Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro semplice e adattabile per estrarre dati quantitativi da studi biologici basati su formazione immagine di fluorescenza delle cellule di aggregazione proteica e flusso autofagico nel sistema nervoso centrale di Drosophila modelli di neurodegenerazione.

Abstract

Con la crescente diffusione di malattie neurodegenerative, è sempre più importante capire la patofisiologia di fondo che conduce alla perdita e disfunzione neuronale. Tecnologie e strumenti di imaging basata sulla fluorescenza abilitare analisi senza precedenti dei processi neurobiologici subcellulari, eppure c'è ancora una necessità di approcci imparziale, riproducibile e accessibile per l'estrazione di dati quantificabili da studi di imaging . Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro semplice e adattabile per estrarre dati quantitativi dagli studi di formazione immagine di fluorescenza-basata della drosofila in modelli di neurodegenerazione. In particolare, descriviamo un metodo facile da seguire, semi-automatizzato utilizzando Fiji/ImageJ per analizzare i due processi cellulari: in primo luogo, quantifichiamo aggregazione proteica e profilo nel lobo ottico Drosophila utilizzando fluorescenti-etichetta mutante proteine di huntingtin; e in secondo luogo, valutiamo il flusso di autofagia-lisosoma nel sistema visivo della drosofila con quantificazione basata su raziometrici di un reporter fluorescente tandem dell'autofagia. D'importanza, il protocollo descritto qui include un passaggio di segmentazione semi-automatizzata per garantire che tutte le strutture fluorescenti sono analizzate per minimizzare il bias di selezione e per aumentare la risoluzione di sottili confronti. Questo approccio può essere esteso per l'analisi di altre strutture biologiche cellulari e processi implicati nei processi neurodegenerativi, quali proteinico puncta (granuli di stress e complessi sinaptici), anche come membrana-limitano scomparti (mitocondri e vescicole della membrana del traffico). Questo metodo fornisce un standardizzato, ma adattabile riferimento punto per analisi dell'immagine e la quantificazione e potrebbe facilitare affidabilità e riproducibilità attraverso il campo e infine migliorare comprensione meccanicistica della neurodegenerazione.

Introduzione

Malattie neurodegenerative colpiscono milioni di persone ogni anno e l'incidenza sta aumentando con l'invecchiamento della popolazione¹. Mentre ogni malattia neurodegenerative ha un'eziologia unica, aggregazione delle proteine misfolded e ripartizione della rete proteostasis sono patologici comuni caratteristiche di molte di queste malattie. Delucidamento come rottura di questi processi fondamentali e interdipendenti va storto per contribuire alla morte delle cellule e la disfunzione neuronale è fondamentale per la comprensione delle malattie neurodegenerative così come guidare gli interventi terapeutici. Acquisizione di immagini basata sulla fluorescenza permette per indagine su questi processi complessi e dinamici nei neuroni e ha notevolmente contribuito alla nostra comprensione della biologia delle cellule neuronali. Analisi di proteine fluorescente è impegnativo, specialmente quando gli esperimenti sono effettuati in vivo, a causa di tessuti altamente compatti, tipi cellulari diversi ed eterogeneità morfologica. Manuale assistita quantificazione è conveniente e semplice, ma è spesso richiede tempo e soggetto a pregiudizi umani. Di conseguenza, c'è una necessità di approcci imparziale, riproducibile e accessibile per l'estrazione di dati quantificabili da studi di imaging.

Abbiamo delineato un flusso di lavoro semplice e adattabile con Fiji/ImageJ, un'immagine potente e liberamente accessibile, elaborazione software^2,3, per estrarre dati quantitativi da studi di formazione immagine di fluorescenza in modelli sperimentali di neurodegenerazione utilizzando Drosophila. Seguendo questo protocollo per quantificare l'aggregazione proteica e flusso autofagico — due cellulari caratteristiche biologiche che sono altamente pertinenti alla patologia di malattia neurodegenerative — abbiamo dimostrato la sensibilità e la riproducibilità di questo approccio. Analisi delle proteine fluorescente contrassegnati huntingtina (Htt) nel lobo ottico di Drosophila ha rivelato il numero, la dimensione e l'intensità degli aggregati della proteina. Abbiamo visualizzato un reporter fluorescente tandem di autophagic flusso all'interno del sistema visivo di Drosophila , che mostra segnali di emissione diversi a seconda l' ambiente compartimentali⁴. Analisi basata su raziometrici del reporter tandem ammessi per una visione quantitativa e globale di cambiamento continuo di autofagia-lisosoma da formazione dell'autofagosoma, maturazione e trasporto alla degradazione nel lisosoma e inoltre evidenziato vulnerabili compartimenti in circostanze neurodegenerative interrotta. Importante, in entrambe le analisi abbiamo implementato passaggi di soglia e segmentazione semi-automatizzati nel nostro protocollo per ridurre al minimo la polarizzazione unconscious, aumentare la potenza di campionamento e fornire uno standard per facilitare i confronti tra studi simili. Il semplice flusso di lavoro è inteso a rendere potente plugin di Fiji/ImageJ (sviluppato da scienziati informatici basati su algoritmi matematici) più accessibile ai neurobiologi e la comunità di Scienze della vita in generale.

