Derin Dermal enjeksiyon olarak bir Model Candida albicans deri enfeksiyonu histolojik analizler için

Özet

Burada tarif biz Candida albicans intradermal enjeksiyon sonra deri örnekleri histolojik ve moleküler analizi sağlayan bir protokol. Bu iletişim kuralı cilt yapısal bütünlüğünü korur ve doku-ikamet veya yeni alınan bağışıklık hücreleri gibi patojen dağıtım yerelleştirme için sağlar.

Özet

Deri vücudun son derece genişletilmiş bir organdır ve bu geniş yüzeyi nedeniyle sürekli mikroorganizmalar için maruz kalmaktadır. Deri Hasari kolayca da buna karşılık, patojenler yayılması kan dolaşımına yol açabilir dermiste enfeksiyonlara yol açabilir. Anlama nasıl bağışıklık sistemi enfeksiyonları çok erken aşamada savaşır ve nasıl ev sahibi Patojenler ortadan kaldırabilir gelecekteki tedavi müdahaleler temelini ayarlamak için önemli bir adımdır. Burada biz bir model sırasında erken enfeksiyon patojen epitel bariyer yanı sıra bağışıklık yanıtı C. albicans tarafından elde edildi geçti zaman da dahil olmak üzere, meydana süreçleri görselleştirebilirsiniz Candida albicans enfeksiyon tarif işgali. Bu enfeksiyon model deri yanı sıra varlığı ve yerelleştirme patojenin sızmak bağışıklık hücreleri gösteren histolojik analizleri gerçekleştirmek için kullanılır. Enfeksiyon RNA çıkarma için işlenen sonra örnekleri topladı.

Giriş

İnsan vücudu mikroorganizmaların son derece yüksek bir numarası ile kaplıdır. Cilt yüzeyi neredeyse bir milyon bakteri başına santimetre kare¹yaşam alanıdır. Bu sayı, ancak, cilt colonizes tam mikroorganizmaların çeşitli yansıtmak zorunda değildir. Bakteri ek olarak, insan vücudu hem mukozal ve cilt düzey²hayatta yapabiliyor C. albicans, dahil olmak üzere birçok mantar türü tarafından kolonize.

Son yıllarda, mantar enfeksiyonları ile tanısı insanların yüzdesi çok artmıştır. Bu çok immün kişi, yani, HIV-pozitif hasta ve kemoterapi ya da immünsupresif ilaçlar ile nakli³sonra gitti hasta sayısı yükseldikçe kaynaklanmaktadır. Amerika Birleşik Devletleri'nde yapılan bir gözetim çalışmada, Wisplinghoff ve ark. %9,5 nozokomiyal kan dolaşımına enfeksiyonların Candida türleri⁴tarafından kaynaklandığını gösterdi. Artan mantar enfeksiyonları ve kan dolaşımına enfeksiyonlar sırasında bulunan Candida türlerinin yükseltilmiş yüzde nedeniyle özellikle nedeniyle, nasıl bu patojen bağışıklık sisteminin kontrolü kaçar anlamak son derece olaydır önemli.

C. albicans Maya, blastospores, pseudohyphae ve⁵çevre koşullarına bağlı olarak hif gibi farklı morfolojik biçimlerde büyür şekilli bir mantar var. Hyphal haliyle C. albicans en yüksek invasiveness kapasitesini gösterir ve epitel⁶nüfuz yeteneği vardır.

C. albicans enfeksiyonlar birkaç deneysel yaklaşımlar kullanarak incelenmiştir. En yaygın enfeksiyon C. albicans Maya⁷İntravenöz enjeksiyon modelidir. Kan dolaşımına yaymak mantar yönetir önce ancak, bu model tüm işlemler bu olmasına göz önünde değil. Başka bir model C. albicans epiteli istila yeteneği yararlanır. Bu yöntem, olarak da bilinir zımpara kağıdı modeli⁸, Gaspari ve ark. 1998⁹tarafından geliştirilmiş ve böylece stratum korneum C. albicansuygulamadan önce ortadan kaldırarak cildi aşındırmak için zımpara kağıdı kullanmayı oluşur. Bu yordam, böylece bu patojen invaziv yeteneklerini analizini etkinleştirme epitel, nüfuz mantar verir. Son olarak, diğer modelleri enfeksiyonlar gastrointestinal¹⁰ ve solunum yolları¹¹ farklı çalışmalarda kullanılmaya başlandı.

