ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

要約

蛋白質の集合とのショウジョウバエモデルの中枢神経系におけるオートファジーのフラックスの蛍光イメージングによる細胞生物学的研究から定量的なデータを抽出する単純なと適応のワークフローを開発しました。神経変性疾患。

要約

神経変性疾患の有病率上昇、ますます神経機能障害や損失につながる基本的な病態を理解することが重要です。まだイメージング研究から定量データを抽出するための公平な再現性のある、そしてアクセスのアプローチの必要性はまだ蛍光ベースのイメージング ツールとテクノロジを使用細胞神経生物学プロセスの前例のない分析.神経変性疾患のショウジョウバエモデルを用いた蛍光イメージング研究から定量的なデータを抽出する単純なと適応のワークフローを開発しました。具体的には、フィジー/ImageJ を使用した 2 つの細胞プロセスの分析に従って簡単、半自動化されたアプローチについて述べる: 最初に、私たち定量化タンパク質集計コンテンツとプロファイルを使用して蛍光タグ変異ショウジョウバエ視葉でhuntingtin 蛋白質;第二に、我々 はオートファジーのタンデム蛍光レポーターのレシオ メトリックに基づく定量化とショウジョウバエ視覚系におけるオートファジー ・ リソソーム フラックスを査定し、なさい。重要なは、ここで説明したプロトコルは、すべての蛍光灯の構造分析選択バイアスを最小化し、微妙な比較の解像度を上げるように半自動抽出法の手順を説明します。このアプローチは、他の細胞生物学的構造の分析の延長が可能し、同様、膜結合区画タンパク質涙点 (ストレス顆粒とシナプス複合体) などの神経変性疾患に関与するプロセス (ミトコンドリアと膜輸送小胞)。まだ適応参照画像の解析と定量化のためのポイントし、フィールド間で信頼性と再現性を促進し、最終的に神経変性のメカニズムの理解を高めるため、標準化されたこのメソッドを提供します。

概要

神経変性疾患は毎年数百万人に影響を与えるし、高齢化人口¹の発生率が増加しています。各神経変性疾患では、ユニークな病因を持っているが、誤って折りたたまれたタンパク質の凝集およびプロテオステイシス ネットワークの内訳は、これらの疾患の多くの共通の病理学的特徴です。これらの基礎的かつ相互に関連するプロセスの中断がゆがんで行く方法を解明神経の機能不全や細胞の死に貢献する治療上の介在を導くと同様、神経変性疾患を理解することにとって重要です。蛍光ベースのイメージング ニューロンにおけるこれらの複雑で動的なプロセスの調査と神経細胞生物学の私達の理解に大きく貢献しています。蛍光付けられた蛋白質の分析は挑戦的な特に実験生体内で、コンパクトな組織、多様な細胞の種類、形態の多様性などを行った。手動でアシスト定量化手頃な価格と簡単な多くの場合時間がかかり、人間バイアスの対象です。したがって、イメージング研究から定量データを抽出するための公平な再現性のある、そしてアクセスのアプローチの必要性があります。

蛍光イメージング研究の実験モデルから定量的なデータを抽出する強力で自由にアクセスできる画像処理ソフトウェア^2,3, フィジー/ImageJ を使用してワークフローをシンプルかつ適応を概説しました。ショウジョウバエを用いた神経変性疾患。蛋白質の集合とオートファジーのフラックスを定量化するこのプロトコルに従うことによって-2 つのセルの神経変性病に関連性の高い生物学的特徴-感度と再現性このアプローチのデモンストレーションを行った。ショウジョウバエ視葉における蛍光タグ変異ハンチンチン (Htt) タンパク質の解析では、数、サイズ、およびタンパク質凝集体の強度を明らかにしました。⁴コンパートメント環境に応じて異なる発光信号を表示するショウジョウバエ視覚系オートファジー フラックスのタンデム蛍光レポーターを可視化。タンデム記者のレシオ メトリック解析オートファゴソーム形成、成熟およびトランスポート、リソソームで分解するオートファジー ・ リソソーム フラックスの定量的かつ包括的なビューの許可し、脆弱性をさらに強調神経変性条件で破壊のコンパートメント。重要なは、両方の分析我々 はし無意識のバイアスを最小限に抑えるため、サンプリング力を高める同様の研究との比較を容易にする標準プロトコル半自動閾値処理と領域分割の手順が実装されます。簡単なワークフローは強力なフィジー/ImageJ プラグイン (数学的アルゴリズムに基づくコンピューター科学者によって開発された) のためにかと生命科学コミュニティにアクセス可能。