Protocollo

1. Considerazioni e preparati per la progettazione dell'esperimento di analisi di immagine

1. Predeterminare adatto anatomico, cellulare, o subcellulari marcatori per servire come punti di riferimento per la standardizzazione di una regione di interesse (ROI) attraverso diversi campioni, ad esempio 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), marcatori di membrana, localizzati fluorescenti proteine, ecc.
2. Selezionare un marcatore fluorescente che può delimitare discreto puncta oltre i livelli di sfondo per la struttura di interesse.
   Nota: Questo protocollo è ottimizzato per le strutture proteiche (ad es., aggregati di proteine misfolded) e membrana-limitano organelli (ad es., l'autofagia reporter). Per visualizzare l'aggregazione proteica, un frammento di RFP-tag N-terminale della proteina Htt umana con un tratto poliQ patogeni di 138 ripetizioni (RFP-hHttQ138) è stato usato⁵. La proteina Htt mutata forma aggregati citoplasmatici quando espresso in un neurone specifico driver ad esempio elav-GAL4^5,6. Per visualizzare il flusso dell'autofagosoma-lisosoma, Actina-GAL4 è stato utilizzato per guidare ubiquistmente espressione del reporter mCherry-GFP-Atg8a tandem. GFP-positive e di mCherry - puncta indicare autofagosomi, e il flusso viene monitorato come fluorescenza GFP è spenta in ambiente acido del lisosoma, dove mCherry acido-insensibile rimane fino a quando la proteina è degradata⁷. Per analisi raziometrici, un singolo canale che è un indicatore coerenza della struttura può essere utilizzato per segmentazione, o eventualmente che una proiezione di due o più canali possa essere utilizzata per delineare strutture, anche se non esplicitamente descritti nel presente protocollo. In questo esempio, mCherry è utilizzato per la segmentazione delle particelle Atg8-positivi, come è acido-insensibile e rimarrà nel vano in tutto di flusso attraverso la via.
3. Scaricare e installare la piattaforma di open source immagine analisi ImageJ o Fiji — la distribuzione preferita di ImageJ con in bundle plugin^2,3.
4. Installare il plugin per spartiacque interattiva h-maxima.
   Nota: Questo protocollo utilizza Figi; plugin aggiuntivi possono essere richiesti per ImageJ. Il plug-in sviluppato da Benoit Lombardot per SCF-MPI-CBG è disponibile online (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
5. Passare a "Guida | Update", selezionare"Gestisci siti di aggiornamento"dal"ImageJ Updater", scegliere il sito di aggiornamento di SCF-MPI-CBG dall'elenco e quindi chiudere e riavviare Fiji.

