ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

요약

단백질 집계 및 autophagic 플럭스의 초파리 모델의 중앙 신 경계에서의 형광 이미징-기반 세포 생물학 연구에서 양적 데이터를 추출 하는 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 개발 했습니다. neurodegeneration입니다.

초록

신경 퇴행 성 질환의 증가 보급, 신경 장애 및 손실 기본 이상 이해 하는 것 점점 더 중요 하다. 형광-기반 이미징 도구 및 기술 사용 subcellular neurobiological 프로세스의 전례 없는 분석 아직 여전히 이미징 연구에서 정량 데이터를 추출, 재현성, 공평 하 고 액세스할 수 있는 방법에 대 한 필요 . 우리 neurodegeneration의 초파리 모델을 사용 하 여 형광 기반 이미징 연구에서 양적 데이터를 추출 하는 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 개발 했습니다. 특히, 피지/ImageJ를 사용 하 여 두 개의 세포 프로세스를 분석 하는 따라 하기 쉬운, 반자동 접근 설명: 첫째, 우리가 계량 단백질 집계 내용과 초파리 광 엽 돌연변이 형광 태그를 사용 하 여 프로 파일 huntingtin 단백질; 및 두 번째, 우리 autophagy의 탠덤 형광 기자의 부 량 비율 기반으로 초파리 비주얼 시스템에서 autophagy 리소좀 플럭스 평가. 중요 한 것은, 여기에 설명 된 프로토콜 선택 편견을 최소화 하 고 미묘한 비교의 해상도 높이기 위해 모든 형광 구조 분석 되도록 반자동된 세분화 단계를 포함 합니다. 이 방법은 다른 세포 생물학 구조의 분석을 위해 확장 될 수 있습니다 및 프로세스 연루 neurodegeneration, 배치할 puncta (스트레스과 립 및 시 냅 시스 복합물) 같은 막 도약 뿐만으로 구획 (미토 콘 드리 아와 막 밀매 vesicles)입니다. 아직 적응 참조 이미지 분석 및 정량화를 위한 분야에 걸쳐 안정성과 재현성을 촉진 및 궁극적으로 neurodegeneration의 기계적 이해를 향상 시킬 수이 방법을 표준화 하 고, 제공 한다.

서문

신경 퇴행 성 질환에 영향을 미칠 수백만의 사람들이 매년 고 발생률은 노후화 인구¹증가 하 고 있다. 각 신경 질환은 독특한 병 인, misfolded 단백질의 집계 및 proteostasis 네트워크의이 질병의 많은 것의 일반적인 병리학 특징입니다. 어떻게 이러한 근본적이 고 상호 프로세스의 중단 awry elucidating 신경 역 기능 및 세포 죽음에 기여 하이 중요 이해 신경 퇴행 성 질환으로 치료 개입을 유도 합니다. 형광 기반 이미징 뉴런에서 이러한 복잡 하 고 동적 프로세스의 조사 가능 하며 신경 세포 생물학의 우리의 이해에 크게 기여 했다. 붙일 태그가 단백질의 분석 실험 실행 된다 vivo에서, 매우 소형 조직, 다양 한 세포 유형 및 형태학이 때에 특히 도전, 이다. 수동으로 보조 정량화 저렴 하 고 간단, 하지만 종종 소모 및 인간의 편견. 따라서, 이미징 연구에서 정량 데이터를 추출, 재현성, 공평 하 고 액세스할 수 있는 방법에 대 한 필요가 있다.

