Biologie cellulaire quantitative de neurodégénération chez la drosophile grâce à l’analyse impartiale des protéines fluorescent étiquetées à l’aide de ImageJ

Résumé

Nous avons développé un workflow simple et adaptable pour extraire des données quantitatives d’études biologiques de fluorescence dotés d’imagerie cellulaire d’agrégation des protéines et du flux autophagie dans le système nerveux central de Drosophila modèles de neurodégénérescence.

Résumé

Avec l’augmentation de la prévalence des maladies neurodégénératives, c’est de plus en plus important de comprendre la physiopathologie sous-jacente qui mène à la perte et la dysfonction neuronale. Technologies et outils d’imagerie par fluorescence permettent une analyse inédite des processus neurobiologiques subcellulaires, mais il n’y a toujours un besoin d’approches non biaisées, reproductibles et accessibles permettant d’extraire des données quantifiables des études d’imagerie . Nous avons développé un workflow simple et adaptable pour extraire des données quantitatives de basés sur la fluorescence des études d’imagerie utilisant des modèles de drosophile de la neurodégénérescence. Plus précisément, les auteurs décrivent une approche facile à suivre, semi-automatique à l’aide de Fidji/ImageJ pour analyser deux processus cellulaires : tout d’abord, nous quantifier la teneur totale en protéines et profil dans le lobe optique de drosophile à l’aide de mutant fluorescentes-tag protéines de la huntingtine ; et en second lieu, nous évaluons le flux de l’autophagie-lysosome dans le système visuel de drosophile avec quantification ratiométrique-basé d’un reporter fluorescent en tandem de l’autophagie. Ce qui est important, le protocole décrit ici comprend une étape de segmentation semi-automatique pour s’assurer que toutes les structures fluorescents sont analysées afin de minimiser les biais de sélection et d’augmenter la résolution des comparaisons subtiles. Cette approche peut être étendue pour l’analyse des autres structures biologiques cellulaires et processus impliqués dans la neurodégénérescence, tels que punctums protéiques (granules de stress et complexes synaptiques), compartiments ainsi que membranaires (mitochondries et trafic des vésicules membranaires). Cette méthode fournit un standard, pourtant référence adaptable point pour l’analyse d’images et de la quantification et pourrait faciliter la fiabilité et la reproductibilité dans le champ et finalement renforcer l’interprétation mécaniste de la neurodégénérescence.

Introduction

Maladies neurodégénératives touchent des millions de personnes chaque année et l’incidence augmente avec un vieillissement de la population¹. Alors que chaque maladie neurodégénérative a une étiologie unique, agrégation de protéines mal repliées et ventilation du réseau protéostasie caractérisent commune pathologique d’un grand nombre de ces maladies. Élucider comment les perturbations de ces processus fondamentaux et interdépendants se dérègle pour contribuer à la mort neuronale de la dysfonction et de cellules est essentiel pour comprendre les maladies neurodégénératives, en plus de guider les interventions thérapeutiques. Imagerie par fluorescence permet l’étude de ces processus complexes et dynamiques dans les neurones et a grandement contribué à notre compréhension de la biologie cellulaire neuronale. L’analyse des protéines fluorescent étiquetés est un défi, particulièrement lorsque les expériences sont réalisées in vivo, en raison des tissus hautement compacts, types de diverses cellules et hétérogénéité morphologique. Quantification assistée manuellement est abordable et simple, mais il est souvent fastidieux et sous réserve de partialité humaine. Par conséquent, il y a une nécessité d’approches non biaisées, reproductibles et accessibles permettant d’extraire des données quantifiables des études d’imagerie.