2. brain dissezione e colorazione di immunofluorescenza

1. Fare in silicone rivestito elastomero dissezione piatti.
   1. Versare in silicone componenti in elastomero in un becher, come indicato dal produttore e mescolare bene fino a quando accuratamente miscelati.
   2. Utilizzare una pipetta per riempire 5 cm completo di piastre di coltura del tessuto un terzo alla metà (circa 10 mL di miscela di elastomero). Consentire tutte le bolle salgono alla superficie e rimuovere delicatamente con carta velina. Coprire i piatti e metterli su una superficie piana per curare per 48-72 h a temperatura ambiente (TA).
2. Sezionare il cervello di Drosophila ed il sistema visivo se necessario.
   1. Eseguire la dissezione del cervello della drosofila come descritto in precedenza^8,9. Eseguire la dissezione in piatti di dissezione elastomero-allineato, utilizzando un fondo di elastomero per stabilizzare il cervello per evitare dannoso tessuto o forcipe.
   2. Per mantenere intatta la lamina durante la dissezione, far scorrere due pinze sotto la retina e strappare delicatamente attraverso il centro dell'occhio per rimuovere la retina. Tirare via qualsiasi tessuto retinico collegato alla lamina con forcipe tenuto parallelo alla superficie della lamina.
      Nota: Pigmento residuo laverà nei passaggi seguenti e solitamente non interferisce con l'anticorpo che macchia e imaging.
   3. Diluire la formaldeide al 37% in tampone fosfato salino (PBS) per rendere una concentrazione finale del 3,7% fresco prima dell'uso in un tubo del microcentrifuge 500 µ l. Trasferire il cervello sezionato a tubo del microcentrifuge con correzione soluzione e incubare per 15 min a RT con dolce dondolio.
      Nota: Formaldeide ha una naturale tendenza ad essere ossidato, producendo acido formico. Di conseguenza, è suggerito per aliquota del 37% formaldeide per deposito e diluire a 3,7% appena prima di ogni utilizzo. Sovra- fissazione di o sotto-fissazione influenzerà l'integrità del tessuto e fluorescenza¹⁰.
   4. Lavare 3 volte con PBTx (PBS con 0,4% Triton X-100) per 15 minuti ciascuno.
3. Eseguire esame immuno-istochimico e montare gli esemplari.
   1. Se è necessaria la macchiatura dell'anticorpo, rimuovere PBTx, aggiungere anticorpo primario diluito in PBTx con 5% di siero di capra normale e incubare su un mixer aliquota durante la notte a 4 ° C.
   2. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare 3 volte con PBTx per 15 minuti ciascuno. Aggiungere anticorpo secondario diluito in PBTx con 5% di siero di capra normale e incubare per 1h a RT o durante la notte a 4 ° C. Lavare 3 volte con PBTx per 15 minuti ciascuno.
   3. Se è necessaria la colorazione DAPI, rimuovere PBTx, aggiungere la soluzione DAPI (soluzione: 5 mg/mL, diluire a una concentrazione di lavoro di 15 µ g/mL in PBTx) e incubare per 10 min a RT. Wash 3 volte con PBTx per 15 minuti ciascuno.
   4. Per cancellare il tessuto, posizionare una goccia di mezzo di montaggio al centro di una diapositiva di microscopia con un distanziatore di uno strato di nastro adesivo trasparente su entrambi i lati. Trasferire il cervello sulla goccia di mezzo di montaggio e attendere per 1 – 2 min il cervello diventa trasparente. Rimuovere con attenzione il mezzo di montaggio con una pipetta.
   5. Per montare, applicare una goccia di mezzo di montaggio fresco sul cervello sulla diapositiva. Attentamente e sovrapporre un vetro di copertura evitando bolle. Sigillare i bordi con mastice e asciugare all'aria a temperatura ambiente per 20 minuti procedere all'acquisizione di immagini per ottenere i migliori risultati.

3. acquisizione immagini

1. Ottimizzare i parametri di acquisizione del microscopio, tra cui risoluzione spaziale, obiettivo, zoom, velocità di scansione e dimensione, per massimizzare la risoluzione delle strutture di interesse per facilitare la segmentazione semi-automatizzata durante l'analisi di immagine un passo.
   Nota: Potrebbe essere utile catturare un'immagine di esempio e test di segmentazione semi-automatizzata (nel passaggio 5 del presente protocollo) prima dell'imaging di tutti i campioni sperimentali. In questo modo l'utente può regolare le impostazioni di imaging affinché strumenti analitici possono facilmente discernere la struttura biologica di interesse.
2. Regolare i controlli di rivelatore di immagine per catturare il più alto rapporto segnale-rumore e la massima gamma dinamica dell'esemplare.
   1. Utilizzare una LUT (look up table) che indica la saturazione pixel (esposizione troppo alta) o undersaturation (offset troppo bassa) durante la regolazione delle impostazioni (Figura 3B, rosso indica la saturazione di pixel da una LUT Hi/Low).
   2. Verificare le impostazioni di guadagno e offset siano appropriate per tutti i gruppi sperimentali, come manipolazioni sperimentali probabile alterano la struttura di interesse.
      Nota: È fondamentale che le stesse impostazioni vengono utilizzate per tutti i gruppi per fare confronti quantitativi.
3. Immagine attraverso il tessuto per acquisire tutti i dati.
   Nota: Si consiglia di acquisire tutti i dati disponibili durante una sessione di imaging e di definire una zona più precisa durante la selezione del ROI nel passaggio 4 se necessario.
4. Salvare l'immagine come tipo di file supportato da software di imaging al fine di preservare i metadati quali parametri di acquisizione e calibrazione spaziale. Salvare l'immagine con un nome di file tra cui anticorpi data, background genetico e reporter fluorescenti, sperimentali, o coloranti corrispondenti ai canali scansionati come [nome gruppo sperimentale] _ [nome modello] _ [data di esperimento] _Ch1. [Fluorophore-destinazione /Dye]_Ch2.[fluorophore-target/Dye], ecc.