プロトコル

1. 注意事項と画像解析実験を設計するための準備

1. たとえば適切な解剖学的、携帯電話、または異なるサンプルの間で利益 (率 ROI) の地域を標準化するためのランドマークとして機能する細胞内のマーカーを事前に定義 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 膜マーカー、ローカライズされた蛍光タンパク質等
2. 興味の構造のバック グラウンド レベルを超える離散点を区切ることができます蛍光マーカーを選択します。
   注: このプロトコルは、タンパク質の構造 (例えば、誤って折りたたまれたタンパク質凝集体) と膜結合型細胞小器官 (例えば、オートファジー記者) に最適です。蛋白質の集合を可視化、138 の繰り返し (RFP hHttQ138) の病原性 polyQ 管とヒトの Htt 蛋白質 RFP タグ N 末端フラグメントは使用⁵です。変異体の Htt タンパク質は細胞質骨材elav GAL4^5,6など神経の特定のドライバーの下で表される場合を形成します。オートファゴソームとリソソームのフラックスを視覚化するには、アクチン GAL4は普遍的タンデム mCherry GFP Atg8a レポーターの発現をドライブに使用されました。mCherry と GFP 陽性を示す、オートファゴソームとフラックスが GFP 蛍光は蛋白質が低下⁷まで酸を区別しない mCherry に至ります、リソソームの酸性環境で急冷されことを監視します。レシオ メトリック解析構造の一貫したマーカーは、1 つのチャンネルを分割に使用されるまたは構造を記述する 2 つ以上のチャネルの投影を使用できます必要に応じて、明示的に述べたがこのプロトコルでできます。この例では、酸を区別しない、経路を介してフラックス中のコンパートメントに残ります Atg8 肯定的な粒子分離のための mCherry が使用されます。
3. オープン ソースの画像解析プラットフォーム ImageJ またはフィジー ダウンロードしてインストール — 優先配布で ImageJ のバンドルのプラグイン^2,3。
4. H マキシマ インタラクティブな流域のプラグインをインストールします。
   注: このプロトコルを使用してフィジー;追加プラグイン ImageJ の必要があります。SCF MPI CBG のブノワ ・ Lombardot によって開発されたプラグインは、利用可能なオンライン (https://imagej.net/Interactive_Watershed) です。
5. 移動"を助ける |「サイト更新管理」を選択"を更新、「ImageJ アップデーター」から SCF MPI CBG 更新サイトをリストから選択フィジーを再起動します。