Nous avons esquissé un workflow simple et adaptable à l’aide de Fidji/ImageJ, une image puissante et librement accessible, traitement logiciel^2,3, pour extraire des données quantitatives d’études par imagerie de fluorescence sur des modèles expérimentaux de neurodégénérescence à l’aide de drosophile. En suivant ce protocole afin de quantifier l’agrégation des protéines et du flux autophagique — deux cellules caractéristiques biologiques qui sont très pertinents à la pathologie de la maladie neurodégénérative — nous avons démontré la sensibilité et la reproductibilité de cette démarche. Analyse des protéines fluorescent étiqueté de la huntingtine mutante (Htt) dans le lobe optique de drosophile a révélé le nombre, la taille et l’intensité des agrégats de protéine. Nous avons visualisé un journaliste fluorescent en tandem du flux autophagie dans le système visuel de drosophile , qui affiche des signaux d’émission différentes selon l' environnement compartimenté⁴. Analyse comparative ratiométrique du reporter en tandem permettant une vision quantitative et globale du flux d’autophagie-lysosome de formation de l’autophagosome, la maturation et le transport à la dégradation dans le lysosome et a en outre souligné vulnérables compartiments perturbées dans les maladies neurodégénératives. Ce qui est important, dans les deux analyses, nous avons implémenté seuillage semi-automatisée et étapes de la segmentation dans notre protocole à minimiser le biais inconscient, augmenter la puissance de l’échantillonnage et fournir une norme pour faciliter les comparaisons entre des études similaires. Le flux de travail simple est destiné à rendre puissant plugins de Fidji/ImageJ (développés par des informaticiens basés sur des algorithmes mathématiques) plus accessibles aux neurobiologistes et la communauté des sciences de la vie en général.

Protocole

1. considérations et préparations pour la conception de l’expérience de l’analyse d’Image

1. Prédéterminer cellulaire anatomique, adapté, ou marqueurs subcellulaires pour servir de points de repère pour standardiser une région d’intérêt (ROI) dans les trois échantillons différents, par exemple 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), marqueurs membranaires, fluorescentes localisée protéines, etc.
2. Sélectionnez un marqueur fluorescent qui peut délimiter examen discret au-delà des niveaux de fond pour la structure d’intérêt.
   Remarque : Ce protocole est optimisé pour des structures protéiques (p. ex., agrégats de protéines mal repliées) et organites membranaires (p. ex., reporter de l’autophagie). Pour visualiser l’agrégation des protéines, un fragment de DP-tag N-terminale de la protéine humaine Htt avec une étendue de polyQ pathogènes de 138 répétitions (DP-hHttQ138) a été utilisé⁵. La protéine mutante de Htt forme des agrégats cytoplasmiques lorsqu’elle est exprimée dans les drivers spécifiques neuronales par exemple elav-GAL4^5,6. Afin de visualiser le flux de l’autophagosome-lysosome, Actine-GAL4 a été utilisé de façon ubiquitaire conduire expression du reporter en tandem mCherry-GFP-Atg8a. mCherry séropositifs et GFP examen indiquent des autophagosomes et le flux est surveillé comme fluorescence GFP est piégée dans le milieu acide de le lysosome, où mCherry insensible à l’acide reste jusqu'à ce que la protéine est dégradé⁷. Pour une analyse logométrique, un canal unique qui est un marqueur cohérent de la structure peut être utilisé pour la segmentation, ou le cas échéant, qu'une projection de deux ou plusieurs canaux peut servir à délimiter des structures, bien que non explicitement décrit dans ce protocole. Dans cet exemple, mCherry est utilisé pour la segmentation des particules Atg8-positif, car il est insensible à l’acide et restera dans le compartiment tout au long du flux à travers la voie.
3. Téléchargez et installez la plate-forme open source image analyse ImageJ ou Fidji — la distribution préférée d’ImageJ avec bundled plugins^2,3.
4. Installer le plugin pour bassin hydrographique interactive h-maxima.
   Remarque : Ce protocole utilise des Fidji ; plugins supplémentaires peuvent être nécessaires pour ImageJ. Le plug-in développé par Benoit Lombardot pour EFC-MPI-CBG est disponible en ligne (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
5. Accédez à « aider | Mise à jour », sélectionnez « Sites de mise à jour de gérer » de la « ImageJ Updater », choisissez le site de mise à jour du SCF-MPI-CBG dans la liste et puis fermez et redémarrez Fidji.

