Глубокий дермальный инъекции как модель кожи инфекции Candida albicans для гистологического анализа

Резюме

Здесь мы описываем протокол, который позволяет гистологические и молекулярный анализ образцов кожи после Candida albicans внутрикожные инъекции. Этот протокол поддерживает структурную целостность кожи и позволяет для локализации ткани резидентом или вновь набранных иммунных клеток, а также распространение возбудителя.

Аннотация

Кожа является чрезвычайно длительного органом тела, и, благодаря этой большой поверхности, постоянно подвергается воздействию микроорганизмов. Повреждения кожи может легко привести к инфекции в дерме, которая может в свою очередь, привести к распространению патогенов в кровоток. Понимание как иммунная система борется инфекции на самом раннем этапе и как хост может устранить патогены является важным шагом для задания базы для будущих терапевтических вмешательств. Здесь мы описываем модель инфекции Candida albicans , которая может визуализировать процессы, которые происходят в начале во время инфекции, включая когда возбудитель прошел эпителиальных барьер, а также вызвал C. albicans иммунного ответа вторжения. Мы использовали модель этой инфекции для выполнения гистологические анализы, которые показывают иммунные клетки, которые проникнуть в кожу, а также присутствие и локализации возбудителя. Отбор проб после инфекции могут быть обработаны для извлечение RNA.

Введение

Человеческое тело покрыто чрезвычайно большое количество микроорганизмов. Поверхность кожи обитает почти один миллион бактерий на¹квадратный сантиметр. Это число, однако, не отражает полное разнообразие микроорганизмов, что колонизирует кожи. В дополнение к бактерии человеческое тело колонизирована многих грибковых видов, включая C. albicans, которая способна выжить на слизистых оболочек и кожи уровня².

В последние годы доля людей с диагнозом грибковые инфекции значительно увеличилась. Это объясняется главным образом большее количество лиц с ослабленным иммунитетом, т.е., ВИЧ позитивных пациентов и пациентов, которые прошли через химиотерапии или иммуносупрессивных препаратов после трансплантации³. В наблюдения исследования, проведенного в Соединенных Штатах Америки Висплингхофф et al. показал, что 9,5% от внутрибольничных инфекций кровотока были вызваны Candida видов⁴. Из-за увеличения возникновения грибковых инфекций и особенно из-за повышенных процент видов Candida , найден во время инфекций кровотока понимание того, как этот возбудитель ускользает от контроля иммунной системы является чрезвычайно важное значение.

C. albicans является диморфных грибов, которые растут в различных морфологических форм, таких как дрожжи, blastospores, pseudohyphae и ГИФы в зависимости от условий окружающей среды⁵. В виде гиф C. albicans показывает свой высокий потенциал инвазии и имеет способность проникать в эпителии⁶.

C. albicans инфекции были изучены с использованием нескольких экспериментальных подходов. Наиболее распространенная модель инфекции является внутривенным введением C. albicans дрожжи⁷. Однако эта модель не принимать во внимание все процессы, произойдет перед гриб успевает распространяться в кровоток. Другая модель использует C. albicans возможность вторгнуться в эпителии. Этот метод, также известный как наждачная бумага модель⁸, был разработан Гаспари et al. 1998⁹и состоит в использовании наждачной бумагой, чтобы стирать кожу, тем самым устраняя рогового слоя перед нанесением C. albicans. Эта процедура позволяет гриб проникнуть эпителия, таким образом позволяя анализ инвазивных способностей данного патогена. Наконец другие модели инфекций желудочно-кишечного тракта¹⁰ и¹¹ дыхательных путей были использованы в различных исследованиях.

Формирование раны (как наждачная бумага модель) приводит к активации несколько путей, включая набор иммунных клеток и активации, с тем чтобы содействовать исцеления процесса¹². Это можно изменить или замаскировать иммунный ответ, специально вызвало против возбудителя, что приводит к смешанным результатам.

Здесь мы описываем метод инфекции кожи, что позволяет избежать формирования первоначальной раны и индукции базальной воспалительных окружающей среды. Чтобы сохранить нетронутыми эпителиальные структуры, мы напрямую впрыскивают C. albicans в виде гиф в глубокой дермы. Даже несмотря на то, что одной инъекции может вызывать воспаление мягкой, количество воспаления ограничена и ограничены по сравнению с формирования открытой раной как наждачная бумага модели. Подход, который мы здесь описывать позволяет изучение иммунного ответа на грибковой инфекции и распространение, избегая чрезмерного и существующие воспалительных среды, вызванных механического повреждения.

протокол

Все процедуры были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) и действует под надзором департамента животноводства на детей в больнице (Арка) в Бостон Детская больница или были утверждены итальянский Министерство здравоохранения и исполнил под организационного комитета уход животных на Университет Милан-Бикокка.