우리의 실험 모델에서 형광 이미징 연구에서 양적 데이터를 추출 피지/ImageJ, 강력 하 고 자유롭게 액세스할 수 있는 이미지 처리 소프트웨어^2,3를 사용 하 여 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 설명 했습니다. neurodegeneration 초파리를 사용 하 여입니다. 단백질 집계 및 autophagic 유량을 계량 하이 프로토콜에 따라-2 셀 neurodegenerative 질병 병 리 관련성이 높은 생물학 기능-우리 감도 재현성이이 방법의 설명. Drosophila 광 엽에 붙일 태그가 돌연변이 huntingtin (Htt) 단백질의 분석 수, 크기, 및 단백질의 강도 공개 했다. 우리 시각 autophagic 플럭스⁴compartmental 환경 따라 다른 방출 신호 표시 초파리 비주얼 시스템 내에서 협동 형광 기자. 탠덤 기자 저하는 리소좀에 autophagosome 형성, 성숙, 그리고 전송에서 autophagy 리소좀 플럭스의 양적이 고 포괄적인 보기에 대 한 허용 하 고 또한 취약 한 강조의 비율 기반 분석 신경 퇴행 성 조건에서 중단 하는 구획. 중요 한 것은, 의식이 없는 편견을 최소화 하기 위해 우리의 프로토콜에 반자동된 임계 처리 및 세분화 단계를 구현 우리 모두 분석, 샘플링 파워를 증가 하 고 비슷한 연구 간의 비교를 촉진 하기 위하여 표준을 제공 키를 누릅니다. 간단한 워크플로 강력한 피지/ImageJ 플러그인 (수학 알고리즘에 따라 컴퓨터 과학자에 의해 개발)을 위한 neurobiologists과 생명 과학 지역 사회에 더 접근 가능.

프로토콜

1. 고려 사항 및 이미지 분석 실험 설계에 대 한 준비

1. 미리 적당 한 해부학, 세포, 또는 subcellular 마커 다른 샘플에서 관심 (ROI) 영역에 표준화에 대 한 랜드마크로 서 역할을 예를 들어 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 막 마커, 지역화 된 형광 단백질, 등
2. 관심의 구조에 대 한 배경 수준 넘어 개별 puncta 구분 수 형광 마커를 선택 합니다.
   참고:이 프로토콜은 최적화 배치할 구조 (예를 들어, misfolded 단백질 집계)와 막 바인딩된 세포 (예를들면, autophagy 기자). 단백질 집계를 시각화 하려면 138 반복 (RFP-hHttQ138)의 병원 성 polyQ로 인간의 Htt 단백질의 N-터미널 RFP 태그 조각이 사용된⁵이었다. 돌연변이 체 Htt 단백질 세포질 집계 elav GAL4^5,6등 신경 특정 드라이버에서 표현 하는 때 형성 한다. Autophagosome-리소좀 플럭스를 시각화 하려면 말라 GAL4 편 탠덤 mCherry GFP Atg8a 기자의 식 드라이브 사용 되었다. mCherry-GFP-긍정적인 puncta autophagosomes, 나타내고 GFP 형광 단백질이 저하⁷때까지 산을 구분 하지 않는 mCherry의 남아 있는 리소좀의 산 성 환경에서 침묵으로 유량 모니터링 합니다. 비율 분석을 위해 구조의 일관 된 표식 인 단일 채널 세분화, 사용 하거나 두 개 이상의 채널의 투영 구조, 윤곽을 그리 다를 사용할 수 있는 적절 한 경우 비록 명시적으로 설명 된이 프로토콜에 될 수 있습니다. 이 예제에서 mCherry는으로 산을 구분 하지 않는 경로 통해 유출 통해 구획에 남아 있을 것 이다 Atg8-긍정적인 입자의 세분화에 대 한 사용 됩니다.
3. 다운로드 하 고 오픈 소스 이미지 분석 플랫폼 ImageJ 또는 피지 설치-와 ImageJ의 기본 배포 번들 플러그인^2,3.
4. H-맥시 마 대화형 유역에 대 한 플러그인을 설치 합니다.
   참고:이 프로토콜 사용 하 여 피지; 추가 플러그인 ImageJ에 대 한 필요할 수 있습니다. Benoit Lombardot SCF-MPI-CBG에 의해 개발 된 플러그인은 사용할 수 온라인 (https://imagej.net/Interactive_Watershed)입니다.
5. 로 이동 "도움말 | 업데이트","관리 업데이트 사이트"선택" ImageJ 업데이트 "에서 목록에서 SCF-MPI-CBG 업데이트 사이트를 선택 하 고 다음 닫고 다시 시작 피지.