2. Dissection et Immunofluorescence souillant le cerveau

1. Faites de silicone plats dissection bordées d’élastomère.
   1. Versez silicone composants élastomères dans un bécher comme indiqué par le fabricant et remuez bien jusqu'à ce que bien mélangé.
   2. Utiliser une pipette pour remplir 5 cm tissu Pétri un tiers à la moitié plein (environ 10 mL de mélange élastomère). Laissez les bulles montent à la surface et retirez doucement avec le papier de soie. Couvrir les plats et les placer sur une surface plane pendant 48 à 72 h à température ambiante (RT).
2. Disséquer la drosophile cerveau et système visuel si nécessaire.
   1. Effectuer la dissection de cerveau de drosophile comme décrit précédemment^8,9. Effectuer la dissection dans les plats de dissection bordées d’élastomère, en utilisant un fond d’élastomère pour stabiliser le cerveau pour éviter d’endommager les tissus ou une pince.
   2. Pour garder la lamina intacte au cours de la dissection, glissez deux pinces sous la rétine et déchirer délicatement au milieu de le œil à supprimer de la rétine. Jeter n’importe quel tissu rétinien, attaché à la lame avec une pince qui s’est tenue parallèlement à la surface du limbe.
      NOTE : Pigment résiduelle se lavent dans les étapes suivantes et habituellement n’interfère pas avec les anticorps de coloration et d’imagerie.
   3. Diluer à 37 % de formaldéhyde en solution saline tamponnée au phosphate (PBS), afin de faire une concentration finale de 3,7 % frais avant de l’utiliser dans un tube de microcentrifuge de 500 µL. Transférer le cerveau disséqué au tube de microcentrifuge avec fix solution et incuber pendant 15 min à ta douce à bascule.
      Remarque : Le formaldéhyde a naturellement tendance à s’oxyder, produisant de l’acide formique. Par conséquent, il est suggéré de formaldéhyde % aliquote du 37 pour stockage et diluer jusqu'à 3,7 % fraîchement avant chaque utilisation. Fixation excessive ou fixation sous affecteront l’intégrité des tissus et la fluorescence¹⁰.
   4. Laver 3 fois avec PBTx (PBS avec 0,4 % Triton X-100) pendant 15 minutes chaque.
3. Effectuer l’immunohistochimie et monter des spécimens.
   1. Si les anticorps est nécessaire, enlever PBTx, ajoutez l’anticorps primaire dilué dans PBTx avec 5 % de sérum de chèvre normal et incuber sur une table de mixage aliquote durant la nuit à 4 ° C.
   2. Enlever l’anticorps primaire et laver 3 fois avec PBTx pendant 15 minutes chaque. Ajoutez l’anticorps secondaire dilué dans PBTx avec 5 % de sérum de chèvre normal et incuber pendant 1 heure à la droite ou pour la nuit à 4 ° C. Laver 3 fois avec PBTx pendant 15 min chacun.
   3. Si la coloration DAPI est nécessaire, enlever PBTx, ajouter la solution au DAPI (solution mère : 5 mg/mL, diluer à une concentration de travail de 15 µg/mL en PBTx) et incuber pendant 10 min à Wash RT. 3 fois avec PBTx pendant 15 minutes chaque.
   4. Pour effacer le tissu, mettre une goutte de milieu de montage au centre d’une lame de microscope avec une cale d’espacement d’une seule couche de ruban adhésif transparent sur les deux côtés. Transférer le cerveau sur la goutte de milieu de montage et attendre 1 à 2 min jusqu'à ce que le cerveau devient transparent. Retirer délicatement le support de montage avec une pipette.
   5. Pour monter, appliquez une goutte de milieu de montage fraîches sur le cerveau sur la diapositive. Le recouvrement soigneusement une lamelle couvre-objet en évitant les bulles. Sceller les bords avec du ciment de caoutchouc et sécher à l’air à ta pendant 20 min. procédez à l’acquisition d’images pour de meilleurs résultats.

