Tief dermalen Injektion als ein Modell von Candida Albicans Infektion der Haut für histologische Analysen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll, histologische und molekulare Analyse von Hautproben nach Candida Albicans intradermale Injektion ermöglicht. Dieses Protokoll hält die strukturelle Integrität der Haut und erlaubt die Lokalisierung von Gewebe-Resident oder neu rekrutierten Immunzellen sowie die Verteilung der Erreger.

Zusammenfassung

Die Haut ist ein extrem erweiterten Organ des Körpers, und durch diese große Oberfläche ist es kontinuierlich Mikroorganismen ausgesetzt. Hautschäden kann leicht zu Infektionen in der Dermis führen, was wiederum bei der Verbreitung von Krankheitserregern in die Blutbahn führen kann. Verstehen, wie das Immunsystem bekämpft Infektionen im sehr frühen Stadium und wie der Host die Erreger beseitigen kann, ist ein wichtiger Schritt um die Basis für zukünftige therapeutische Interventionen gesetzt. Hier beschreiben wir ein Modell der Candida Albicans -Infektion, die die Prozesse zu, die früh während einer Infektion visualisieren, auch wenn der Erreger ist die epitheliale Barriere sowie die Immunantwort ausgelöst durch die C. Albicans vergangen auftreten Invasion. Diese Infektionsmodell verwendet, histologische Analysen durchzuführen, die die Immunzellen zu zeigen, die die Haut sowie die Präsenz und die Lokalisation des Erregers zu infiltrieren. Proben gesammelt, nachdem die Infektion für die RNA-Extraktion verarbeitet werden kann.

Einleitung

Der menschliche Körper ist mit einer extrem hohen Anzahl von Mikroorganismen bedeckt. Die Hautoberfläche ist der Lebensraum von fast 1 Million Bakterien pro Quadratzentimeter¹. Diese Zahl spiegelt jedoch nicht die ganze Vielfalt der Mikroorganismen, die die Haut kolonisiert. Neben Bakterien ist der menschliche Körper kolonisiert durch viele Pilzarten, darunter C. Albicans, die in der Lage, sowohl auf die Schleimhaut und die Haut Ebene²überleben.

Der Anteil der Menschen mit der Diagnose mit Pilzinfektionen sind in den letzten Jahren enorm gestiegen. Dies ist vor allem aufgrund der höheren Anzahl von immungeschwächten Personen, d. h., HIV-positiven Patienten und Patienten, die entweder durch Chemotherapie oder Immunsuppressiva nach Transplantation³gegangen. In einer Überwachung Studie in den Vereinigten Staaten zeigten Wisplinghoff Et Al. , dass 9,5 % der Blutbahn Nosokomialinfektionen durch Candida Spezies⁴verursacht wurden. Durch das vermehrte Auftreten von Pilzinfektionen und vor allem wegen der erhöhten Anteil der Candida -Spezies bei Infektionen der Blutbahn gefunden wird verstehen, wie diese Erreger die Steuerung des Immunsystems entkommt extrem wichtig.

C. Albicans ist ein dimorphen Pilz, der in verschiedenen morphologischen Formen wie Hefe, Blastospores, Pseudohyphae und Hyphen abhängig von den Umgebungsbedingungen⁵wächst. In seiner bodenaggregaten Form C. Albicans zeigt seine höchste Kapazität der Invasivität und hat die Fähigkeit, das Epithel⁶durchdringen.

C. Albicans Infektionen sind mit mehreren experimentellen Ansätzen untersucht worden. Das häufigste Modell der Infektion ist die intravenöse Injektion von C. Albicans Hefe⁷. Jedoch wird dieses Modell nicht alle Prozesse, die passieren berücksichtigt bevor der Pilz schafft es in die Blutbahn zu verbreiten. Ein weiteres Modell nutzt die Fähigkeit von C. Albicans , das Epithel einzudringen. Diese Methode, auch bekannt als das Schleifpapier Model⁸, wurde von Gaspari Et Al. 1998⁹entwickelt und besteht aus die Haut, wodurch das Stratum Corneum vor dem Auftragen von C. AlbicansSchleifen mit Schleifpapier. Dieses Verfahren ermöglicht den Pilz, das Epithel, so dass die Analyse der invasiven Fähigkeiten des Erregers zu durchdringen. Zu guter Letzt wurden andere Modelle von Infektionen für die Magen-Darm-¹⁰ und Atemwege¹¹ in verschiedenen Studien verwendet.