4. Fiji/ImageJ immagine importazione e selezione ROI

1. Aprire un'immagine in Fiji. Utilizzare la finestra di dialogo "Opzioni di importazione di Bio-Formats", scegliere "Visualizza stack con: Hyperstack" e impostare "modalità colore: scala di grigi".
   Nota: Si consiglia di aprire il tipo di file del microscopio, come metadati, ad esempio calibrazione spaziale può essere letto da Fiji.
2. Identificare un'area da un singolo piano z o una proiezione basata sui canali del marcatore che possono essere utilizzati come un ROI standardizzato attraverso esemplari (Figura 1, selezione di ROI).
   1. Utilizzare la barra di scorrimento "C" per visualizzare i canali utilizzati per catturare il marker(s) indicato al punto 1.1.
   2. Utilizzare la barra di scorrimento "Z" per spostarsi tra i piani focali. Scegliere una sola fetta o creare una proiezione di più sezioni facendo clic su "immagine | Stack | Progetto di Z"e imposta"Start fetta"e" Stop "per comprendere il ROI.
      Nota: Impostando il tipo di "" di proiezione "a"Max intensità"il progetto" Z"nella finestra di dialogo è spesso più adatto per enfatizzare strutture per segmentazione nella sezione 5, anche se questo potrebbe non essere appropriato per tutte le applicazioni. Se un altro tipo di proiezione è necessario per l'analisi, fare attenzione a salvare e documentare questo file come tale per l'estrazione di caratteristica in sezione 6 e/o 7.
   3. Generare una nuova immagine che contiene i canali e focale plane(s) di interesse per semplificare i passaggi seguenti nel protocollo di analisi di immagine. Selezionare "immagine | Duplicati", impostare il desiderato"canali"(c) e"Fette"(z) e cambiare il nome di file per riflettere la selezione (ad es., [nome gruppo sperimentale] _ [nome modello] _ [esperimento date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).
3. Utilizzare uno degli strumenti di"selezione" sulla barra di Fiji per selezionare manualmente un ROI standardizzato sulla base dei criteri di selezione determinati al punto 4.2.
4. Aggiungere il ROI al manager di ROI facendo clic su "Analyze | Strumenti | ROI Manager "e fare clic su"Aggiungi"dal menu Manager di ROI. Salvare il ROI dal menu ROI Manager facendo clic su "più | Salva"e quindi denominare il file per riflettere il ROI (ad es., [nome gruppo sperimentale] _ [nome modello] _ [data di esperimento] _ [canale] _ [z-plane(s)] _ [Descrizione ROI]).
   Nota: Questo può essere riaperto in Fiji per successive analisi o può essere applicato ad altri canali o immagini come in sezione 5.3.