(Olduğu gibi zımpara kağıdı modeli) bir yara oluşumu bağışıklık hücre işe alım ve harekete geçirmek, iyileşme süreci¹²teşvik etmek de dahil olmak üzere çeşitli yollar aktivasyonu neden olur. Bu alter veya maske bağışıklık yanıtı özellikle böylece sonuçları semptomlarıdır için önde gelen patojen karşı elde edildi.

Burada bir yöntemin ilk yara oluşumunu önler deri enfeksiyonu ve indüksiyon bazal inflamatuar ortamı açıklanmaktadır. Sağlam epitel yapısını korumak için biz doğrudan C. albicans hyphal haliyle derin derma enjekte et. Tek bir enjeksiyon hafif inflamasyon temin rağmen iltihap miktarı sınırlı ve sınırlı olduğu gibi kum kağıt modeli açık bir yara oluşumu ile karşılaştırıldığında. Biz burada tarif yaklaşım mantar enfeksiyonu ve mekanik zarar tarafından aşırı ve önceden varolan inflamatuar çevre kaçınırken yaymak için bağışıklık yanıtının çalışma sağlar.

Protokol

Tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) altında onaylanmış ve çocuklara hayvan kaynakları bölümü gözetimi altında işletilen hastane (kemer) Boston Çocuk Hastanesi'nde ya da İtalyan tarafından kabul edildi Sağlık Bakanlığı ve kurumsal hayvan bakımı Komitesi Üniversitesi Milano-Bicocca adlı altında gerçekleştirilen.

1. C. albicans hazırlık

1. Kültür C. albicans, zorlanma CAF3-1¹³, uridine (50 mg/L) 25 ° C'de ile takıma zengin Orta (Maya özü pepton Dekstroz (YEPD), %1 (w/v) Maya özü, % 2'si (w/v) Bacto pepton, %2 (w/v) glikoz) içeren tüpler Bu koşullar altında C. albicans bir Maya yetişir.
   Not: klinik C. albicans zorlanma SC5314¹³yalıtmak gibi diğer C. albicans suşları, kullanılabilir. Son zamanlarda ülseratif işlem doğuştan gelen bağışıklık sistemi¹⁴, teorik olarak, hücre duvarı bileşenleri ve yapısı, tutar her C. albicans zorlanma etkinleştirme tarafından indüklenen göstermiştir bu yana yanı sıra yetenek hyphal projeksiyonlar, köken için kullanılabilir.
2. Kültür bir hücre sayaç Çözümleyicisi'ni kullanarak hücresel konsantrasyon sayarak izlemek.
3. Yaklaşık 8 x 10⁶ hücre/mL bir konsantrasyon ulaştığında kültür hasat. Alternatif olarak, bir spektrofotometre OD₆₀₀ölçmek için kullanın.
   Not: Genellikle, OD₆₀₀ değeri = 1 karşılık gelen 3 x 10⁷ hücre/mL bir Maya konsantrasyon ama titrasyon tavsiye edilir.
4. Kültür YEPD-uridine orta, HEPES (50 mM, pH 7.5) bir arabellek Aracısı olarak kullanarak resuspend ve kültür 37 ° C'de hif oluşumu ikna etmek için kuluçkaya. 100 X büyütme, mikroskop altında hyphal oluşumu denetleyin. Hyphal görünür 5 h 37 ° C'de kültür sonra oluşumdur; Ancak, hyphal yüzde toplam kültür neredeyse % 95'i ulaştığında hücreleri 16 h 37 ° C'de kuluçka sonra kullanın.
5. Hyphal konsantrasyonu hazırlanmasında daha da zenginleştirmek için santrifüj aliquots 3300 x g 5 dakika süreyle de kültürünün süpernatant atın ve 1 x 10⁸ hif/mL bir konsantrasyon, steril PBS Pelet resuspend.