Die Bildung einer Wunde (wie im Sand Papiermodell) bewirkt die Aktivierung von mehreren wegen, einschließlich Immunzelle Rekrutierung und Aktivierung, um den heilenden Prozess-¹²zu fördern. Dies kann entweder ändern oder maskieren der Immunantwort, die speziell gegen den Erreger, wodurch verwirrende Ergebnisse ausgelöst.

Hier beschreiben wir eine Methode der Infektion der Haut, die ursprüngliche Wunde Bildung vermeidet und die Induktion einer basalen entzündlichen Umgebung. Um die intakte epitheliale Struktur beizubehalten, injizieren wir direkt C. Albicans in seiner bodenaggregaten Form in die Tiefe Derma. Obwohl eine einzelne Injektion leichte Entzündung hervorrufen kann, ist die Menge der Entzündung begrenzt und eingeschränkt im Vergleich zur Bildung einer offenen Wunde wie Schleifpapier-Modell. Der Ansatz, den wir hier beschreiben ermöglicht die Untersuchung der Immunantwort auf Pilzinfektion und Ausbreitung die übermäßige und bereits vorhandene entzündliche Umwelt durch mechanische Beschädigungen zu vermeiden.

Protokoll

Die Verfahren wurden alle unter den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt und unter der Aufsicht des Department of Animal Resources bei Kindern betrieben's Hospital (Bogen) am Krankenhaus Boston der Kinder oder wurden von den italienischen genehmigt Ministerium für Gesundheit und unter institutionellen Animal Care Committee der Universität Mailand-Bicocca durchgeführt.

1. C. Albicans Vorbereitung

1. Kultur C. Albicans, Stamm CAF3-1¹³, in Röhrchen mit reichen Medium (Hefe-Extrakt Pepton Traubenzucker (YEPD), 1 % (w/V) Hefeextrakt, 2 % (w/V) von Bacto Pepton, 2 % (w/V) Glukose) ergänzt mit Uridin (50 mg/L) bei 25 ° C. Unter diesen Bedingungen wächst C. Albicans als eine Hefe.
   Hinweis: Andere C. Albicans -Stämme können verwendet werden, wie z. B. die klinische C. Albicans Stamm SC5314¹³isolieren. Da wir vor kurzem gezeigt haben, dass die Colitis Prozess durch die Aktivierung des angeborenen Immunsystems¹⁴, theoretisch jede C. Albicans Belastung induziert wird, die ihre Zellwand-Komponenten und Struktur beibehält sowie die Fähigkeit, stammen von bodenaggregaten Projektionen genutzt werden.
2. Überwachen Sie die Kultur durch die zelluläre Konzentration mit einer Zelle Zähler Analyzer zählen.
3. Ernten Sie die Kultur, wenn es eine Konzentration von etwa 8 x 10⁶ Zellen/mL erreicht. Alternativ können Sie ein Spektralphotometer um OD₆₀₀zu messen.
   Hinweis: In der Regel einen Wert von OD₆₀₀ = 1 entspricht einer Hefe-Konzentration von 3 x 10⁷ Zellen/mL, Titration wird jedoch empfohlen.
4. Aufschwemmen der Kulturkreis in YEPD-Uridin Medium, mit HEPES (50 mM, pH 7,5) als ein Puffer-Agent und inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C, Hyphen Bildung zu induzieren. Überprüfen Sie bodenaggregaten Bildung unter dem Mikroskop bei 100 X Vergrößerung. Bodenaggregaten Formation ist sichtbar 5 h nach Kultivierung bei 37 ° C; jedoch verwenden Sie die Zellen 16 h nach der Inkubation bei 37 ° C erreicht der bodenaggregaten Anteil fast 95 % der gesamten Kultur.
5. Um die Vorbereitung in bodenaggregaten Konzentration weiter zu bereichern, Zentrifuge Aliquote der Kultur bei 3.300 x g für 5 min. überstand verwerfen und das Pellet in sterilen PBS in einer Konzentration von 1 x 10⁸ Hyphen/mL Aufschwemmen.