2. 뇌의 해 부와 면역 형광 염색

1. 실리콘 고무 줄 절 개 요리를 합니다.
   1. 실리콘 엘라 스토 머 부품에 붓고 비 커 및 철저 하 게 혼합 때까지 잘 저 어에 표시 된 대로.
   2. 5 cm을 채우기 위해 한 피 펫을 사용 하 여 조직 문화 요리 1-3 반에 전체 (고무 혼합물의 약 10 mL). 어떤 거품 표면에 승천 하 고 티슈로 제거를 허용 합니다. 요리를 커버 하 고 실내 온도 (RT)에서 48-72 h에 대 한 치료를 레벨 표면에 그들을 배치.
2. 초파리 뇌, 그리고 필요한 경우 비주얼 시스템을 해 부.
   1. 앞에서 설명한^8,9 초파리 뇌 해 부를 수행 합니다. 파괴적인 조직 또는 집게를 피하기 위해 두뇌를 안정 시키기 위해 고무 바닥을 사용 하 여 고무 줄 절 개 요리를 해 부를 수행 합니다.
   2. 해 부 동안에 lamina 그대로 유지, 망막 아래 두 개의 집게를 슬라이드 하 고 부드럽게 제거 망막을 눈의 중간을 통해 눈물. Lamina 표면에 평행 하 게 개최 하는 집게와는 lamina에 연결 된 어떤 망막 조직을 멀리 당겨.
      참고: 잔여 안료 다음 단계에서 씻어 것입니다 그리고 일반적으로 항 체 얼룩이 지 고 이미징 방해 하지 않습니다.
   3. 인산 염 버퍼 식 염 수 500 µ L microcentrifuge 튜브에 3.7%의 최종 농도 사용 하기 전에 신선한 게를 (PBS)에 37% 포름알데히드를 희석. 수정 솔루션 microcentrifuge 관에 해 부 두뇌를 전송 하 고 부드러운 락와 RT에 15 분 동안 품 어.
      참고: 포름알데히드 포 름 산을 생산 자연 산화 될 경향이 있다. 따라서, 그것은 스토리지에 대 한 약 수는 37% 포름알데히드를 제안 및 각 사용 전에 갓 3.7%에 희석입니다. -고정 또는 아래 고정 조직 및 형광¹⁰의 무결성에 영향을 것입니다.
   4. PBTx로 3 회 세척 (PBS 0.4% 트라이 톤 X-100) 15 분.
3. Immunohistochemistry 수행 하 고 표본 탑재.
   1. 항 체는 얼룩이 지는 필요한 경우, PBTx를 제거, PBTx에서 5% 정상 염소 혈 청 희석 주 항 체를 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 aliquot 믹서에 품 어
   2. 1 차적인 항 체를 제거 하 고 15 분 동안 PBTx와 3 번 세척. 추가 5% 정상 염소 혈 청 희석 PBTx에서 이차 항 체와 RT에 1 시간에 대 한 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤 PBTx 3 시간 15 분 동안 씻어.
   3. DAPI 얼룩은 필요한 경우, PBTx 제거, DAPI 솔루션 추가 (재고 솔루션: 5 mg/mL, 희석 작업 PBTx에 15 µ g/mL의 농도에), 및 실시간 씻어 3 시간 15 분 동안 PBTx에서 10 분 동안 품 어.
   4. 취소는 조직, 양쪽에 명확한 테이프의 1 개의 층의 스페이서와 현미경 슬라이드의 중심에 장착 매체의 한 방울을 배치 합니다. 전송 설치 매체의 드롭에 두뇌와 두뇌 투명 하 게 될 때까지 1-2 분 기다립니다. 조심 스럽게 제거를 피 펫을 장착 매체.
   5. 탑재, 슬라이드에 두뇌에 신선한 설치 매체의 방울을 적용 합니다. 조심 스럽게 거품을 피하고 커버 유리 오버레이. 고무 시멘트, 가장자리를 밀봉 하 고 20 분 최상의 결과 얻으려면 이미지 수집을 진행에 대 한 실시간에 건조.