2. derin Dermal enjeksiyon

1. 24 saat önceden enfeksiyon yordamı ketamin (80-100 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) mayi enjeksiyonu ile fareler anestezi ve bir elektrik kesme makinesi kullanarak fare kanadını traş et.
   Not: etkin bir şekilde ele geçirdiler kadar fareler bir Isıtma lambası altında anestezi içeren herhangi bir işlemden sonra koyun.
2. Fareler için tıraş süreci nedeniyle herhangi bir inflamasyon önlemek 24 saat bekletin.
3. 24 saat sonra tıraş yordam anestezi ketamin (80-100 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) mayi enjeksiyonu ile fareler.
4. Pençe refleks fareler derin anestezi emin olmak için denetleyin. Pençe refleks sıkıca pençe pinching tarafından değerlendirmek. Anestezi sağlanır, hayvan acı hissetmez ve hareket etmez.
5. C. albicans hif içinde son hacmi 50 µL/enjeksiyon, 5 x 10⁶ hif/enjeksiyon için karşılık gelen bir 30 G x 8 mm iğne ile 0.3 mL insülin Ģırınga kullanarak derin derma enjekte.
   1. Traş kanadının cilt gergin derin derma doğrudan hacmindeki enjekte için iki parmak kullanarak çekin. Yukarı dönük olacak şekilde iğne eğimi ile 10-15 ° lik bir açı ile iğne yerleştirin.
   2. Bu açı ile patojen yaklaşık 300-500 µm derinliğe ile enjekte edilir. Enjeksiyon iyi performans sağlamak için kontrol enjekte birimi olduğunu bir yumru oluşturur bir kaç dk sonra enjeksiyon emilir.
      Not: enjeksiyon yaklaşık 1 cm²/ olacak sonra çarpmak kurdu. Bu moleküler ya da histolojik analizler için belirlenen zaman noktada kaldırılacak alandır.
   3. Birkaç dakika sonra emilir, enjeksiyon ile oluşan şişlik devam ederse bu yana daha az 24 h (önerilen) zaman puan için bir işaretleyici kalem ile enfeksiyon alanını işaretlemek. Ya ülser ya da bir kist açıkça görülebilir zaman puan için 24 saat veya daha fazla, bu adım gerekir, çünkü değil.

3. örnek toplama ve histolojik boyama için hazırlanması

1. Kurumsal yordamlara göre fareler ötenazi.
2. Cerrahi forseps kullanarak, eklenen sitenin daha önce marker kalemle işaretlenmiş sınırında cilt çek. Cerrahi makas kullanırken, virüslü sitesi işaretli çizgi takip deri kesim tarafından tüketim.
   Not: deri yuvarlak uç makas kullanarak periton ayırmak dikkatli olun.
3. En iyi kesim ısı ile (OCT) bileşik, iç tarafı yukarı bakacak şekilde deri ile dolu bir tek kullanımlık temel kalıp ciltte bırakın. Bileşik beyaz hale gelinceye kadar örnek sıvı azot dondur. Yapmak değil Bu örnek zarar tamamen donmuş önce örnek kapak sıvı azot izin vermek.
   Not: dikkat! 3.3 adım sırasında sıvı nitrojen korunmak için bir yüz kalkan giymek.
4. Hızla bunları saklamak-80 ° C'de örnekleri slayt hazırlama için hemen kullanılmayacaksa,
   Not: Örnekleri-80 ° C'de süresiz olarak saklanır.

4. slaytların hazırlanması

1. Örnek örnek ortasından başlayarak Histoloji dilimleri hazırlamak için ikiye böldüm.
2. 5-µm ile bir cryostat kalın dilimler kesin.
   Not: deri örnekleri için cryostat sıcaklığı-25 ° C'nin daha yüksek olmamalı Daha yüksek bir sıcaklık H-Ekim kısmi erime neden olur ve bu nedenle örnekleri doğru pozisyonda kesme işlemi sırasında saklanması değil.
3. Pozitif yüklü mikroskop slayt dilimleri toplamak için kullanın.
4. Toplanan dilimleri yakında hazırlık sonra kullanılmazsa, bunları-20 ° C'de saklamak Bu noktada, dilimleri-20 ° C'de süresiz olarak depolanabilir.

5. Hematoksilen ve eozin boyama

1. Slaytları Gill'in hematoksilen 4 dk. Yıkama için daldırma tarafından musluk suyu 5 min için çalışan slaytlar leke.
2. Musluk suyu 5 dk. durulama için çalışan kullanarak slaytları slaytlar slayt 1 min. eozin Y çözüm daldırma tarafından yıkama leke distile su protokol devam etmeden önce.
3. Seri olarak etanol çözümleri (% 50, % 70, %80, % 95, % 100) konsantrasyonları artan daldırma tarafından kurutmak. 15 slaytlarını sokmak her etanol çözüm s.
4. Histolojik Temizleme Aracısı daldırma tarafından en az 2 dk slaytlarını temizleyin.
5. Montaj orta ve kapak paket fişi kullanarak slaytları bağlayın.
6. 40 X büyütme, mikroskop slayt tarayıcı ile slaytlar görüntülerini elde.

