깊은 피부 주입으로는 모델 조직학 분석 Candida albicans 피부 감염의

요약

여기는 Candida albicans 피부 주입 후 피부 샘플의 조직학 및 분자 분석을 허용 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜 피부의 구조적 무결성을 유지 하 고 병원 체 분포 및 조직 상주 또는 새로 채용 면역 세포의 지역화에 대 한 수 있습니다.

초록

피부는 신체의 매우 확장 된 기관이 고,이 큰 표면 때문에 미생물을 지속적으로 노출 되. 피부 손상을 쉽게 혈 류로 병원 균의 보급에 차례 차례로 귀 착될 수 있다, 진 피에 감염 될 수 있습니다. 어떻게 면역 체계 싸움 감염 초기 단계와 어떻게 호스트 병원 체를 제거할 수 있습니다 이해 미래 치료 개입에 대 한 설정 하는 중요 한 단계입니다. 우리가 Candida albicans 감염 병원 체 면역 반응 elicited C. albicans에 의해로 서 상피 장벽을 통과 하는 때를 포함 하 여, 감염 동안 일찍 발생 하는 프로세스를 시각화 수 있는 모델을 설명 하는 여기 내 습. 우리는 피부 뿐 아니라 존재 및 병원 체의 지역화에 침투 하는 면역 세포를 표시 하는 조직학 분석을 수행 하기 위해이 감염 모델을 사용. 샘플 수집 후 감염 RNA 추출 처리 될 수 있습니다.

서문

인체는 미생물의 매우 높은 숫자를으로 덮여 있다. 피부 표면¹평방 센티미터 당 거의 1 백만 박테리아의 서식 지입니다. 그러나,이 숫자 colonizes 피부 미생물의 전체 다양성을 반영 하지 않습니다. 박테리아, 뿐만 아니라 인간의 신체는 모두는 점 막과 피부 레벨²에서 살아남을 수 한 C. albicans를 포함 하 여 많은 곰 팡이 종에 의해 식민지 이다.

최근 몇 년 동안, 균 감염으로 진단 하는 사람의 비율이 엄청나게 증가 했다. 이것은 주로 immunocompromised 명, 즉, HIV 양성 환자와 환자 화학 요법 또는 면역 억제 약을 통해 이식³후 간 높은 수 있습니다. 미국에서 수행 하는 감시 연구, Wisplinghoff 그 외 여러분 병원내 혈 류 감염의 9.5 %Candida 종⁴에 의해 발생 했다 보여주었다. 증가 발생 곰 팡이 감염, 그리고 특히 칸디 다 종의 혈 류 감염 시 발견의 높은 비율 때문에, 때문에 매우은이 병원 체는 면역 시스템의 제어를 탈출 하는 어떻게 이해 중요 한.

C. albicans 동종이 형 균 류 효 모, blastospores, pseudohyphae,⁵환경 조건 따라 균 등 다른 형태학 형태로 성장 하는. Hyphal 형태의 C. albicans 높은 침해 용량을 보여줍니다 하 고 상피⁶을 관통 하는 기능이 있다.

C. albicans 감염 여러 가지 실험 방법을 사용 하 여 연구 되었습니다. 감염의 가장 일반적인 모델은 C. albicans 효 모⁷의 정 맥 주입. 그러나,이 모델 받지 않는다 고려 사항으로 모든 프로세스는 일이 혈 류로 확산 하는 곰 팡이 관리 하기 전에. 또 다른 모델은 상피를 침입 하는 C. albicans 의 기능을 활용 합니다. 이 방법, 일컬어 모래 종이 모델⁸, Gaspari 외. 1998⁹에 의해 개발 되었다 그리고 C. albicans를 적용 하기 전에 따라서 지층 corneum 를 제거 피부를 침식을 모래 종이 사용 하 여 구성 됩니다. 이 절차에 따라서이 병원 체의 침입 능력의 분석을 사용 하는 상피 세포를 침투 하는 곰 팡이 수 있습니다. 마지막으로, 위장¹⁰ 및 호흡기 책자¹¹ 를 위한 감염의 다른 모델 다른 연구에 사용 되었습니다.