3. 이미지 수집

1. 공간 해상도, 목표, 스캐닝 속도, 줌 현미경 수집 매개 변수를 최적화 하 고 단계 크기, 이미지 분석 중 반자동된 세분화를 촉진 하기 위하여 관심의 구조의 해상도 최대화 하기 위해.
   참고: 그것은 샘플 이미지를 캡처하고 모든 실험 샘플을 이미징 하기 전에 (이 프로토콜의 5 단계)에서 반자동된 세분화를 테스트에 유용할 수 있습니다. 이 방법으로 사용자 분석 도구 쉽게 관심의 생물학 구조를 분별 수 있도록 이미지 설정을 조정할 수 있습니다.
2. 높은 신호 대 잡음 비율 및 표본의 높은 동적 범위를 캡처 이미지 검출기 컨트롤을 조정 합니다.
   1. 사용 하 여 픽셀의 채도 (너무 높은 노출) 또는 undersaturation (너무 낮은 오프셋) 설정 (그림 3B, 빨간색 나타냅니다 안녕/낮은 LUT에 의해 픽셀 채도) 조정 하는 동안 나타내는 LUT (조회 테이블).
   2. 이득 및 오프셋 설정은 모든 실험적인 그룹에 대 한 적절 한 실험 조작 가능성이 관심의 구조 변경으로 확인 합니다.
      참고: 그것은 절대적 양적 비교에 같은 설정이 모든 그룹에 대해 사용 됩니다.
3. 모든 데이터를 캡처하려면 조직을 통해 이미지입니다.
   참고: 한 이미징 세션 동안 사용할 수 있는 데이터의 모든을 포착 하 고 필요한 경우 4 단계에서에서 ROI 선택 동안 더 정확한 영역을 정의 하 것이 좋습니다.
4. 인수 매개 변수 및 공간 교정 같은 메타 데이터를 보존 하기 위해 이미징 소프트웨어에서 지 원하는 파일 형식으로 이미지를 저장 합니다. 실험 날짜, 유전적 배경, 그리고 형광 성 취재 원, 항 체를 포함 한 파일 이름으로 이미지를 저장 또는 채널에 해당 하는 염료 같은 [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _Ch1. 스캔 [Fluorophore-표적 /Dye]_Ch2.[Fluorophore-target/Dye], 등