3. image Acquisition

1. Optimiser les paramètres d’acquisition microscope, y compris la résolution spatiale, objectif, zoom, vitesse, de balayage et l’étape de taille, afin d’optimiser la résolution des structures d’intérêt pour faciliter la segmentation semi-automatique lors de l’analyse de l’image.
   Remarque : Il peut être utile pour capturer une image de l’échantillon et tester la segmentation semi-automatique (à l’étape 5 du présent protocole) avant de tous les échantillons expérimentaux d’imagerie. De cette façon l’utilisateur peut ajuster les réglages d’imagerie afin que les outils d’analyse peuvent facilement discerner la structure biologique d’intérêt.
2. Ajuster les commandes du détecteur image pour capturer le rapport signal-bruit plus élevé et la gamme dynamique la plus élevée de l’échantillon.
   1. Utilisez une LUT (look up table) qui indique la saturation pixel (exposition trop élevée) ou une sous-saturation (décalage trop bas) tout en ajustant les paramètres (Figure 3 b, rouge indique la saturation pixel par une LUT Hi/Low).
   2. Vérifiez les réglages de gain et offset sont appropriés pour tous les groupes expérimentaux, comme les manipulations expérimentales susceptibles de modifient la structure d’intérêt.
      Remarque : Il est impératif que les mêmes paramètres sont utilisés pour tous les groupes de faire des comparaisons quantitatives.
3. Image à travers le tissu pour capturer toutes les données.
   Remarque : Il est recommandé de capturer toutes les données disponibles au cours d’une séance d’imagerie et pour définir une zone plus précise pendant la sélection du ROI à l’étape 4, si nécessaire.
4. Enregistrer l’image sous le type de fichier pris en charge par le logiciel d’imagerie afin de préserver les métadonnées telles que des paramètres d’acquisition et de calibration spatiale. Enregistrer l’image avec un nom de fichier, y compris expérimentaux anticorps date, fond génétique et des reporters fluorescents, ou colorants correspondant aux canaux numérisés tels que [nom du groupe expérimental] _ [nom du modèle] _ [expérience date] _Ch1. [Fluorophore-cible /Dye]_Ch2.[fluorophore-Target/Dye], etc.