1. Подготовка C. albicans

1. Культура C. albicans, штамм CAF3-1-¹³, в пробирки, содержащие богатый средний (дрожжевой экстракт Пептон Декстроза (YEPD), экстракт дрожжей 1% (w/v), 2% (w/v) Bacto Пептон, 2% (w/v) глюкозы) дополнены уридина (50 мг/Л) при 25 ° C. В этих условиях C. albicans растет как дрожжи.
   Примечание: Можно использовать другие штаммы C. albicans , такие, как клинических изолировать C. albicans штамм SC5314¹³. Поскольку мы недавно продемонстрировали, что язвенный процесс индуцируется активации иммунной системы¹⁴, теоретически каждый штамм C. albicans , который сохраняет ее компоненты клеточной стенки и структура, а также возможность происходят гиф прогнозы, могут быть использованы.
2. Следить за культуру, считая сотовой концентрации, с помощью анализатора счетчик клеток.
3. Урожай культуры, когда он достигает в концентрации около 8 х 10⁶ клеток/мл. Кроме того используйте спектрофотометр для измерения ОД₆₀₀.
   Примечание: Как правило, значение₆₀₀ OD = 1 соответствует к концентрации дрожжей 3 x 10⁷ кл/мл, но рекомендуется титрования.
4. Ресуспензируйте культуры в среде YEPD-уридина, используя HEPES (50 мм, pH 7.5) как агент буфера и инкубировать и культуры при 37 ° C побудить гифы формирования. Проверьте гиф формирования под микроскопом на 100 крат. Гиф формирование является видимым 5 ч после культивирования при 37 ° C; Однако используйте клетки 16 h после инкубации при 37 ° C, когда гиф процент достигает почти 95% общей культуры.
5. Для дальнейшего обогащения подготовки в гиф концентрации, центрифуги аликвоты культуры на 3300 x g для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в стерильных PBS в концентрации 1 x 10⁸ гифы/мл.

2. глубоко кожных инъекций

1. 24 h перед процедурой инфекции, анестезировать мышей с внутрибрюшинного введения кетамин (80-100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) и затем побрить фланг мышей с использованием электрической машинки.
   Примечание: После любой процедуры, связанные с анестезией, место мыши под лампой Отопление до тех пор, пока они эффективно восстановлены.
2. Наведите мышь на 24 часа избежать любых воспаление из-за процесса бритья.
3. 24 ч после бритья процедуры, анестезировать мышей с внутрибрюшинного введения кетамин (80-100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг).
4. Проверьте лапы рефлекс для обеспечения глубоко наркозом мышей. Оцените рефлекс лапы прочно щипать лапы. Если достигается обезболивание, животное не чувствует боли и не двигаться.
5. Придать C. albicans ГИФы в глубокой дермы с помощью инсулина 0,3 мл шприц с иглой 30 G x 8 мм в окончательный объем 50 мкл/инъекции, соответствующий 5 х 10⁶ гифы/инъекции.
   1. Потяните кожу бритая фланка тугой, с помощью двух пальцев для того, чтобы придать объем непосредственно в глубокой дермы. Вставьте иглу с углом 10-15° с скос иглы вверх.
   2. С этой точки зрения будет выведена возбудителя с глубиной примерно 300-500 мкм. Чтобы убедиться, что инъекции хорошо выполняется, проверьте введенный объем образует удар, который является всасывается через несколько минут после инъекции.
      Примечание: Удар, сформированного после инъекции будет примерно 1 см². Это области, которые будут удалены в назначенное время точке для молекулярной или гистологического анализа.
   3. Для моментов времени менее чем за 24 часа (рекомендовано) Марк области инфекции с маркером, так как удар с инъекции сохраняется за несколько минут, после чего она поглощается. Для точек времени 24 часа или более этот шаг не является обязательным, потому что язва или киста будет отчетливо видна.

3. образец коллекции и подготовки для гистологической пятнать

1. Усыпить мышей согласно организационных процедур.
2. Используя Щипцы хирургические, потяните кожу на границе вводят сайта, предварительно помеченные маркером. С помощью Ножницы хирургические, акцизных зараженного сайта путем разрезания кожи после помеченной строки.
   Примечание: Будьте осторожны, чтобы отделить кожу от брюшины, круглым наконечником ножницами.
3. Погружайте кожи в одноразовые базы плесень, заполнены с оптимального раскроя температуры (OCT) соединение, с внутренней стороны кожи, обращенной вверх. Заморозить образца в жидком азоте до тех пор, пока соединение становится белым. Не позволяйте жидкого азота покрытия образца, прежде чем он полностью заморожен как это может повредить образец.
   Примечание: осторожно! Во время шага 3.3 носите щит для защиты от жидкого азота.
4. Если образцы не используются непосредственно для подготовки слайдов, быстро Храните их при температуре-80 ° C.
   Примечание: Образцы можно хранить при температуре-80 ° C бесконечно.