4. 피지/ImageJ 이미지 가져오기 및 ROI 선택

1. 피지에서 이미지를 엽니다. "바이오 형식 가져오기 옵션" 대화 상자를 사용 하 여, 선택 "으로 보기 스택: Hyperstack" 설정 "색상 모드: 회색 음영".
   참고: 공간 교정 피지에 의해 읽을 수 수와 같은 메타 데이터로 현미경 파일 형식을 열려면 추천 된다.
2. 하나의 z-비행기 또는 표본 (그림 1, ROI 선택)에 걸쳐 표준화 된 투자 수익으로 사용 될 수 있는 마커 채널에 따라 투영에서 영역을 식별 합니다.
   1. "C" 스크롤 막대를 사용 하 여 단계 1.1에서에서 지정 하는 marker(s)을 캡처하는 데 사용 하는 채널을 볼 수 있습니다.
   2. "Z" 스크롤 막대를 사용 하 여 초점 비행기를 통해 이동. 단일 슬라이스를 선택 하거나 클릭 하 여 여러 조각의 투영을 만듭니다 "이미지 | 스택 | Z 프로젝트"및 설정" 시작 "조각과"Stop 슬라이스"투자 수익을 포괄 하는.
      참고: "투영 유형 설정" "Z 프로젝트"에서 "최대 강도" 대화 상자는 자주 가장 적합 섹션 5에 세분화에 대 한 구조를 강조 하기 위해이 모든 응용 프로그램에 적합 하지 않을 수 있습니다 비록. 다른 유형의 투영 분석을 위해 필요한 경우, 저장 하 고 따라서 섹션 6 또는 7 기능 추출에 대 한이 파일을 문서 처리.
   3. 채널 및 이미지 분석 프로토콜에서 다음 단계를 단순화 하는 관심의 초점 plane(s)를 포함 하는 새로운 이미지를 생성 합니다. 선택 "이미지 | 중복 "을 원하는"채널"(c)와"분할 영역"(z), 설정 하 고 (예를 들어, [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]) 실험 선택에 맞게 파일 이름을 변경할.
3. 4.2 단계에서 결정 하는 선택 기준에 따라 표준화 된 ROI를 수동으로 선택 하 피지 도구 모음에서 "선택 도구" 중 하나를 사용 합니다.
4. 클릭 하 여 투자 수익 ROI 관리자에 추가 "분석 | 도구 | 투자 수익 관리자 "및 ROI 관리자 메뉴에서"추가 "를 클릭 합니다. 클릭 하 여 투자 수익 ROI 관리자 메뉴에서 저장 "더 | 저장"하 고 투자 수익을 반영 하기 위해 파일 이름을 (예를 들어, [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _ [채널] _ [z-plane(s)] _ [투자 수익 설명]).
   참고:이 나중 분석에 대 한 피지에 재개 될 수 있다 또는 다른 채널 또는 5.3 단원에서 이미지에 적용할 수 있습니다.

5. 전처리 및 h-맥시 마 Watershedding와 시장 세분화

1. 관심의 구조를 캡처하는 데 사용 하는 채널에 전처리를 수행 합니다.
   1. 이미지 파일 여러 채널의 경우, 클릭 하 여 채널을 분리 "이미지 | 컬러 | 채널 분할"관심의 채널을.
   2. 소음이 나 클릭 하 여 스무 딩 가우스 흐림 효과 줄이기 위해 중간 필터 같은 필터를 적용 "과정 | 필터 | 필터 유형"(예를 들어," 중간값 필터 "또는" 가우스 흐려 ").
      1. 다른 필터를 샘플 하 고 각 실험 그룹에서 이미지 매개 변수를 필터링 합니다. 단계 6.2 세분화 성능 확인 각 그룹에서 대표적인 예를 계속 수행 합니다. 필터 및 관심의 구조의 세분화를 촉진 하는 설정을 선택 합니다.
   3. 필터 및 설정을 기록 합니다. 실험 그룹에서 이러한 매개 변수를 적용 합니다.
   4. Tiff 파일 참조에 대 한 적용 된 필터를 포함 하 여 이미지의 복사본을 저장. [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _ [채널] _ 같은 상세한 이름을 사용 [z-plane(s)] _ [매개 변수 필터].
2. 전처리 된 이미지 생성 및 단계 5.1에서에서 저장에 대화형 h-최대 분수령 도구에 대 한 관심의 구조의 세분화를 수행 합니다.
   1. 피지에서 활성 전처리 이미지 클릭 하 여 h-맥시 마 대화형 분수령 도구 시작 "SCF | 라벨 | 인터랙티브 H_Watershed "입니다.
      참고:이 플러그인 분수령와 먼저 다음 사용자에 게 로컬 맥시 마와 즉시 업데이트 출력 이미지를 통해 세분화에 임계값 옵션의 효과 탐험.
   2. 컨트롤 패널에서 씨앗 역학 (h), 강도 임계값 (T), 및 세분화를 최적화 하기 위해 (%)을 초과 하는 피크를 조정 합니다.
      참고: 항상 섹션 4.2 수동으로 관심의 구조의 세분화의 성능 검사에에서 전처리 하기 전에 raw 이미지를 참조.
   3. 세분화 결과 만족 하는 경우 "내보내기 영역 마스크"를 선택 하 고 "내보내기"를 선택 하십시오. 이 분수령 결과 (그림 1, 분할)의 이진 이미지를 생성 합니다.
   4. 기록 세그먼트 매개 변수; 이 매개 변수는 양적 비교에 대 한 실험적인 그룹에 적용할 필요가 있다. [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _ [채널] _ 같은 이름에 대 한 자세한 세그먼트 매개 변수 참조에 대 한 원하는 경우 이진 결과 마스크를 저장 [z-plane(s)] _ [매개 변수가 있는 필터] _ [H_Watershed 매개 변수].
3. 분수령 결과에서 관심의 구조를 추출 합니다.
   1. 투자 수익 관리자에 단계 4.4에서 저장 된 ROI를 엽니다. 5.2.4 활성 단계에서 이진 영역 마스크 기능 추출 표준화 된 투자 수익을 제한 하려면 이미지에 적용할 ROI 관리자에서 투자 수익을 선택 합니다.
   2. 이진 분수령 마스크에 활성 ROI 선택 "분석 | 분석 입자 ""관리자 추가"기능을 추출 하는 대화 상자에서 선택 합니다.
      참고:이 세분화 ROI 관리자에 동안 delineated 각 구조에 대 한 입자 식별자를 추가 합니다. 옵션 크기 또는 순환 분석에 포함 하는 구조를 수정 하는 데 필요한 경우에 따라 기능을 제외 하려면이 메뉴에서 사용할 수 있습니다.
   3. 클릭 하 여 입자를 저장 "더 | 투자 수익 관리자 메뉴에서 "저장 합니다. 식별자를 선택 하 고 모든 입자 모두 zip 파일에 저장 됩니다 확인 하십시오. [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _ [채널] _ 같은 상세한 이름을 사용 [z-plane(s)] _ [매개 변수가 있는 필터] _ [H_Watershed 매개 변수] _ [구조].

