いダーマのc.albicans菌糸を注入します。
   1. 深いダーマに直接ボリュームを注入するために 2 本の指を使用するピンと張った坊主の側面の皮膚を引っ張ったり。針が上向きの傾斜面と 10 ~ 15 ° の角度で針を挿入します。
   2. この角度、病原体は約 300-500 μ m の深さと注入されます。注射はよく実行するはバンプの噴射量フォームが注入後数分を吸収されることを確認します。
      注: バンプ形成後約 1 cm²の注射になります。これは、分子または組織学的分析のための指定された時点で削除される領域です。
   3. (推奨) 24 h 未満の時間ポイント マーカー ペンで注入を形成したバンプ吸収後、数分持続するので感染症の領域をマークします。24 時間以上の時間ポイントの潰瘍または嚢胞のどちらかが明確に表示されるため、この手順は必要、ありません。

3. サンプルの収集と組織染色のための準備

1. 制度の手順に従ってマウスを安楽死させます。
2. 以前マーカー ペンでマークされた、注入されたサイトの境界に皮膚を引っ張って手術用鉗子を使用して、します。外科はさみを使用すると、マークのラインの皮膚を切断することによって感染したサイトを切除します。
   注: ラウンド チップはさみを使って腹膜から皮膚を分離するように気をつけてください。
3. 上向き肌の内部側で最適な切削温度 (OCT) 化合物は、いっぱい使い捨て基本金型で肌を浸します。化合物が白になるまでは、液体窒素でサンプルを凍結します。サンプルをカバーこれはサンプルを損なうことになると、それは完全に凍結され前に液体窒素を聞かせていません。
   注: 注意!ステップ 3.3 の間に液体窒素から保護するため顔面シールドを着用します。
4. サンプルをスライド準備のためすぐに使用しない場合-80 ° C で急速に保存します。
   注: サンプルすることができます-80 ° C で不明確に保存されます。

4. スライドの準備

1. サンプルは、サンプルの中心から始まって組織学のためのスライスを準備する半分にカットします。
2. クライオスタットと 5 μ m の厚さのスライスをカットします。
   メモ: 皮膚のサンプル、クリオスタットの温度ではありません-25 ° C 以上の高H 10 月の部分溶融高温になります、したがってサンプルが維持されない正しい位置で切断のプロシージャの間に。
3. 正荷電の顕微鏡のスライドを使用して、スライスを収集します。
4. 収集スライスを準備の後すぐに使用しない場合は-20 ° C で保存します。この時点で、スライス-20 ° C で不明確に保存されることができます。

5. ヘマトキシリン ・ エオシン染色

1. 5 分間流水でスライド 4 分洗浄ギルのヘマトキシリン浸漬によってスライドを染色します。
2. 水道の流水で 5 分間洗浄プロトコルを続行する前に蒸留水を使用してスライド内のスライド 1 分洗浄エオシン Y 溶液中浸漬によるスライドを染色します。
3. 連続エタノール溶液 (50%、70%、80%、95%、100%) 濃度の増加に浸すことによって脱水します。15 のスライドを浸す各エタノール溶液で s。
4. 組織学的クリア剤浸漬によって、少なくとも 2 分間スライドをオフします。
5. メディアをマウントし、カバー スリップを使用してスライドをマウントします。
6. 40 倍の倍率での顕微鏡スライド スキャナーと、スライドのイメージを取得します。

6. 過ヨウ素酸シッフ (PAS) 染色

1. 1 分の水道水を実行しているスライド 1 分洗浄のため室温で ≥99.5% アセトンでスライドを固定します。
2. 染色スライド周期酸溶液 (1 g/dL) 浸漬によって 5 分洗浄の蒸留水の 3 変化でスライド。
3. スライド 15 分洗浄シフの試薬に浸漬 5 分間水道水を実行しているスライドを染色します。
4. 5 分洗浄は 30 に水道の流水で滑るのためギルのヘマトキシリン浸漬によってスライドを染色 s。
5. 3 変更の 100% エタノール浸漬によってスライドを脱水します。15 のスライドを浸す s たびに。
6. 組織学的クリア剤浸漬によって、少なくとも 2 分間スライドをオフします。
7. メディアをマウントし、カバー スリップを使用してスライドをマウントします。
8. 顕微鏡スライド スキャナーと、スライドのイメージを取得します。

7. サンプルの収集と RNA の抽出のための準備

1. 制度の手順に従ってマウスを安楽死させます。ステップ 3.2 のように皮膚のサンプルを削除します。
2. 酸のためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出用試薬 1 mL を 2 mL スナップ キャップ チューブに試料を浸します。
   注: プロトコルがここで一時停止にすることができ、サンプルは-80 ° C で保存できます。
3. 約 0.2 cm²を用いての手術用鉗子にサンプルを切る。
   注: 注意!RNA の隔離のための試薬のほとんどは、毒性、変異原性。7.3 と 7.4 の手順を実行する必要がありますは、ヒューム フードの下で行われます。
4. また 20 分の 20 振動/秒の速度でビーズミルでサンプルを粉砕、機械的・ ポッターを使用ことができます。
5. 皮膚のままの作品の存在を捜すことによってサンプルの効果的な均質化を確認してください。サンプルは完全に均質化しない場合は、この手順を繰り返します。
6. 遠心分離機の 16,000 x g で 1 分間維持でサンプルの RNA の抽出上清、ペレットを破棄します。髪や抽出列をブロック可能性があるがれきを除去するためにこの手順を実行します。
7. RNA 精製列¹⁴を使用して RNA の抽出を続行します。
8. 分光光度計を使用すると、RNA の精製・濃縮を評価します。RNA 抽出を cDNA の準備のためすぐに使用しない場合は-80 ° C で試料を保存します。

結果

深いダーマで直接病原体の注入を通して組織の形態のままそのまま (図 1 a)。

皮膚構造健全性の維持では、免疫細胞の検出と感染症のサイトに局在をことができます。図 1 bに示すように高倍率では、膿瘍は主に感染症のサイトにその閉じ込め病原体の広がりを含む多形核白血球...

ディスカッション

ここで深いダーマの真菌の入口に開始される炎症過程を研究するC. albicans感染症法について述べる。

深いダーマで直接菌の注入により駆動型真菌膿瘍形成の研究だけでなく、特定の免疫の解析、皮膚膿瘍形成はC. albicans感染¹⁵時に比較的まれなイベントが、真菌を含む参加細胞は します。ここで説明する方法、それは機械的破損や傷、炎症?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound	histo-line laboratories	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic	histo-line laboratories	09-209-05
Ethanol absolute	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, mounting medium	bio-optica
Acetone	sigma-aldrich	179124
PAS staining system	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
liquid nitrogen			Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle	BD	324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable	histo-line laboratories	2781
Positively charged bio microscope slides	bio-optica	09-2000
Cover slips 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998