4. Fidji/ImageJ Image importation et sélection de ROI

1. Ouvrez une image dans les îles Fidji. Utilisez la boîte de dialogue « Options d’importation de Bio-Formats », choisissez « pile vue avec : Hyperstack » et « mode couleur : en niveaux de gris ».
   Remarque : Il est recommandé d’ouvrir le type de fichier de microscope, sous forme de métadonnées telles que calibration spatiale peut être lu par les Fidji.
2. Identifier un domaine d’un seul plan z ou une projection fondée sur les canaux de marqueur qui peuvent être utilisés comme un ROI normalisé dans l’ensemble de spécimens (Figure 1, sélection de retour sur investissement).
   1. Utilisez la barre de défilement « C » pour afficher l’ou les canaux utilisé pour capturer le marqueur désigné à l’étape 1.1.
   2. Utilisez la barre de défilement « Z » pour parcourir les plans focaux. Choisir une tranche unique ou créer une projection de plusieurs sections en cliquant sur « Image | Piles | Projet de Z » et set « tranche de démarrage » et « Arrêt de tranche » pour englober le retour sur investissement.
      Remarque : Définition du type de " "Projection » à « Max intensité » dans le projet « Z » boîte de dialogue est souvent mieux adapté pour mettre en évidence des structures de segmentation dans la Section 5, si ce n’est peut-être pas approprié pour toutes les applications. Si un autre type de projection est requis pour l’analyse, prendre soin de sauvegarder et de documenter ce fichier en tant que tel pour l’extraction de caractéristiques dans l’article 6 et/ou 7.
   3. Générer une nouvelle image contenant l’ou les canaux et focal plane(s) d’intérêt afin de simplifier les étapes suivantes dans le protocole de l’analyse d’image. Sélectionnez « Image | Duplicate », établissez les désiré « Channels » (c) et les « Tranches » (z) et changer le nom du fichier pour refléter la sélection (par exemple, [nom du groupe expérimental] _ [nom du modèle] _ [date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]) l’expérience.
3. Utilisez un des « outils de sélection » dans la barre d’outils de Fidji de sélectionner manuellement un retour sur investissement standardisé selon les critères de sélection à l’étape 4.2.
4. Ajouter le retour sur investissement au gestionnaire du ROI en cliquant sur « Analyze | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement » et cliquez sur « Ajouter » dans le menu Gestionnaire de ROI. Enregistrer le retour sur investissement ROI Manager dans le menu en cliquant sur « plus | Enregistrer » et puis nommez le fichier afin de refléter le retour sur investissement (p. ex., [nom du groupe expérimental] [nom du spécimen] [date de l’expérience] _ [canaux] _ [z-plane(s)] _ [ROI description]).
   Remarque : Ceci peut être rouvert aux Fidji pour analyses à venir ou peut être appliqué à d’autres canaux ou les images comme dans l’article 5.3.

5. prétraitement et Segmentation avec h-maxima Watershedding

1. Effectuer le prétraitement au canal servant à capturer les structures d’intérêt.
   1. Si le fichier image se compose de plusieurs canaux, séparer les canaux en cliquant sur « Image | Couleur | Fractionner des chaînes » d’isoler le canal d’intérêt.
   2. Appliquer un filtre comme un filtre médian pour réduire le bruit ou le flou gaussien pour lisser en cliquant sur « processus | Les filtres | Filtre type » (par exemple, « Filtre médian » ou « Flou gaussien »).
      1. Goûtez les différents filtres et filtrer les paramètres sur les images de chaque groupe expérimental. Procéder par étape 6.2 avec un exemple représentatif de chaque groupe afin de vérifier les performances de la segmentation. Sélectionnez le filtre et les paramètres qui facilitent la segmentation des structures d’intérêt.
   3. Enregistrer les paramètres et le filtre. Appliquez ces paramètres sur des groupes expérimentaux.
   4. Enregistrez une copie de l’image au format tiff y compris le filtre appliqué pour référence. Utilisez un nom détaillé tels que [nom du groupe expérimental] [nom du spécimen] [date de l’expérience] _ [canal] _ [z-plane(s)] _ [filtre avec les paramètres].
2. Effectuer la segmentation des structures d’intérêt avec l’outil de bassin hydrographique interactive h-maxima sur l’image prétraitée généré et enregistré à l’étape 5.1.
   1. Avec l’image prétraitée active dans les îles Fidji, lancer l’outil de bassin hydrographique interactive h-maxima en cliquant sur « EFC | L’étiquetage | H_Watershed interactive ».
      NOTE : Ce plugin calcule d’abord le bassin et puis permet à l’utilisateur d’explorer les effets des maxima locaux et des options de seuil sur la segmentation par une image de sortie mise à jour instantanée.
   2. Dans le panneau de contrôle, régler les semences dynamique (h), seuil d’intensité (T) et le pic des inondations (%) afin d’optimiser la segmentation.
      Remarque : Se référer toujours à l’image raw avant de prétraitement de la Section 4.2 pour inspecter manuellement les performances de segmentation des structures d’intérêt.
   3. Lorsque vous êtes satisfait des résultats de segmentation, sélectionnez « Exporter les masque de régions » et choisissez « Exporter ». Cela va générer une image binaire des résultats du bassin versant (Figure 1, Segmentation).
   4. On enregistre les paramètres de segmentation ; ces paramètres doivent être appliqués dans l’ensemble des groupes expérimentaux pour des comparaisons quantitatives. Enregistrer le masque binaire des résultats si vous le souhaitez pour toute consultation avec les paramètres de segmentation détaillés dans le nom tel que [nom du groupe expérimental] [nom du spécimen] [date de l’expérience] _ [canaux] _ [z-plane(s)] _ [filtre avec les paramètres] _ [H_Watershed paramètres].
3. Extrait les structures d’intérêt des résultats du bassin hydrographique.
   1. Ouvrez le ROI sauvé de 4,4 étape, dans le gestionnaire de ROI. Avec le masque binaire de régions de l’étape 5.2.4 actif, sélectionnez le retour sur investissement dans le gestionnaire de ROI à appliquer à l’image de limiter l’extraction de caractéristiques pour le retour sur investissement standardisé.
   2. Avec le retour sur investissement est active sur le masque binaire de bassin hydrographique, choisissez « Analyze | Analyser les particules » avec « Ajouter à Manager » sélectionné dans la boîte de dialogue pour extraire des caractéristiques.
      Remarque : Cela va ajouter un identificateur de particules pour chaque structure délimitée au cours de la segmentation au gestionnaire de ROI. Options sont disponibles dans ce menu pour exclure les fonctionnalités basées sur la taille ou la circularité si nécessaire d’affiner les structures incluses dans l’analyse.
   3. Enregistrez les particules en cliquant sur « plus | Enregistrer » dans le menu Gestionnaire de ROI. Veiller à ce que les identificateurs sont désélectionnés et toutes les particules seront tous enregistrés dans un fichier zip. Utilisez un nom détaillé tels que [nom du groupe expérimental] [nom du spécimen] [date de l’expérience] _ [canaux] _ [z-plane(s)] [filtre avec les paramètres] [paramètres H_Watershed] _ [structures].