6. 수량, 지역, 그리고 강도 정량화 및 분석

1. 생성 및 저장 단계 4.2에서에서 raw 이미지를 엽니다. 관심의 구조를 캡처하기 위해 사용 되는 채널을 스크롤하십시오.
   참고: 적용 단계 5.1 변경에서 필터 픽셀 값으로 (전처리) 전에 raw 이미지에서 강도 측정 하는 중요 한 이다.
2. 5.3 단계에서 기능 추출에서 얻은 입자 열고 ROI 관리자에서 "모두 보기"를 선택 합니다.
   참고:이 작업 각 입자에는 "ROI 관리자" 이미지에 대 한 개요를 오버레이 및 관심 (그림 1, 기능 추출)의 구조의 가장자리를 일치 해야 합니다.
3. 클릭 하 여 원하는 측정을 설정 "분석 | 설정 측정 ".
   참고: 영역, 강도, 그리고 입자의 밀도 "지역" 및 "통합된 밀도"를 선택 하 여 측정할 수 있습니다. 통합된 밀도 옵션을 선택 하면 피지 두 값을 생산할 예정 이다: 지역 및 평균 회색 값과 '원시 통합 밀도' 픽셀 값의 합으로 측정으로 계산 '밀도 통합'. 입자에 형광 단백질의 밀도 지역으로 나눈 픽셀 값의 합으로 계산 됩니다. 5.3 단계에서 생성 된 입자의 수 ROI 4.4 단계에서 정의 하는 조직 내의 입자의 수량을 나타냅니다.
4. 투자 수익 관리자 메뉴에서 "측정"을 선택 합니다. 결과 측정 이미징 소프트웨어에서 피지에서 파생 된 파일에서 가져옵니다으로 보정 단위로 표현 됩니다. 결과 창에서 결과 복사 하 고 컴파일 및 추가 계산 스프레드시트 소프트웨어에 붙여 넣습니다.