2. 脳の解剖と免疫蛍光染色

1. シリコーンのエラストマー並んで解剖料理を作る。
   1. ビーカーに、製造元と徹底的に混合になるまでよく攪拌によって示されるエラストマー部品をシリコンに注ぐ。
   2. 5 cm に合わせてピペットを使用してティッシュの培養皿の 3 分の 1 の半分に完全な (エラストマー混合物の約 10 mL)。表面に上昇し、ティッシュ ペーパーで軽く削除任意の気泡を許可します。料理をカバーし、室温 (RT) で 48-72 時間を治すための平らな面の上に置きます。
2. ショウジョウバエ脳と視覚システムが必要に応じてを解剖します。
   1. 前述^8,9としてのショウジョウバエ脳解離を実行します。有害な組織や鉗子を避けるために脳を安定させるためにエラストマーの下部を使用して郭清のエラストマーが並ぶ料理の解剖を実行します。
   2. 解剖時に板をそのまま維持するには、網膜の下 2 つの鉗子をスライドさせ、優しく網膜を削除する目の真ん中を通って引き裂きます。板面に平行に開催鉗子で板に接続されている任意の網膜組織を引き離します。
      注: 残留色素は以下の手順で洗い流して、通常抗体染色・ イメージングと干渉しません。
   3. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 500 μ L の微量遠心チューブに 3.7% の最終的な集中を使用する前に新鮮なする 37% ホルムアルデヒドを希釈します。解決策と微量遠心チューブに切り裂かれた脳を転送し、穏やかな揺動を室温で 15 分間インキュベートします。
      注: ホルムアルデヒド ギ酸を生産に酸化する自然な傾向があります。したがって、それは因数、37% ホルムアルデヒド ストレージのために提案されると各使用前にたて 3.7% 希薄です。過剰固定またはアンダー固定組織と蛍光¹⁰の整合性に影響されます。
   4. PBTx で 3 回洗って (0.4% と PBS トリトン X-100) 15 分。
3. 免疫組織染色を行い、標本をマウントします。
   1. 抗体染色が必要な場合 PBTx を削除、PBTx で 5% ヤギ血清を希釈した一次抗体を加え、4 ° C で一晩因数ミキサーでインキュベート
   2. 一次抗体を削除し、PBTx で各 15 分の 3 回を洗います。PBTx で 5% ヤギ血清を希釈した二次抗体を追加し、RT で 1 時間インキュベートまたは 4 ° C で一晩PBTx で各 15 分の 3 回を洗ってください。
   3. DAPI 染色が必要な場合 PBTx を削除、DAPI 溶液を追加 (貯蔵液: 5 mg/mL を 15 μ G/ml PBTx での作業濃度に希釈)、各 15 分の PBTx で 3 回した洗浄で 10 分間インキュベートし、。
   4. 組織をオフに、両面テープの 1 つのレイヤーのスペーサーと顕微鏡スライドの中央に取り付け中のドロップを配置します。転送実装中のドロップに脳と脳が透明になるまで 1-2 分待ちます。ピペットでメディアをマウントを慎重に取り外します。
   5. マウントするには、スライド上脳に新鮮な取付中のドロップを適用します。慎重に泡を回避するカバーガラスをオーバーレイします。ゴム系のエッジをシールし、20 分進む最良の結果のためのイメージ取得の常温空気乾燥します。

3. 画像の取得

1. 顕微鏡集録パラメーター、空間分解能、目的、スキャン速度、ズームなどを最適化し、ステップ サイズ、画像解析中に半自動抽出法を容易にする興味の構造の解像度を最大にします。
   メモ: サンプル イメージをキャプチャし、すべての実験試料のイメージングの前に (のこのプロトコル手順 5) 半自動抽出法をテストすると便利場合があります。この方法ではユーザーは分析ツールが興味の生物学的構造を容易に見分けることができるように、画像設定を調整できます。
2. 最高の信号対雑音比と試料の高ダイナミック レンジをキャプチャするイメージ検出器のコントロールを調整します。
   1. ピクセルの彩度 (露出高すぎる) か (図 3 b、赤はこんにちは/低 LUT によってピクセルの彩度を示す) の設定を調整しながらの不飽和 (余りに低いオフセット) を示します LUT (ルックアップ テーブル) を使用します。
   2. ゲインとオフセットの設定は、実験操作可能性があります興味の構造の変更すべての実験群の適切なを確認します。
      注: 定量的な比較を行うためすべてのグループに対して同じの設定を使用することが不可欠です。
3. すべてのデータをキャプチャする組織をイメージ。
   注: お勧め 1 つイメージング セッション中に利用可能なデータのすべてをキャプチャし、必要に応じて、手順 4 で ROI 選択中により正確な領域を定義します。
4. 集録パラメーター空間キャリブレーションなどのメタデータを保持するためには、イメージング ソフトウェアでサポートされているファイルの種類として、イメージを保存します。実験の日、遺伝的背景、および蛍光レポーターの抗体を含むファイル名で画像を保存または [実験グループ名] _ [標本名] _ [実験日] _Ch1. などスキャンしたチャンネルに対応する染料 [Fluorophore ターゲット/Dye]_Ch2.[Fluorophore-target/Dye]など