5. pre-elaborazione e segmentazione con h-maxima Watershedding

1. Eseguire la pre-elaborazione sul canale utilizzato per acquisire le strutture di interesse.
   1. Se il file di immagine è costituito da più canali, i canali separati facendo clic su "immagine | Colore | Dividere i canali"per isolare il canale di interesse.
   2. Applicare un filtro come un filtro mediano per ridurre il rumore o sfocatura gaussiana per lisciatura facendo clic su "processo | Filtri | Tipo di filtro"(ad es.,"Filtro mediano"o"Gaussian Blur").
      1. Diversi filtri di esempio e filtrare i parametri sulle immagini da ogni gruppo sperimentale. Procedere attraverso il passo 6.2 con un esempio rappresentativo di ogni gruppo per controllare le prestazioni di segmentazione. Selezionare il filtro e le impostazioni che facilitano la segmentazione delle strutture di interesse.
   3. Registrare il filtro e le impostazioni. Applicare questi parametri attraverso gruppi sperimentali.
   4. Salvare una copia dell'immagine come file tiff compreso il filtro applicato per riferimento. Utilizzare un nome dettagliato come [nome gruppo sperimentale] _ [nome modello] _ [data di esperimento] _ [canale] _ [z-plane(s)] _ [filtro con parametri].
2. Eseguire segmentazione delle strutture di interesse con lo strumento di spartiacque interattiva h-maxima sull'immagine pre-elaborato generato e salvato nel passaggio 5.1.
   1. Con l'immagine pre-elaborato attivo in Fiji, avviare lo strumento interattivo spartiacque h-maxima cliccando "SCF | Etichettatura | H_Watershed interattiva".
      Nota: Questo plugin calcola prima lo spartiacque e quindi consente all'utente di esplorare gli effetti massimi locali e opzioni di soglia sulla segmentazione attraverso un'immagine di uscita immediatamente aggiornato.
   2. Dal pannello di controllo, regolare seme dinamica (h), soglia di intensità (T) e picco inondazioni (%) per ottimizzare la segmentazione.
      Nota: Consultare sempre l'immagine raw prima di pre-elaborazione da sezione 4.2 per controllare manualmente la prestazioni della segmentazione delle strutture di interesse.
   3. Quando siete soddisfatti con i risultati di segmentazione, selezionare "Esporta la maschera di regioni" e scegliere "Esporta". Questo genererà un'immagine binaria dei risultati spartiacque (Figura 1, segmentazione).
   4. Registrare i parametri di segmentazione; questi parametri devono essere applicati attraverso gruppi sperimentali per confronti quantitativi. Salvare la maschera binaria risultati se desiderato per riferimento con parametri di segmentazione dettagliati nel nome come [nome gruppo sperimentale] _ [nome modello] _ [data di esperimento] _ [canali] _ [z-plane(s)] _ [filtro con parametri] _ [H_Watershed parametri].
3. Estrarre le strutture di interesse dai risultati di spartiacque.
   1. Aprire il ROI salvato da passo 4.4, in gestione ROI. Con la maschera di regioni binario dal punto 5.2.4 attivo, selezionare il ROI dal manager ROI da applicare all'immagine per limitare la funzione di estrazione per il ROI standardizzato.
   2. Con il ROI attivo sulla maschera binaria spartiacque, scegliere "Analyze | Analizzare le particelle"con"Aggiungi a Manager"selezionato nella finestra di dialogo per estrarre caratteristiche.
      Nota: Questo aggiungerà un identificatore di particelle per ogni struttura delineato durante la segmentazione per il gestore di ROI. Opzioni sono disponibili in questo menu per escludere caratteristiche in base alle dimensioni o circolarità se necessario per perfezionare strutture inclusi nell'analisi.
   3. Salvare le particelle facendo clic su "più | Save"dal menu manager di ROI. Assicurarsi che gli identificatori vengono deselezionati e tutte le particelle verranno salvate in un file zip. Utilizzare un nome dettagliato come [nome gruppo sperimentale] _ [nome modello] _ [data di esperimento] _ [canali] _ [z-plane(s)] _ [filtro con parametri] [H_Watershed parametri] _ [strutture].

6. quantità, Area e intensità quantificazione e analisi

1. Aprire l'immagine raw generati e salvati al punto 4.2. Scorrere fino al canale utilizzato per l'acquisizione di strutture di interesse.
   Nota: È fondamentale per prendere le misure di intensità dall'immagine raw (prima di pre-elaborazione) come l'applicazione di filtri in cambio di passo 5.1 i valori dei pixel.
2. Aprire le particelle ottenute dall'estrazione di funzionalità nel passaggio 5.3 e selezionare "Mostra tutto" dal gestore del ROI.
   Nota: Questa azione si sovrapporrà un contorno di ogni particella su "ROI Manager" sull'immagine e deve corrispondere i bordi delle strutture di interesse (Figura 1, Feature extraction).
3. Impostare le misure desiderate facendo clic su "Analyze | Impostare misure".
   Nota: L'area, intensità e densità delle particelle può essere misurate scegliendo "zona" e "densità integrata". Quando è selezionata la densità integrata, Fiji produrrà due valori: 'Integrated densità' calcolato come il prodotto della zona e valore di grigio medio e 'Raw integrato densità' misurato come la somma dei valori dei pixel. Densità della proteina fluorescente nelle particelle è calcolato come la somma dei valori dei pixel diviso per l'area. Il numero di particelle generate nel passaggio 5.3 indica la quantità di particelle all'interno del tessuto che Roi definito al punto 4.4.
4. Scegliere dal menu Manager ROI "Misura". I risultati sono espressi in unità calibrata, purché le misurazioni sono effettuate da file derivati in Fiji dal software di imaging. Copiare i risultati dalla finestra risultati e incollare nel software di foglio di calcolo per la compilazione e ulteriori calcoli.