(모래 종이 모델)로 상처의 형성 등 면역 세포 모집 활성화,¹²치유 과정 촉진 하기 위하여 여러 경로의 활성화를 하면 됩니다. 이 중 하나 변경 하거나 결과 혼동 하는 병원 체에 대해 특별히 elicited 면역 응답 마스크 수 있습니다.

여기 피부 감염을 초기 상처 형성을 방지 하는 방법 및 기저 선 동적인 환경 유도 설명 합니다. 그대로 상피 구조를 유지 하려면 우리는 직접 깊은 derma에 hyphal 형태로 C. albicans 주사. 염증의 금액 제한 및 제한 단일 주입 가벼운 염증 유도 수 있습니다, 비록 모래 종이 모델에서 열린 상처의 형성에 비해. 우리가 여기에 설명 하는 방법 곰 팡이 감염을 피하 면 서 기계적 손상으로 인 한 과도 하 고 기존의 염증 성 환경 확산 면역 반응의 연구를 수 있습니다.

프로토콜

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 승인 되었고 어린이 동물 자원의 부의 감독 아래 운영 병원 (아치) 보스턴 아동 병원에서 또는 이탈리아에 의해 승인 되었다 보건 기관 동물 관리 위원회 밀라노-Bicocca의 대학에서 수행 하는 고.

1. C. albicans 준비

1. 문화 C. albicans, 스트레인 CAF3-1¹³, 25 ° c.에 uridine (50 mg/L) 보충 풍부한 매체 (효 모 추출 물 펩 포도 당 (YEPD), 1% (w/v) 효 모 추출 물, Bacto 펩, 포도 당 2% (w/v)의 2% (w/v))를 포함 하는 튜브에 이러한 조건에서 C. albicans 는 효 모로 자 랍니다.
   참고: 다른 C. albicans 변종 사용할 수 있습니다, 같은 임상 분리 C. albicans 스트레인 SC5314¹³. 이후 우리는 최근 궤 양성 과정은 타고 난 면역 계통¹⁴, 이론적으로 세포 벽 구성 요소와 구조를 유지 하는 모든 C. albicans 스트레인의 활성화에 의해 유도 된 증명 하고있다 뿐만 아니라 hyphal 계획을 시작 하는 기능을 사용할 수 있습니다.
2. 셀 카운터 분석기를 사용 하 여 세포 농도 계산 하 여 문화를 모니터링 합니다.
3. 약 8 x 10⁶ 셀/mL의 농도 도달 하면 문화를 수확. 또는, OD₆₀₀을 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다.
   참고: 일반적으로, OD₆₀₀ 의 값 = 1 ml/3 x 10⁷ 세포, 효 모 농도에 해당 하지만 적정 권장.
4. HEPES (50 m m, pH 7.5)를 사용 하 여 버퍼 에이전트로 YEPD uridine 매체에 문화를 resuspend 하 고 균의 형성을 유발 하는 37 ° C에서 문화를 품 어. 100 배 확대에 현미경 hyphal 형성을 확인 하십시오. 37 ° C에서 배양 후 hyphal 형성은 보이는 5 h 그러나, 사용 하 여 셀을 16 h 37 ° C에 외피 후 hyphal 비율 총 문화의 거의 95%에 도달 하면.
5. 더 풍요롭게 hyphal 농도에서 준비, 5 분을 위한 3300 x g에서 문화 원심 분리기 aliquots 삭제는 상쾌한 고을 1 x 10⁸ 균/mL의 농도에서 살 균 PBS에 펠 릿을 resuspend.