2. tief dermalen Injektion

1. 24 h vor der Infektion-Verfahren, die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) zu betäuben und dann die Flanke der Mäuse mit einer elektrischen Haarschneidemaschine rasieren.
   Hinweis: Nach jedem Eingriff mit Narkose, legen Sie die Mäuse unter einer Wärmelampe bis sie effizient erholt haben.
2. Ruhen Sie die Mäuse für 24 h, eine Entzündung durch die Rasur-Prozess zu vermeiden.
3. 24 h nach dem Eingriff rasieren zu betäuben die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg).
4. Überprüfen Sie die Pfote Reflex um sicherzustellen, dass die Mäuse tief betäubt sind. Beurteilen Sie die Pfote Reflex fest Kneifen die Pfote. Wenn die Narkose erreicht ist, wird das Tier keine Schmerzen empfinden und bewegt sich nicht.
5. Spritzen Sie C. Albicans hyphen in die Tiefe Derma mit einer 0,3 mL Insulin Spritze mit einer Nadel 30 x 8 mm in einem Endvolumen von 50 µL/Injektion, entspricht 5 x 10⁶ Hyphen/Injektion.
   1. Ziehen Sie die Haut der rasierte Flanke straff mit zwei Fingern um die Lautstärke direkt in die Tiefe Derma zu injizieren. Stechen Sie die Nadel mit einem Winkel von 10-15° mit der schräge der Nadel nach oben.
   2. Mit diesem Winkel wird der Erreger mit einer Tiefe von etwa 300-500 µm injiziert werden. Um sicherzustellen, dass die Injektion gut ausgeführt wird, überprüfen Sie, dass das injizierte Volumen bildet eine Beule, die ist wenige Minuten nach der Injektion absorbiert.
      Hinweis: Die Beule gebildet nach die Injektion von ca. 1 cm²sein wird. Dies ist der Bereich, der zum festgelegten Zeitpunkt für Molekulare oder histologische Analyse entfernt wird.
   3. Markieren Sie für Zeitpunkte von weniger als 24 Stunden (empfohlen) den Bereich der Infektion mit einem Marker, da die Beule gebildet mit der Injektion für ein paar Minuten bleibt nach dem es absorbiert wird. Für Zeitpunkte von 24 h oder mehr ist dieser Schritt nicht erforderlich, da ein Geschwür oder eine Zyste deutlich sichtbar ist.

3. Probieren Sie Sammlung und Aufbereitung für histologische Färbung

1. Die Mäuse nach institutionellen Verfahren einschläfern.
2. Chirurgische Pinzette verwenden, ziehen Sie die Haut an der Grenze des Standortes injiziert, zuvor mit dem Filzstift markiert. Mit Chirurgische Schere, Verbrauchsteuern der infizierten Webseite durch Schneiden der Haut nach der markierten Zeile.
   Hinweis: Achten Sie darauf, die Haut von das Bauchfell mit Rundspitze Schere zu trennen.
3. Tauchen Sie die Haut in einer Einweg-base Form gefüllt mit optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung, mit der Innenseite der Haut nach oben. Einfrieren der Probenmaterials in flüssigem Stickstoff, bis die Masse weiß wird. Nicht lassen Sie den flüssigen Stickstoff die Probe zu decken, bevor es vollständig gefroren ist, da dies die Probe beschädigen würde.
   Hinweis: Vorsicht! Während Schritt 3.3 tragen Sie einen Gesichtsschutz für Schutz von flüssigem Stickstoff.
4. Wenn die Proben nicht sofort für die Vorbereitung der Folie verwendet werden, speichern sie schnell bei-80 ° C.
   Hinweis: Proben können bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.

4. Vorbereitung der Folien

1. Halbieren Sie die Probe vorzubereiten die Scheiben für Histologie, ausgehend von der Mitte der Probe.
2. Schneiden Sie mit einem Kryostat 5 µm dicke Scheiben.
   Hinweis: Für Hautproben, sollte die Temperatur des Kryostaten nicht höher als-25 ° c werden Eine höhere Temperatur würde dazu führen, ein partielles Schmelzen des H-OAT und daher die Proben nicht aufrechterhalten würden in der richtigen Position während der Schneidvorgang.
3. Verwenden Sie positiv geladene Objektträger, um die Scheiben zu sammeln.
4. Wenn die gesammelten Scheiben nicht bald nach der Zubereitung verwendet werden, bewahren Sie sie bei-20 ° C. An dieser Stelle können die Scheiben bei-20 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.

5. Hämatoxylin und Eosin Färbung

1. Färben Sie den Folien durch Eintauchen in Gills Hämatoxylin für 4 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 5 min.
2. Färben Sie den Folien durch Eintauchen in Eosin Y-Lösung für 1 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 5 min. Spülen die Folien mit destilliertem Wasser, bevor Sie fortfahren des Protokolls.
3. Trocknen Sie durch Eintauchen in seriell steigenden Konzentrationen von Ethanol-Lösungen (50 %, 70 %, 80 %, 95 %, 100 % aus). Tauchen Sie die Folien für 15 s in jeder Ethanol-Lösung.
4. Deaktivieren Sie die Folien für mindestens 2 min durch Eintauchen in eine histologische Clearing Agent.
5. Montieren Sie die Folien mit Eindeckmittel und Deckel rutscht.
6. Abrufen von Bildern von Dias mit einem Diascanner Mikroskop bei 40 X Vergrößerung.