7. raziometrici quantificazione e analisi dei dati

1. Seguire i passaggi 6.1 e 6.2 per aprire gli identificatori delle particelle sul primo canale crudo di interesse.
2. Impostare le misure desiderate facendo clic su "Analyze | Impostare misure".
   Nota: L'intensità media per particella può essere misurato scegliendo "Significa valore di grigio".
3. Da ROI Manager selezionare "Misura". Copiare i dati dalla finestra dei risultati e incollare nel software del foglio elettronico.
4. Spostare la barra di scorrimento "C" sul secondo canale crudo di interesse, GFP in questo esempio (Figura 4A) e ripetere i passaggi da 7.2. e 7.3.
   Nota: Le particelle salvate al passaggio 5.3 imposterà il canale e la fetta da cui è stato generato. Fare attenzione affinché le particelle vengono applicate al corretto canale di interesse.
5. Calcolare il rapporto tra l'intensità da un canale all'intensità del secondo per ogni particella nel software foglio di calcolo.
6. Utilizzare un grafico a dispersione per visualizzare e quantificare raziometrici dati da fluorofori che presentano singole modifiche riflettente dei processi biologici sottostanti.
   1. Generare un grafico a dispersione nel software di grafico.
      Nota: Ogni punto dati rappresenta una struttura di interesse dove l'intensità del fluoroforo primo di interesse è il valore"x" e l'intensità del fluoroforo secondo è il "valore di y" misurato da ogni particella.
   2. Impostare le soglie per ogni fluoroforo definire i quadranti di gating.
7. Utilizzare il profilo di linea per visualizzare fluoroforo intensità attraverso una struttura di interesse.
   1. Selezionare un ROI generato nel passaggio 5.3 e utilizzare lo strumento linea retta sulla barra degli strumenti per disegnare una linea retta attraverso il ROI. Aggiungere la riga ROI al Manager di ROI.
   2. Per ogni canale di interesse, con la linea ROI attivo, selezionare "Analyze | Tracciare il profilo".
      Nota: La funzione del profilo di trama genererà un grafico istogramma e una tabella dei valori di intensità lungo la linea. Copiare i risultati sono misurati da ciascun canale e incolla nel software di foglio di calcolo per generare un grafico che mostra entrambi i canali lungo la linea.

Risultati

Quantificazione del numero, zona e intensità degli aggregati Htt mutanti fluorescente contrassegnati nel lobo ottico di Drosophila

Per indagare l'aggregazione di proteine misfolded nel sistema nervoso centrale di un modello di Drosophila della malattia di Huntington, RFP-etichetta mutante umano Htt con un non-patologico (UAS-RFP-hHttQ15) o espansione patologica ( UAS-RFP-hHttQ138) e membrana GFP...

Discussione

Il protocollo descritto qui può essere utilizzato per robustamente e riproducibile quantitate processi biologici delle cellule visualizzati da formazione immagine di fluorescenza-basata. Contesto biologico e limiti tecnici devono essere attentamente considerati per guidare il disegno sperimentale. Marcatori fluorescenti di strutture subcellulari di interesse, se immunohistochemical, dye-based o geneticamente espresse, devono essere distinguibili sopra priorità bassa di morfologia e intensità. Il sistema GAL4/UAS

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	PF184250	Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish	Corning	351008	Dissection dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dissection tool
Sodium Chloride	Sigma	S3014	PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	PBS solution
Triton X-100	Sigma	T9284	Washing and antibody incubaton solution.
37% Formaldehyde	VWR	10790-710	Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue)	VWR	89000-022	Fixation, washing, and antibody incubaton.
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm)	VWR	48312-004	Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm)	VWR	48393-172	Slides for confocal imaging
Rubber Cement	Slime	1051-A	Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m)	3M Company	810	Mounting
Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope	AmScope	SM-1BNZ	Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji	NIH	v1.51u	With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope	Olympus
Recombinant Construct	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749