2. 깊은 피부 주입

1. 24 시간 사전 감염 절차 케 타 민 (80-100 mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 복 주사와 쥐를 anesthetize 하 고 전기 클리퍼를 사용 하 여 마우스의 측면을 면도.
   참고: 후 마 취를 포함 하는 모든 프로시저를 놓습니다 난방 램프 아래 쥐 그들은 효율적으로 복구 될 때까지.
2. 24 h 쉐이 빙 과정 어떤 염증 방지를 위한 마우스를 놓습니다.
3. 면도 수술 후 24 h anesthetize 케 타 민 (80-100 mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 복 주사와 쥐.
4. 쥐 취 깊이 되도록 발 반사를 확인 하십시오. 단단히 발을 곤란 하 게 하 여 발 반사를 평가 합니다. 마 취를 달성 하는 경우 동물 통증을 느끼지 않습니다 하 고 이동 하지 않습니다.
5. C. albicans 균 50 µ L/주입, 해당 5 x 10⁶ 균/주입 하의 마지막 볼륨에 30 G x 8 m m 바늘으로 0.3 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 깊은 더 마에 주사.
   1. 면도 측면의 피부를 당겨 긴장 된 손가락 두 개를 사용 하 여 깊은 더 마에서 직접 볼륨을 주입 합니다. 향하도록 하는 바늘의 경사와 10-15 °의 각도와 바늘을 삽입 합니다.
   2. 이 각도와 약 300-500 µ m의 깊이와 병원 체를 주입 됩니다. 주사는 잘 수행 되도록 확인 주입 된 볼륨은 범프 형성 흡수 몇 분 주사 후.
      참고: 범프 형성 후 주사 약 1 c m²의 있을 것입니다. 이것은 분자 또는 조직학 분석을 위해 지정 된 시간 지점에서 제거 될 것 이다 지역입니다.
   3. 범프는 사출 형성 후 흡수, 몇 분 동안 지속 되 고 있기 때문에, 시간 점이 24 시간 보다는 더 적은 (권장)의 마커 펜으로 감염의 영역을 표시 합니다. 24 시간 이상의 시간 포인트, 위 궤 양 또는 낭종은 명확 하 게 볼 수 있기 때문에이 단계, 필요 하지 않습니다.

3. 샘플 수집 및 조직학 얼룩을 위한 준비

1. 제도적 절차에 따라 마우스를 안락사
2. 수술 용 집게를 사용 하 여 이전 마커 펜으로 표시 된 삽입 된 사이트의 테두리에서 피부를 당겨. 수술가 위를 사용 하 여 표시 된 라인을 따라 피부를 절단 하 여 감염 된 사이트를 삭제할.
   참고: 라운드 팁이 위를 사용 하 여 복 막에서 피부를 분리 하는 주의 해야 합니다.
3. 일회용 기본 몰드 향하도록 피부의 내부 측면으로 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물, 가득한 피부에 젖어. 화합물 흰색 될 때까지 액체 질소에 샘플을 동결. 이 샘플을 손상 것으로 완전히 고정 하기 전에 샘플을 커버 하는 액체 질소 하 게 하지 마십시오 .
   참고: 주의! 3.3 단계 동안 액체 질소에서 보호를 위해 얼굴 방패를 착용.
4. 샘플 슬라이드 준비를 위해 즉시 사용 하지 않는 경우 빠르게-80 ° c.에 저장
   참고: 샘플을 저장할 수 있습니다-80 ° C에 무기한.

4입니다. 슬라이드의 준비

1. 샘플 샘플의 센터에서 출발 하는 조직학에 대 한 슬라이스를 준비 하는 반으로 잘라.
2. 잘라 5 µ m는 cryostat와 두꺼운 조각.
   참고: 피부 샘플는 cryostat의 온도 하지 보다 클 수-25 ° c. 더 높은 온도 H-10 월의 부분적인 녹는 원인과 따라서 샘플 것 유지 되지 않을 올바른 위치에 절단 절차 동안.
3. 충전 된 현미경 슬라이드를 사용 하 여 슬라이스를 수집.
4. 준비 후 곧 수집 된 분할 영역을 사용 하지 않는 경우-20 ° c.에서 그들을 저장합니다 이 시점에서, 조각은 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 무기한.

5. 되며 & 오신 얼룩

1. 5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드 4 분 세척에 대 한 길의 hematoxylin에 침수에 의해 슬라이드를 얼룩.
2. 1 분에 오신 Y 솔루션에 집중 하 여 슬라이드 실행 5 분 린스에 대 한 수돗물 사용 하 여 슬라이드에 슬라이드 세척 얼룩 프로토콜을 계속 하기 전에 증류수.
3. 순차적으로 에탄올 솔루션 (50%, 70%, 80%, 95%, 100%)의 농도 증가에 침수에 의해 탈수. 15에 대 한 슬라이드를 담가 각 에탄올 솔루션에서 s.
4. 조직학 개간 에이전트에 침수에 의해 적어도 2 분 동안 슬라이드를 선택을 취소 합니다.
5. 장착 매체와 커버 전표를 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다.
6. 40 X 확대 현미경 슬라이드 스캐너와 슬라이드의 이미지를 취득 합니다.