7. 비율 정량화 및 데이터 분석

1. 단계 6.1 및 6.2 입자 식별자의 첫 번째 원시 채널에 여.
2. 클릭 하 여 원하는 측정을 설정 "분석 | 설정 측정 ".
   참고: 입자 당 평균 강도 "의미 회색 값"을 선택 하 여 측정할 수 있습니다.
3. 투자 수익 관리자에서 "측정"을 선택 합니다. 결과 창에서 데이터를 복사 및 붙여넣기 스프레드시트 소프트웨어에.
4. 관심,이 예 (그림 4A), GFP의 두 번째 원시 채널에 "C" 스크롤 막대를 이동 하 고 반복 하는 단계 7.2. 그리고 7.3입니다.
   참고: 입자 저장 단계 5.3에서에서 기본적으로 됩니다 채널 및 생성 된 조각. 주의 입자의 올바른 채널에 적용 됩니다.
5. 스프레드시트 소프트웨어에서 각 입자에 대 한 두 번째의 강도를 하나의 채널에서 휘도의 비율을 계산 합니다.
6. 산 점도 사용 하 여 시각화 하 고 개별 변경 기본 생물학 과정의 반사를 전시 fluorophores에서 비율 계량 데이터를 계량.
   1. 그래프 소프트웨어에서 산 점도 생성 합니다.
      참고: 각 데이터 요소는 관심의 첫 번째 fluorophore의 강도 "x"값 및 두 번째 fluorophore의 강도 각 입자를 측정 하는 "y 값"의 구조를 나타냅니다.
   2. 게이팅 사분면을 정의 하기 위해 각 fluorophore에 대 한 임계값을 설정 합니다.
7. 선 프로 파일을 사용 하 여 관심의 구조에 걸쳐 fluorophore 강도 시각화.
   1. 5.3 단계에서 생성 된 ROI를 선택 하 고 도구 모음에서 직선 도구를 사용 하 여 투자 수익을 통해 직선을 그립니다. 라인 투자 수익 ROI 관리자에 추가 합니다.
   2. 관심, 투자 수익, 라인의 각 채널에 대 한 선택 "분석 | 플롯 프로필 ".
      참고: 플롯 프로필 기능 히스토그램 플롯 및 라인을 따라 강도 값의 테이블을 생성 합니다. 각 채널 및 붙여넣기 스프레드시트 소프트웨어 라인을 따라 두 채널을 보여주는 플롯을 생성 하에 측정 결과 복사 합니다.

결과

번호, 지역, 및 초파리 광 엽에 붙일 태그가 돌연변이 체 Htt 집계의 강렬의 정량화

Huntington의 질병, RFP 태그 돌연변이 초파리 모델의 중앙 신 경계에 misfolded 단백질 집단을 조사 하는 병 적인 비 (UAS-RFP-hHttQ15) 또는 병 적인 확장 ( 인간의 Htt UAS-RFP-hHttQ138) 막 GFP (UAS-mCD8::GFP)¹¹ 팬 신?...

토론

튼튼하게 그리고 reproducibly quantitate 형광 기반 이미징에 의해 시각 세포 생물학 과정을 여기에 설명 된 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 생물 학적 컨텍스트 및 기술적 한계 실험 설계 가이드를 신중 하 게 고려 될 필요가 있다. 관심의 subcellular 구조의 형광 마커 immunohistochemical, 염료 기반, 또는 유전자 표현 배경 형태와 강도 의해 위에 구별 될 필요가 있는지. UAS/GAL4 시스템 널리 초파리

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	PF184250	Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish	Corning	351008	Dissection dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dissection tool
Sodium Chloride	Sigma	S3014	PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	PBS solution
Triton X-100	Sigma	T9284	Washing and antibody incubaton solution.
37% Formaldehyde	VWR	10790-710	Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue)	VWR	89000-022	Fixation, washing, and antibody incubaton.
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm)	VWR	48312-004	Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm)	VWR	48393-172	Slides for confocal imaging
Rubber Cement	Slime	1051-A	Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m)	3M Company	810	Mounting
Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope	AmScope	SM-1BNZ	Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji	NIH	v1.51u	With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope	Olympus
Recombinant Construct	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749