4. Подготовка слайдов

1. Пополам образец подготовить ломтики для гистологии, начиная от центра образца.
2. Вырежьте 5 мкм толстые ломтики с криостата.
   Примечание: Для образцов кожи, температура криостата не должна превышать-25 ° C. Более высокой температуры вызовет частичного плавления H-OCT и поэтому образцы не сохранится в правильном положении во время процедуры резки.
3. Использование положительно заряженных Микроскоп слайды для сбора фрагментов.
4. Если собранные фрагменты используются не вскоре после подготовки, храните их при-20 ° C. На данный момент фрагменты могут храниться при-20 ° C на неопределенный срок.

5. гематоксилином и эозином

1. Пятно слайды путем погружения в гематоксилином Гилл в 4 мин мыть слайды в проточной водой в течение 5 мин.
2. Пятно слайды путем погружения в раствор эозина Y для 1 min. мыть слайды струей водопроводной воды для 5 минут промыть слайды с помощью дистиллированной воды перед продолжением протокол.
3. Обезвоживаются путем погружения в серийно увеличения концентрации растворов этанола (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Погружать слайды для 15 s в каждом растворе этанола.
4. Снимите слайды для по крайней мере 2 мин путем погружения в гистологической таможенного агента.
5. Смонтируйте слайды с помощью монтажа средних и скользит крышка.
6. Получение изображений слайдов с микроскопом слайд сканер на 40 кратном.

6. Периодическая кислоты Шифф (ССА) пятнать

1. Исправьте слайды с ≥99.5% ацетона при комнатной температуре за 1 мин мыть слайды в проточной водой за 1 мин.
2. Пятно слайды путем погружения в раствор периодической кислоты (1 г/дл) для 5 минут мыть слайды в 3 сменах дистиллированной воды.
3. Пятно слайды путем погружения в Шифф 's реагент для 15 мин мыть слайды в проточной водой в течение 5 мин.
4. Пятно слайды путем погружения в гематоксилином Гилл за 5 минут вымыть слайды в проточной водой для 30 s.
5. Слайды обезвоживаются путем погружения в 3 изменения 100% этанола. Погружать слайды для 15 s каждый раз.
6. Снимите слайды для по крайней мере 2 мин путем погружения в гистологической таможенного агента.
7. Смонтируйте слайды с помощью монтажа средних и скользит крышка.
8. Получение изображений слайдов с микроскопом слайд сканер.

7. образец коллекции и подготовка к РНК добыча

1. Усыпить мышей согласно организационных процедур. Удаление кожных проб как в шаге 3.2.
2. Погружайте образцов в 2-мл пробирку оснастки колпачок с 1 мл раствора реагента для извлечения тиоцианат фенол хлороформ кислоты Гуанидиновые.
   Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь и образцы можно хранить при температуре-80 ° C.
3. Нарежьте кусочки примерно 0,2 см² с использованием Щипцы хирургические образца.
   Примечание: осторожно! Большинство реагентов для изоляции RNA токсичных и мутагенными свойствами. Шаги 7.3 и 7.4, должно быть сделано под вытяжного шкафа.
4. Разбить образца с бисерная мельница со скоростью 20 колебаний в секунду на 20 мин в качестве альтернативы, механических Поттер может использоваться.
5. Проверка эффективного гомогенизации образцов, глядя на наличие неповрежденной части кожи. Повторите этот шаг, если образцы не являются полностью гомогенизации.
6. Центрифугуйте образцы на 16000 x g за 1 мин держать supernatants для РНК добыча и отбросить гранулы. Этот шаг выполняется для устранения волосы и мусор, которые могут блокировать извлечения столбцов.
7. Приступайте к РНК добыча с помощью РНК Очищение колонки¹⁴.
8. Используйте спектрофотометр для оценки РНК и концентрации. Если РНК экстракты не используются непосредственно для приготовления cDNA, хранения образцов-80 ° C.

Результаты

Через инъекции возбудителя непосредственно в глубокой дермы структурной морфологией ткани остается неизменным (рис. 1A).

Поддержания структурной целостности кожи позволяет обнаружение иммунных клеток и их локализация...

Обсуждение

Здесь мы описали метод C. albicans инфекции для изучения воспалительный процесс, который инициируется при грибковых вход в глубокой дермы.

Несмотря на то, что формирование абсцесса кожи является относительно редким явлением на C. albicans инфекции¹⁵, инъекци...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound	histo-line laboratories	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic	histo-line laboratories	09-209-05
Ethanol absolute	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, mounting medium	bio-optica
Acetone	sigma-aldrich	179124
PAS staining system	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
liquid nitrogen			Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle	BD	324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable	histo-line laboratories	2781
Positively charged bio microscope slides	bio-optica	09-2000
Cover slips 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998