6. 정기 산 Schiff (PA) 얼룩

1. 1 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드 1 분 세척에 대 한 실 온에서 ≥99.5% 아세톤과 슬라이드를 수정 합니다.
2. 얼룩 슬라이드 주기 산 솔루션 (1 g/dL)에 침수에 의해 5 분 세척에 대 한 증류수 3 변경에서 슬라이드.
3. 5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드에 Schiff의 시 약 15 분 세척에 대 한 침수로 슬라이드를 얼룩.
4. 5 분 씻어 30 수돗물 실행에 슬라이드에 슬라이드 길의 hematoxylin에 침수에 의해 얼룩 s.
5. 100% 에탄올의 3 변화에 집중 하 여 슬라이드를 탈수. 15에 대 한 슬라이드를 담가 s 각 시간.
6. 조직학 개간 에이전트에 침수에 의해 적어도 2 분 동안 슬라이드를 선택을 취소 합니다.
7. 장착 매체와 커버 전표를 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다.
8. 현미경 슬라이드 스캐너와 슬라이드의 이미지를 취득 합니다.

7. 샘플 수집 및 RNA 추출에 대 한 준비

1. 제도적 절차에 따라 마우스를 안락사 3.2 단계에서 피부 샘플을 제거 합니다.
2. 산 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-추출 시 약의 1 mL 2 mL 스냅 캡 튜브에 샘플을 담가.
   참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 하 고 샘플-80 ° c.에 저장 될 수 있다
3. 약 0.2 c m² 외과 집게를 사용 하 여 조각으로 샘플을 잘라.
   참고: 주의! RNA 분리 시 약의 대부분은 독성 및 돌연변이. 증기 두건에서 수행 되어야 7.3 및 7.4 단계 해야 합니다 .
4. 또는 20 분에 대 한 20 진동/s의 속도로 비드 밀와 함께 샘플을 부 술, 기계적 포터를 사용할 수 있습니다.
5. 샘플의 효과적인 균질 피부 그대로의 존재를 찾아 확인 합니다. 샘플은 완전 하 게 균질 하지 경우이 단계를 반복 합니다.
6. 원심에서 16000 x g 1 분 유지에 대 한 샘플 RNA 추출 supernatants 고 펠 릿을 삭제. 이 단계는 머리와 추출 열을 차단할 수 있는 파편을 제거 하기 위해 수행 됩니다.
7. RNA 추출 RNA 정화 열¹⁴를 사용 하 여 계속 합니다.
8. 분 광 광도 계를 사용 하 여 RNA 정화 및 농도 평가. RNA 추출 cDNA 준비를 위해 즉시 사용 하지 않는 경우-80 ° c.에 샘플 저장

결과

깊은 더 마에서 직접 병원 체의 주사를 통해 조직 구조 형태는 그대로 (그림 1A)를 남아 있습니다.

피부 구조 무결성의 유지 관리는 면역 세포의 탐지 및 감염의 사이트에 그들의 지 방화를 허용 한다. 그림 1B 에서 표시 하는 높은 배율이 보여준다 농 양 감염의 사이트에 그것의 감 금...

토론

여기 우리는 C. albicans 감염 깊은 더 마에 곰 팡이 입구를 따라 시작 된 염증 과정을 공부 하는 방법을 설명 합니다.

피부 농 양 형성 C. albicans 감염¹⁵시 상대적으로 드문 경우 이지만, 직접 깊은 더 마에에서 곰 팡이의 주입 수 선 구동 농 양 형성의 연구 뿐만 아니라 특정 면역의 분석 곰 팡이 확산을 포함에 참여 하는 셀입니다. 여기에 설명 된 방?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound	histo-line laboratories	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic	histo-line laboratories	09-209-05
Ethanol absolute	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, mounting medium	bio-optica
Acetone	sigma-aldrich	179124
PAS staining system	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
liquid nitrogen			Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle	BD	324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable	histo-line laboratories	2781
Positively charged bio microscope slides	bio-optica	09-2000
Cover slips 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998