6. quantité, zone et intensité Quantification et analyse

1. Ouvrez l’image raw généré et enregistré à l’étape 4.2. Mettez en surbrillance le canal utilisé pour capturer les structures d’intérêt.
   Remarque : Il est essentiel de prendre des mesures d’intensité de l’image brute (avant le prétraitement) en appliquant des filtres en changements incrémentiels 5.1 les valeurs des pixels.
2. Ouvrez les particules provenant d’extraction de caractéristiques à l’étape 5.3 et sélectionnez « Afficher tout » dans le gestionnaire de ROI.
   NOTE : Cette action se superposeront un aperçu de chaque particule sur le « ROI Manager » sur l’image et doit correspondre les bords des structures d’intérêt (Figure 1, extraction de caractéristiques).
3. Définir les mesures souhaitées en cliquant sur « Analyze | Définir des mesures ».
   Remarque : La zone, l’intensité et la densité des particules peuvent être mesurées en choisissant « zone » et « densité intégrée ». Lorsque la densité intégrée est activée, Fidji va produire deux valeurs : « Intégrés de densité » calculé comme le produit de la région et valeur de gris moyen et « Raw intégré densité » calculée comme la somme des valeurs des pixels. Densité de la protéine fluorescente dans les particules est calculée comme la somme des valeurs des pixels divisée par la superficie. Le nombre de particules généré à l’étape 5.3 indique la quantité de particules à l’intérieur du tissu que roi définie à l’étape 4.4.
4. Dans le menu Gestionnaire de ROI, choisissez « Mesure ». Les résultats sont exprimés en unités calibrées aussi longtemps que les mesures sont tirées des fichiers dérivés dans les îles Fidji le logiciel d’imagerie. Copier les résultats dans la fenêtre de résultats et coller dans le logiciel de feuille de calcul pour la compilation et autres calculs.