4. フィジー/ImageJ イメージのインポートと投資収益率の選択

1. フィジーでイメージを開きます。「バイオ形式読み込みオプション」ダイアログ ボックスを使用して、選択"とスタックの表示: Hyperstack"設定と"カラーモード: グレースケール」。
   注: 空間キャリブレーションはフィジーで読むことができますよう、メタデータとして顕微鏡ファイルの種類を開くにはそれをお勧めします。
2. 単一の z 平面または標本 (図 1、投資収益率の選択) の間で標準化された投資収益率として使用できるマーカー チャネルに基づく投影法から地域を特定します。
   1. 手順 1.1 で指定されたマーカーをキャプチャするために使用するチャネルを表示するのには"C"スクロール バーを使用します。
   2. "Z"のスクロール バーを使用すると、焦点面を移動します。1 つのスライスを選択するかをクリックして複数のスライスの射影を作成「画像 |スタック |運命の Z 計画"とセット」開始スライス"と「ストップ スライス」ROI を包含します。
      注: "投影の種類を設定する」「Z プロジェクト」で「最大強度」にダイアログ ボックスよく最適ですセクション 5 で、セグメンテーションのための構造を強調するこれはすべてのアプリケーションのために適切かもしれないけれども。別のタイプの投影は、分析のため必要がある場合を保存し、このファイルは、セクション 6 および 7 の特徴抽出のように注意してください。
   3. チャンネルと画像分析のプロトコルでは、次の手順を簡素化する興味の焦点の plane(s) を含む新しいイメージを生成します。選択"画像 |重複する」、必要な「チャンネル」(c) と"スライス"(z) を設定し、(例えば、[実験グループ名] _ [標本名] _ [date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]) 実験選択内容を反映するファイル名前を変更します。
3. 4.2 の手順で決定された選択基準に基づいて標準化された投資収益率を手動で選択するのにフィジー ツールバーの「選択ツール」の 1 つを使用します。
4. 追加投資収益率 ROI マネージャーをクリックして"分析 |ツール |ROI マネージャー」および ROI マネージャー メニューの「追加」をクリックします。ROI マネージャーのメニューからクリックして投資収益率を保存」より |"を保存し、投資収益率を反映するようにファイルの名前 (例、[実験グループ名] _ [標本名] _ [実験日] _ [チャンネル] _ [z-plane(s)] _ [ROI 説明])。
   注: これは後の分析をフィジーで再開することができます。 または他のチャネルまたはセクション 5.3 のように画像に適用できます。