6. periyodik asit-Schiff (PAS) boyama

1. Slaytları slaytlar musluk suyu 1 dk. için çalışan ≥99.5% aseton, oda sıcaklığında 1 dk. yıkama ile tamir et.
2. Slaytları periyodik asit çözüm (1 g/dL) daldırma tarafından distile su 3 değişiklikler slayt 5 dk. yıkama leke.
3. Slaytları Schiff'ın reaktif 15 dk. Yıkama için daldırma tarafından musluk suyu 5 min için çalışan slaytlar leke.
4. 5 dk. yıkamak için musluk suyu 30 için çalışan slaytları slaytlar Gill'in hematoksilen daldırma tarafından leke s.
5. % 100 etanol 3 değişiklikler daldırma tarafından slaytları kurutmak. 15 slaytlarını bırakın s her zaman.
6. Histolojik Temizleme Aracısı daldırma tarafından en az 2 dk slaytlarını temizleyin.
7. Montaj orta ve kapak paket fişi kullanarak slaytları bağlayın.
8. Slaytları görüntülerini elde etmek mikroskop slayt tarayıcı ile.

7. örnek toplama ve RNA çıkarılması için hazırlık

1. Kurumsal yordamlara göre fareler ötenazi. Deri örnekleri olduğu gibi adım 3.2 kaldırın.
2. Reaktif asit guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform çıkarılması için 1 mL ile 2 mL ek-kapiler tüp örneklerinde bırakın.
   Not: Burada protokol duraklatılmış ve örnekleri-80 ° C'de depolanan
3. Örnek yaklaşık 0.2 cm² cerrahi forseps kullanarak parçalar halinde kesin.
   Not: dikkat! Reaktifler RNA izolasyonu için çoğu toksik ve mutajenik. Adım 7,3 ve 7.4 gerekir duman başlık altında yapılması.
4. Alternatif olarak örnek 20 dakika süreyle 20 salınımlarını/s hızında bir boncuk fabrikası ile şut, mekanik bir çömlekçi kullanılabilir.
5. Örneklerin etkili homojenizasyon bozulmamış deri parçalarının varlığı için bakarak kontrol edin. Örnekleri değil tamamen homojen Eğer bu adımı yineleyin.
6. Örnekleri 16.000 x g 1 dk. tutun, supernatants RNA çıkarılması için santrifüj kapasitesi ve Pelet atın. Bu adımı kıl ve enkaz çıkarma sütunlar engelleyebiliriz ortadan kaldırmak için gerçekleştirilir.
7. RNA arıtma sütunları¹⁴kullanarak RNA çıkarma ile devam edin.
8. Bir spektrofotometre RNA arıtma ve toplama değerlendirmek için kullanın. RNA özleri cDNA hazırlık için hemen kullanılmazsa, örnekleri-80 ° C'de depolayın

Sonuçlar

Doğrudan içinde derin derma patojen sızdırma yoluyla yapısal morfolojisi doku sağlam (Şekil 1A) kalır.

Cilt yapısal bütünlük bakımından bağışıklık hücreleri tespiti ve enfeksiyon yerinde onların yerelleştirme sağlar. Şekil 1B adımında gösterilen yüksek büyütme ortaya koymaktadır apse esas olarak enfeksiyon sitesine onun doğumdan tarafınd...

Tartışmalar

Burada biz bir yöntem C. albicans enfeksiyon mantar derin derma girişte üzerine başlatılan enflamatuar süreç çalışmaya nitelendirdi.

Cilt apse oluşumu üzerine C. albicans enfeksiyon¹⁵nispeten nadir bir olay olsa bile, enjeksiyon doğrudan içinde derin derma mantar mantar tahrik apse oluşumu çalışma, hem de belirli bağışıklık analizini sağlar mantar içerecek şekilde katılmak hücreleri yayıldı. Burada açıklanan yöntemle, b...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound	histo-line laboratories	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic	histo-line laboratories	09-209-05
Ethanol absolute	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, mounting medium	bio-optica
Acetone	sigma-aldrich	179124
PAS staining system	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
liquid nitrogen			Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle	BD	324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable	histo-line laboratories	2781
Positively charged bio microscope slides	bio-optica	09-2000
Cover slips 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998