7. ratiométrique Quantification et analyse des données

1. Suivez les étapes 6.1 et 6.2 pour ouvrir les identificateurs de particules sur la première chaîne brute d’intérêt.
2. Définir les mesures souhaitées en cliquant sur « Analyze | Définir des mesures ».
   Remarque : L’intensité moyenne par particule peut être mesurée en choisissant « Signifie valeur de gris ».
3. Dans le gestionnaire de ROI sélectionnez « Mesure ». Copier les données de la fenêtre de résultats et collez dans le tableur.
4. Déplacer la barre de défilement « C » à la deuxième chaîne brute d’intérêt, GFP dans cet exemple (Figure 4 a) et répétez les étapes 7.2. et 7.3.
   Remarque : Les particules enregistrés à l’étape 5.3 utilise par défaut le canal et la tranche d'où il provenait. Prendre soin de s’assurer que les particules sont appliqués à la bonne chaîne d’intérêt.
5. Calculer le ratio de l’intensité d’un canal à l’intensité de la seconde pour chaque particule dans le logiciel de feuille de calcul.
6. Un diagramme de dispersion permet de visualiser et de quantifier les données ratiométrique de fluorophores qui présentent des modifications individuelles de processus biologiques sous-jacents.
   1. Générer un diagramme de dispersion dans le logiciel graphique.
      Remarque : Chaque point de données représente une structure d’intérêt où l’intensité du fluorophore première d’intérêt est la valeur « x » et l’intensité du second fluorophore est la valeur « y » mesurée de chaque particule.
   2. La valeur gating seuils pour chaque fluorophore définir les quadrants.
7. Profil de ligne permet de visualiser l’intensité fluorophore à travers une structure d’intérêt.
   1. Sélectionnez un retour sur investissement généré à l’étape 5.3 et utiliser l’outil ligne droite sur la barre d’outils pour dessiner une ligne droite par le ROI. Ajoutez la ligne ROI au ROI gestionnaire.
   2. Pour chaque canal d’intérêt, avec la ligne de retour sur investissement actif, sélectionnez « Analyze | Tracer le profil ».
      Remarque : La fonction de profil de terrain va générer une parcelle de l’histogramme et une table des valeurs de l’intensité le long de la ligne. Copiez les résultats mesurés sur chaque canal et le coller dans le logiciel de tableur pour générer un diagrammes montrant les deux canaux le long de la ligne.

Résultats

Quantification du nombre, espace et intensité des agrégats de Htt mutants fluorescent étiquetés dans le lobe optique de drosophile

Pour étudier l’agrégation des protéines mal repliées dans le système nerveux central d’un modèle drosophile de la maladie de Huntington, DP-tag mutant Htt humaine avec un non pathologiques (SAMU-DP-hHttQ15) ou l’expansion pathologique ( UAS-RFP-hHttQ138

Discussion

Le protocole décrit ici peut servir à solidement et de façon reproductible quantifier les processus biologiques cellulaires visualisées par l’imagerie par fluorescence. Contexte biologique et limitations techniques doivent être examinés attentivement pour guider la conception expérimentale. Marqueurs fluorescents des structures subcellulaires d’intérêt, si immunohistochimiques, teintée ou génétiquement ils sont exprimés, doivent être distinguables au-dessus de fond par la morphologie et l’intensité. ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	PF184250	Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish	Corning	351008	Dissection dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dissection tool
Sodium Chloride	Sigma	S3014	PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	PBS solution
Triton X-100	Sigma	T9284	Washing and antibody incubaton solution.
37% Formaldehyde	VWR	10790-710	Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue)	VWR	89000-022	Fixation, washing, and antibody incubaton.
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm)	VWR	48312-004	Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm)	VWR	48393-172	Slides for confocal imaging
Rubber Cement	Slime	1051-A	Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m)	3M Company	810	Mounting
Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope	AmScope	SM-1BNZ	Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji	NIH	v1.51u	With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope	Olympus
Recombinant Construct	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749