5. 前処理と h マキシマ Watershedding とセグメンテーション

1. 対象の構造をキャプチャするために使用するチャネルの前処理を実行します。
   1. イメージ ファイルは、複数のチャンネルで構成され場合をクリックして、チャンネルを分離」の画像 |カラー |チャンネルを分割"関心のチャネルを分離します。
   2. ノイズやクリックしてによる平滑化のためのガウスぼかしを抑えるメディアン フィルターなどのフィルターを適用する"プロセス |フィルター |フィルターの種類"(例えば、「メディアン フィルター」や「ブラー (ガウス)」)。
      1. 異なるフィルターをサンプリングし、各実験群からの画像のパラメーターをフィルター処理します。ステップ 6.2 セグメンテーションの性能を確認する各グループから代表的な例を続行します。フィルターおよび興味の構造の分割を容易にするための設定を選択します。
   3. フィルターの設定を記録します。実験グループにこれらのパラメーターを適用できます。
   4. 参考のため、適用されているフィルターを含む tiff ファイルとしてイメージのコピーを保存します。[実験グループ名] _ [標本名] _ [実験日] _ [チャンネル] _ など詳細な名前を使用して、[z-plane(s)] _ [フィルター パラメーター]。
2. 前処理された画像生成し、5.1 の手順で保存をインタラクティブ h マキシマ流域ツールで対象の構造体の分割を実行します。
   1. フィジーで活躍のプリプロセス済みのイメージをクリックして h マキシマ インタラクティブ流域ツールを開始"SCF |ラベル |インタラクティブな H_Watershed"。
      注: このプラグインは最初流域を計算し、ユーザーが極大と即座に更新された出力イメージを分割しきい値オプションの影響を探検します。
   2. コントロール パネルからシード ダイナミクス (h)、輝度しきい値 (T) とセグメンテーションを最適化する (%) の洪水ピークを調整します。
      注: は、常に手動で対象の構造体の領域分割の性能を検査するためのセクション 4.2 からプリプロセスの前に raw 画像を参照します。
   3. 領域分割結果に問題がなければ、「エクスポート領域マスク」し「エクスポート」を選択します。これは、流域の結果 (図 1セグメンテーション) のバイナリ イメージが生成されます。
   4. 分割パラメーターを記録します。これらのパラメーターは、定量的な比較実験グループ全体に適用する必要があります。名 [実験グループ名] _ [標本名] _ [実験日] [チャンネル] _ _ などの詳細なセグメンテーション パラメーターと参照に必要な場合、バイナリ結果マスクを保存 [z-plane(s)] _ [フィルター パラメーター] _ [H_Watershed メーター]。
3. 流域の結果から対象の構造を抽出します。
   1. ステップ 4.4 から ROI マネージャーで保存された ROI を開きます。5.2.4 アクティブのステップからバイナリ領域マスク、標準化された投資収益率に特徴抽出を制限するイメージに適用する ROI マネージャーから ROI を選択します。
   2. バイナリ流域マスク上でアクティブの ROI を選択"分析 |粒子"分析「マネージャーに追加」と特徴を抽出する] ダイアログ ボックスで選択します。
      注: これはセグメンテーション ROI マネージャーに中に線引きの各構造体の粒子の識別子を追加します。サイズまたは分析に含まれる構造体を絞り込むために必要な場合は真円に基づく機能を除外するのにはこのメニューでは、オプションがあります。
   3. クリックして、パーティクルを保存」より |"ROI マネージャー メニューから保存します。識別子が選択解除されて、すべての粒子はすべて zip ファイルで保存するを確認します。[実験グループ名] _ [標本名] _ [実験日] _ [チャンネル] _ など詳細な名前を使用して、[z-plane(s)] _ [フィルター パラメーター] _ [H_Watershed パラメーター] _ [構造]。

6. 数量、エリア、と強度の定量化、解析

1. 生成され、4.2 の手順で保存された raw 画像を開きます。対象の構造をキャプチャするために使用するチャネルをスクロールします。
   注: ピクセル値のステップ 5.1 変更フィルターの適用として (前処理) 前に raw 画像からの強度の測定を取ることが重要です。
2. ステップ 5.3 の特徴抽出から得られた粒子を開き、ROI マネージャーから「すべて表示」を選択します。
   注: この操作は、各粒子の「ROI マネージャー」イメージにアウトラインをオーバーレイ、対象 (図 1、特徴抽出) の構造の端を一致する必要があります。
3. クリックして必要な測定値を設定"分析 |測定」。
   注: 領域、強さ、および粒子の密度「領域」と「統合された密度」を選択することによって測定できます。統合された密度を選択すると、フィジーは、2 つの値を生成する: 領域と平均グレー値と 'Raw 集積密度' ピクセル値の合計として測定の積として計算 '密度統合された'。粒子の蛍光タンパク質の密度は、面積で割ったピクセル値の合計として計算されます。ステップ 5.3 で生成される粒子の数は、投資収益率は、手順 4.4 で定義されている組織内の粒子の数量を示します。
4. ROI マネージャーのメニューから「メジャー」を選択します。結果は、フィジーでは、イメージング ソフトウェアから派生したファイルから測定は限り校正単位で表されます。結果ウィンドウから結果をコピーして、コンパイルおよびさらに計算を表計算ソフトに貼り付けます。