6. Perjodsäure-Schiff (PAS) Färbung

1. Befestigen Sie den Folien mit ≥99.5 % Aceton bei Raumtemperatur für 1 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 1 min.
2. Färben Sie den Folien durch Eintauchen in Perjodsäure Lösung (1 g/dL) für 5 min. Waschen Folien in 3 Änderungen von destilliertem Wasser.
3. Färben Sie den Folien durch Untertauchen im Schiff's Reagenz für 15 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 5 min.
4. Die Folien durch Eintauchen in Gills Hämatoxylin zu beflecken, für 5 min. Waschen Sie die Folien in fließendem Leitungswasser für 30 s.
5. Entwässern Sie die Folien durch Eintauchen in 3 Änderungen von 100 % Ethanol. Tauchen Sie die Folien für 15 s jedes Mal.
6. Deaktivieren Sie die Folien für mindestens 2 min durch Eintauchen in eine histologische Clearing Agent.
7. Montieren Sie die Folien mit Eindeckmittel und Deckel rutscht.
8. Abrufen von Bildern der Folien mit einem Mikroskop-Dia-Scanner.

7. Probieren Sie Sammlung und Aufbereitung für die RNA-Extraktion

1. Die Mäuse nach institutionellen Verfahren einschläfern. Die Hautproben wie in Schritt 3.2 zu entfernen.
2. Tauchen Sie die Proben in einem 2 mL Snap-Cap Röhrchen mit 1 mL Reagenz für saure Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion.
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und die Proben bei-80 ° c gelagert werden
3. Schneiden Sie die Probe in Stücke von ca. 0,2 cm² mit chirurgischer Pinzette.
   Hinweis: Vorsicht! Die meisten der Reagenzien zur RNA-Isolierung sind toxisch und mutagen. 7.3 und 7.4 Schritte müssen werden unter einem Abzug durchgeführt.
4. Die Probe mit einem Rührwerksmühle mit einer Geschwindigkeit von 20 Schwingungen/s für 20 min. Alternativ zu zerschlagen, mechanische Töpfer kann verwendet werden.
5. Überprüfen Sie die effektive Homogenisierung der Proben durch einen Blick auf das Vorhandensein von intakten Teile der Haut. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn die Proben nicht vollständig homogenisiert werden.
6. Zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 x g für 1 min. halten die Überstände für RNA-Extraktion und entsorgen Sie die Tablette. Dieser Schritt wird durchgeführt, um zu beseitigen, Haare und Schmutz, die die extraktionskolonnen blockieren könnten.
7. Gehen Sie mit RNA-Extraktion mittels RNA Reinigung Spalten¹⁴.
8. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um RNA-Reinigung und Konzentration zu beurteilen. Wenn RNA Extrakte für die cDNA-Vorbereitung nicht sofort verwendet werden, speichern Sie die Proben bei-80 ° C.

Ergebnisse

Durch die Injektion des Krankheitserregers direkt in die Tiefe Derma bleibt die strukturelle Morphologie des Gewebes intakt (Abbildung 1A).

Die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Haut ermöglicht die Erkennung von Immunzellen und ihre Lokalisation am Ort der Infektion. Die höhere Vergrößerung dargestellt in Abbildung 1 b zeigt, dass der Abszess ist v...

Diskussion

Hier haben wir eine Methode von C. Albicans -Infektion des entzündlichen Prozesses zu studieren, die auf Pilz Eingang in die Tiefe Derma initiiert wird.

Obwohl Haut Abszessbildung ein relativ seltenes Ereignis bei C. Albicans Infektion^{15 ist}, Injektion des Pilzes direkt in die Tiefe Derma ermöglicht es, nicht nur das Studium der Pilz-driven Abszessbildung, sondern auch die Analyse der spezifischen Immunantwort Zellen, die teilnehmen, um Pilz Ausbreit...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound	histo-line laboratories	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic	histo-line laboratories	09-209-05
Ethanol absolute	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, mounting medium	bio-optica
Acetone	sigma-aldrich	179124
PAS staining system	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
liquid nitrogen			Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle	BD	324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable	histo-line laboratories	2781
Positively charged bio microscope slides	bio-optica	09-2000
Cover slips 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998