7. レシオ メトリックの定量化とそのデータ解析

1. 6.1 と 6.2 興味の最初の raw チャネルの粒子識別子を開くにはの手順に従います。
2. クリックして必要な測定値を設定"分析 |測定」。
   注:「平均グレー値」を選択することで粒子あたり平均強度を測定できます。 されます
3. ROI マネージャーからは、「測定」を選択します。結果ウィンドウからデータをコピーし、表計算ソフトに貼り付けます。
4. この例 (図 4 a) では GFP の関心の 2 番目の raw チャネルに"C"スクロール バーを移動し、7.2 の手順を繰り返します。7.3。
   注: 手順 5.3 粒子はチャネルと生成されたスライスになります。粒子が関心の正しいチャネルに適用されるように注意してください。
5. 表計算ソフトに各粒子の 2 番目の強さに 1 つのチャネルからの強度の比を計算します。
6. 散布を使用して視覚化して個々 の変更を基になる生物学的プロセスの反射を示す fluorophores からレシオ メトリック データを定量化します。
   1. グラフ作成ソフトウェアで散布を生成します。
      注: 各データ ポイントは、興味関心の最初の蛍光の強度は「x の値」、2 番目の蛍光の強度は各粒子の測定「y の値」の構造を表します。
   2. ゲートの象限を定義する各 fluorophore のしきい値を設定します。
7. 線を使用して、興味の構造間で蛍光強度を視覚化します。
   1. 手順 5.3 で生成された投資収益率を選択し、ツールバーの直線ツールを使用して、投資収益率を通る直線を描画します。行投資収益率 ROI マネージャーを追加します。
   2. 行投資収益率がアクティブになっていると、対象各チャネルを選択"分析 |"プロファイルをプロットします。
      メモ: ヒストグラム プロット、線に沿って強度の値の表印刷プロファイル関数が生成されます。各チャンネルとラインに沿って両方のチャネルを示すプロットを生成するための表計算ソフトに貼り付けるから測定結果をコピーします。

結果

数、地域、およびショウジョウバエ視葉の蛍光タグ変異 Htt 骨材の強度の定量化

ハンチントン病、タグ付きの RFP の突然変異のショウジョウバエモデルの中枢神経系におけるミスフォールド蛋白質の集合を調査する非病理学 (UA RFP hHttQ15) または病理学的拡張 (と HttUAS-RFP-hHttQ138) 膜 GFP (UA mCD8::GFP

ディスカッション

ここで説明されているプロトコルは、しっかりと再現性をもって量的蛍光ベースのイメージングで可視化した細胞生物学的プロセスに使用できます。生物学的文脈と技術的な制限は、実験的なデザインを導くため慎重に検討する必要があります。蛍光マーカー、興味の細胞レベル下の構造の形態と強度によって背景の上区別する必要があります免疫組織化学的、染料ベース、または遺伝的に?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	PF184250	Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish	Corning	351008	Dissection dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dissection tool
Sodium Chloride	Sigma	S3014	PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	PBS solution
Triton X-100	Sigma	T9284	Washing and antibody incubaton solution.
37% Formaldehyde	VWR	10790-710	Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue)	VWR	89000-022	Fixation, washing, and antibody incubaton.
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm)	VWR	48312-004	Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm)	VWR	48393-172	Slides for confocal imaging
Rubber Cement	Slime	1051-A	Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m)	3M Company	810	Mounting
Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope	AmScope	SM-1BNZ	Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji	NIH	v1.51u	With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope	Olympus
Recombinant Construct	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749